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신경섬유종증
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신경섬유종증
신경섬유종증 제
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-국문요약-신경섬유종증
신경섬유종증
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규명
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다기관의 신경계에 다발적으로 종양을 형성하는 신경섬유종증 제1형 (neurofibromatosis type1, NF1)은 3-4천명에 1명 정도의 발병률을 나타내는 우성유전질환이다. NF1은 종양억제유전자인 NF1 유전자의 돌연변이에 의해 그 유전자 산물인 뉴로파이브로민의 양적, 기능적 결핍에 의해, 세포의 증식, 분화, 사멸 등에 관여하는 Ras 단백질이 과잉 활성화됨으로써 발병하게 된다. NF1은 다양한 임상증상을 나타내며 환자의 약 10%에서 나타나는 악성종양으로의 진행 은 예측이 불가능하고 그 원인이 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 본 연구는, NF1환자의 조직에서 분리, 배양한 정상표현형세포, 양성종양세포, 악성종양세포의 세포생물학적 특성을 비교, 분석함으로써 NF1 환자의 악성화 기 전 규명을 목표로 하였다. 우선, 이들 세 가지 종류의 세포에서 K-, H-, N-Ras 에 대한 발현량 및 활성화를 조사한 결과, 악성세포로 갈수록 H- 와 K-Ras의 발현량 및 활성화가 증가되었다. 또한, Ras pathway 및 세포자멸사(apoptosis) 에 관련된 단백질의 발현량을 분석한 결과, ERK의 활성화 형인 p-ERK와 세포자 멸사 억제 Bcl-2 family 단백질인 Bcl-xL의 발현량이 악성종양세포로 갈수록 증 가되어 있었다. 다음으로, NF1의 악성화 원인으로 알려진 TP53 유전자와 RAS 유전자의 돌연변이분석결과 돌연변이는 확인되지 않았다. Neurofibromin과 함께 세포내 Ras pathway를 조절하는 GTPase-activating protein(GAP)인 p120RasGAP의 발현량을 확인해 본 결과 흥미롭게도 정상표현형세포에서 악성p120RasGAP을 코드하는 유전자인 RASA1의 발현이 down-regulation된 NF1 악성세포에 RASA1을 인위적으로 과발현 시킨 결과, H-와 K-Ras의 발현과 Ras downstream에 있는 p-ERK의 발현이 크게 감소되는 것을 확인하였다. 또 한, RASA1의 과발현이 caspase3 의 활성화를 통한 세포자멸사를 유도한다는 사실을 Western-blot 해석과와 형광현미경 분석을 통해 확인하였다. 이러한 결 과는 RASA1 유전자가 NF1의 악성화에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 시사한
다. RASA1의 발현이 정상표현형세포에서 악성종양세포로 갈수록
down-regulation된 현상의 원인을 밝히기 위해, RASA1 유전자의 promoter 에 서 CpG island region으로 추정되는 영역에 대한 methylation test를 실시하였 으나 methylation은 확인 할 수 없었다.
본 연구결과는 NF1의 악성화 기전의 규명에 주요한 기초 자료를 제공할 뿐만 아니라, RASA1 유전자를 응용한 NF1의 치료법 개발에도 크게 기여할 것으로 기대된다.
핵심어: 신경섬유종증, 세포자멸사, 뉴로파이브로민, GTPase activating protein(GAP), p120RasGAP, Ras, RASA1
차
차
차
차 례
례
례
례
국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅲ 그림차례 ··· ⅴ 표 차례 ··· ⅵ Ⅰ. 서론 ··· 1 Ⅱ. 재료 및 방법 ··· 11 A. Tissue sample ··· 11 B. Cell culture ··· 11 C. Mutation analysis ··· 11D. DNA extraction, Bisulfite modification and Methylation specific PCR 12 E. Total RNA extraction and cDNA synthesis ··· 13
F. RT-PCR ··· 14
G. Western blotting ··· 14
H. Ras activation assay ··· 15
I. H202 treatment ··· 15 J. 유전자의 과발현을 위한 construct 구축 ··· 16 K. Transfection ··· 17 L. Fluorescence microscooy ··· 17 Ⅲ. 결과 A. NF1 환자의 검체로부터 조직절편과 세포배양 ··· 18
B. NF1 환자에서의 K-Ras mutation 분석 ··· 20
C. RASA1 mRNA와 단백질 발현양 평가 ··· 21
D. NF1환자 세포에서의 단백질 발현 양상 분석 ··· 21
E. Ras activation assay ··· 24
F. H202 Treatment Test ··· 25
G. 악성세포에서 down-regulation된 RASA1의 over-expression ··· 26
H. RASA1 expression에 의한 세포형태 변화 ··· 28 I. Methylation specific PCR (MSP) ··· 30 Ⅳ. 고찰 ··· 31 Ⅴ. 결론 ··· 34 참고문헌 ··· 35 ABSTRACT ··· 38
그림
그림
그림
그림 차례
차례
차례
차례
Fig. 1. The various phenotypes of neurofibromatosis type 1 ··· 5
Fig. 2. Ras pathway and the function of GAPs in Ras signaling ··· 7
Fig. 3. Sequence similarity among Ras-GAP protein ··· 7
Fig. 4. A diagram of malignant degeneration pathway of NF1 ··· 4
Fig. 5. Characterization of the RasGAP cleavage sites and apoptotic model of RasGAP cleavage fragments ··· 10
Fig. 6. NF1 tissue and cell type ··· 18
Fig. 7. NF1 gene mutation detected in a NF1 patient ··· 19
Fig. 8. RT-PCR of RASA1 and Western blot analysis of p120RasGAP in NF1 primary cells ··· 21
Fig. 9. Western blot analysis of Ras (N-, H-, K-Ras) and ERK proteins in NF1 primary cells ··· 22
Fig. 10. Ras activation assay in NF1 primary cells ··· 24
Fig. 11. H2O2 Treatment test in NF1 primary cells ··· 25
Fig. 12. RASA1 gene engineering ··· 26
Fig. 13. Over-expression of RASA1 in NF1 malignant cell ··· 27
Fig. 14. Fluorescence microscopic analysis of RASA1 expressing NF1 cells ··· 29
표
표
표
표 차례
차례
차례
차례
Table 1. Ras mutations detected in Human Tumors ··· 8 Table 2. Primer sequences for K-Ras mutation analysis ··· 12 Table 3. Summary of clinical features and genotypic characteristics
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
.
.서
서
서 론
론
론
신경섬유종증 제1형(Neurofibromatosis Type1,NF1)은 1882년 Fredrich von
Recklin-ghausen이 처음 기술하였으며,말초신경을 따라 종양을 형성하는 상염색체
우성 유전 질환으로 약 3500명중 1명꼴로 발생한다.종양은 신경의 있는 신체 어느 부위에나 발생할 수 있고,그 수가 한 개 이상으로 생기는 다발성이기 때문에뺳 신경섬유종증’이라고 한다(Fig.1)(Cichowski와 Jacks,2001;Gutmann,2001).주된 증상
은 신경이 있는 곳이면 어디서나 발생하는 신경섬유종(neurofibroma)과 밀크 커피
색 반점(cafe-au-lait spots),홍채결절(Lisch nodules),시신경교종(optic pathway glioma), 척추측만(scoliosis), 경골형성이상(tibial dysplasia), 총상신경섬유종 (plexiform neurofibroma),교뇌신경교종(pontineglioma)등이 있다(Yohay,2006; BaderJL,1986).
신경섬유종증의 아형인 plexiform neurofibroma는 뼈와 주위 조직의 성장을 자 극하여 거대한 크기로 자라나 추형의 외모를 나타내기도 하며,이 환자의 약 10%는 malignantperipheralnervesheath tumors(MPNSTs)로 변형된다(Evans 등,2002;Rasmussen 등,2001;Zoller등,1997).MPNST는 고도로 악성화 된 전이 암으로 높은 사망률과 화학요법과 방사능에 낮은 반응을 보이는 것으로 알 려져 있다.
NF1은 NF1유전자의 돌연변이에 의해 발병하며,환자의 약 50%는 유전이 아
닌 자연발생적인 돌연변이에 의해 발생한다(Huson등,1988;Ferner,2007).NF1
은 염색체의 17q11.2에 위치하며,350kb의 genomicDNA,60개의 exon으로 구
성되어 있고, mRNA는 11～13 Kb정도이다.NF1은 종양억제유전자(tumor
을 암호화하고 있다(Cawthon 등,1990;Wallace 등,1990;Legius 등,1993). Neurofibromin의 아미노산 1125-1537부위에 Ras 신호를 negatively하게 조절하 는 GAP-related domain (GRD) 영역이 있다.(Karen와 Tyler, 2001) GTPase-activating protein(GAP)은 Ras의 intrinsicGTPase를 자극하여 활성화 형태인 Ras-GTP에서 Ras-GDP 불활성화 형태로 전환시킴으로써 Ras의 활성을 조절한다(Karen와 Tyler,2001).
종양유전자(oncogene)인 Ras에 의해 coding 되는 Ras단백질은 신경능선
세포와 내피세포 모두에서 발현하고 세포의 증식,분화,사멸 등에 관여한다. Ras유전자는 크게 K-Ras,H-Ras,N-Ras의 3종류가 있으며 사람에게 발 생하는 약 50% 암에서 Ras유전자의 돌연변이가 발견된다(Table1).특히 췌장, 대장암,폐암 등에서 K-Ras의 돌연변이가 가장 많이 발견된다.Ras유전자의 돌 연변이와 Ras단백질의 과잉된 활성은 세포의 암화에 관여하기 때문에 Ras단백질의 세포내 발현억제를 통한 암 치료에 대한 연구가 활발히 진행 되고 있다(Gideon등,
1992; Duursma와 Agami, 2003).NF1 유전자의 돌연변이에 의해 K-Ras,
H-Ras,N-Ras의 3종류 Ras 단백질 모두가 과잉 활성화 된다고 알려져 왔으나, 최근의 연구에서 NF1환자의 별아교세포(astrocytes)의 경우 H-Ras와 N-Ras의 활 성화는 보이지 않고 K-Ras만이 특이적으로 활성화 되고,조혈세포의 경우는 H-Ras만이 활성화 된다는 사실이 보고되었다(Dasgupta등,2005). 현재 NF1에 대한 국내․외에서 진행되는 주된 연구는 환자의 DNA로부터 NF1유전자의 돌연변이 부위와 염기배열을 밝히는 것이 주류를 이루고 있고,질 환치료를 궁극적인 목표로 하는 연구는 거의 진행되고 있지 않으며,환자에서 유 전형과 임상증상에 상호관계가 없다는 사실로부터 NF1유전자 이외의 신경섬유 종증 제1형의 발병에 관련된 유전자의 존재를 밝히는 연구 등이 진행되고 있다.
최근 수식유전자의 존재 가능성에대한 보고는 있으나(Wiest등,2003;Holtkamp 등,2004),NF1의 임상적 표현형의 다양성과 악성화 과정에 대한 정확한 기전은 여전히 밝혀지지 않았다.신경섬유종증 제1형의 양성종양 발생은 NF1유전자의 돌연변이가 필수적이나,양성종양의 악성섬유육종(neurofibrosarcoma)으로의 변 화 등,계속되는 이차적 악성변화에는 충분하지가 않다.악성신경섬유육종의 형 성은 다른 악성종양과 같이 다양한 종양형성기전이 관여 할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 NF1의 종양형성 기전규명 연구를 통해 NF1치료방법의 가능성 제시를 목표로 하였다.악성종양으로 발전한 22세의 남자 NF1환자에게서 정상 표현형세포,양성종양세포,악성종양세포를 순수 분리 배양하여 NF1에 대한 분 자유전학적 분석을 실시하였다.NF1유전자의 mutation분석 결과,NF1유전
자 exon37에서 c.6792C>G로 인한 아미노산이 Y2264X 바뀌는 nonsensemutation이
발견되었고,그 결과 neurofibromin의 결핍에 따른 Ras단백질의 과잉 활성을 확인
하였다.세 가지 종류의 세포에서 K-,H-,N-Ras에 대한 발현량 및 활성화를 조사한 결과,악성세포로 갈수록 H- 와 K-Ras의 발현량 및 활성화가 증가되어
있었다.악성섬유육종의 형성에 관련이 있는 TP53(Menon 등,1990)과 Ras유전
자의 돌연변이 분석을 시행하였으나 발견되지 않았다.악성종양세포 갈수록
Neurofibromin과 함께 세포내 Raspathway를 조절하는 p120RasGAP의 발현량 이 감소하는 것을 관찰하였고 이에 대해 RASA1의 mutationhotspot으로 알려진 exon1,10,11.12,17에 대한 mutation분석결과 mutation은 발견되지 않았다.RASA1 유전자는 염색체 5q13.3에 위치하고 3143bp의 CDS와 25exon이 120kDa 의 p120RasGAP을 암호화 하고 있다. p120RasGAP은 Neurofibromin과 함께 세포내 Ras pathway를 조절하는 GTPase-activating protein(GAP)으로 모든 세포에서 발현하는 세포질 단백질이다.GAP은 초기배아의 발달에 필수적이며(Mark 등,
1995), mild한 세포내 환경에서는 anti-apoptotic protein으로 작용하며 cell protection의 역할을 수행하다가 세포내 caspase3 and/or 9 이 활성화 되면 caspase의 기질이 되어 절단되고 그 결과 생성된 p120RasGAP의 fragments는 강한 apoptotic protein으로 작용한다(Jiang와 Christian,2001).p120RasGAP은 PDGFR를 포함한 receptor들과 tyrosine kinase(Andre와 Jeffrey,2005)그리고 Akt(Yingzi 등, 2004)의 activation을 조절함으로써 Ras signal pathway의 upstream과 downstream에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다.이 환자의 경우 악성종양으로 발전하는데 있어 이러한 p120RasGAP의 down-regulation이 중요한 요인이라고 추측되어 정상표현형세포에서 악성세포로 갈수록 p120RasGAP이 down-regulation된 원인과 악성세포에서 p120RasGAP의 영향에 초점을 맞추어 연구를 진행하였다.
본 연구에서는 p120RasGAP을 coding하는 RASA1유전자의 promotor영역에 서 처음으로 발견한 CpG islandregion의 methylationtest를 통해 정상표현형세 포에서 악성세포로 갈수록 down-regulation된 현상의 원인을 분석하였고, RASA1을 악성세포에서 과발현(over-expression) 시킨 후 세포내 여러 가지 signal을 관찰,비교하여 정상표현형세포로의 reverse를 확인함으로써 NF1의 악 성화 기전 규명을 위한 분자유전학적 연구를 수행하였다.
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FFiiiggg... 111.. T. TThhheee vvvaaarrriiiooouuusss ppphhheeennnoootttyyypppeeesss ooofff nnneeeuuurrrooofffiiibbbrrrooommmaaatttooosssiiisss tttyyypppeee 111... A, Cafe-au-lait spot; B, Nerofibroma; C, Lisch nodules; D, Optic pathway glioma; E, Scoliosis; F, Tibial dysplasia; G, Plexiform neurofibroma; H, Pontineglioma.
AAA...
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FFiiiggg...222..R.RRaaasss pppaaattthhhwwwaaayyy aaannndd tdtthhheee fffuuunnncctcttiiiooonnn oooffGfGGAAAPPPsss iiinnn RRRaaasss sssiiigggnnanaallliiinnnggg...A. SimplifiedversionoftheRaspathway.B.GAPs(GTPaseActivating Protein) such as neurofibromin and p120RasGAP inactivates Ras by catalyzing the hydrolysis ofRas-GTP to Ras-GDP.GNEFs (Guanine Nucleotide Exchange Factors)activateRasbypotentiatingtheexchangeofGDP forGTP.
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FFiiiggg...333...SSSeeeqqquuueeenncncceee sssiiimmmiiilllaaarrriiittytyy bbbeeetttwwweeeeeennn RRRaaasss---GGGAAAPPP ppprrrooottteeeiiinnn...Neurofibromine sharesaregionsofsimilaritywiththecatalyticdomainofthep120RasGAP.
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TTaaabbblllee1e11...RRRaaasssmmmuuutttaaatttiiiooonnnsssdddeeettteeecccttteededdiiinnnHHHuumummaaannnTTTuumummooorrrsss...
Cancerorsiteortumor Mutation
frequency,%
Predominant Rasisoform* Non-small-cell-lungcancer
(adenocarcinoma) 33 K
Colorectal 44 K
Pancreas 90 K
Thyroid
Follicular 53 H,K,N
Undifferentiatedpapillary 60 H,K,N
Papillary 0 Seminoma 43 K,N Melanoma 13 H Bladder 10 H Liver 30 N Kidney 10 H
Myelodysplasticsyndrome 40 N,K
Acutemylogenousleukemia 30 N
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FFiiiggg...444...AA dA ddiiiaaagggrrraaamm om oofffmmmaaallliiigggnnnaaannntttdddeeegggeeennneeerrraaatttiiioononnpppaaattthhhwwwaaayyyooofffNNNFFF111(((DDDaaasssggguuuppptttaaa e
eetttaaalll...,,,222000000333)))... NF1lossin Schwann cellprecursorsduring development-in cooperation withNF1+/-fibroblasts,perineuralcells,and mastcellsresultin
plexiform neurofibroma formation. The accumulation of other genetic change(e.g.p53,p16,or p27 loss) promotes transformation into MPNSTs. NF1lossinSchwanncellsincooperationwithNF1+/-cellsresultsindermal
neurofibromaformation.
B.
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FFiiiggg...555...CCChhhaaarrraaacccttteeerririizzzaaatttiiiooonnn ooofff ttthhheee RRRaaasssGGGAAAPPP cccllleeeaaavvvaaagggeee sssiiitetteesss aaannnddd aaapppoooppptttoootttiiiccc m
mmooodddeeelll ooofff RRRaaasssGGGAAAPPP cccllleeeaaavvvaaagggeee fffrrraaagggmmmeeennntttsss...A.Schematic representation of RasGAP cleavage by caspases.SH,Src homology domain;PH,pleckstrin homology domain; PPPP, proline-rich region; C2, calcium-dependent phospholipid binding domain. B.Modelof the roles of RasGAP caspase cleavagefragmentsintheregulationofapoptosis.
Ⅱ
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Ⅱ.
.
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방법
법
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A AA...TTTiiissssssuuueeesssaaammmpppllleee 2004년 12월 아주대학교병원을 내원하여 신경섬유종증 제1형(Neurofibromatosistype1,NF1)으로 외과수술을 받은 22세 남자 환자의 종양 적출물로부터 3가지 종류의 조직을 획득하였으며,각 조직은 포르말린 고정 후, 파라핀으로 포매하여 조직절편슬라이드를 제작,Hematoxylin & Eosin 염색하여
현미경(400×)으로 관찰하여,정상,양성,악성조직임을 확인하였다(Fig.4).
B
BB...CCCeeellllllccucuullltttuuurrreee
환자의 조직으로부터 정상(normalskin),양성종양(benign tumor),악성종양
(malignanttumor)조직으로부터 explant방법을 이용하여 fibroblasts를 분리하여, 1% antibiotics(Gibco BRL, U.S.A.), 15% FBS(Hyclone Laboratories INC., U.S.A.)를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(Hyclone Laboratories INC,U.S.A.)에 배양하였다.
C
CC...MMMuuutttaaatttiiiooonnnaanannaaalllysyyssiiisss
NF1 환자의 정상,양성,악성 조직으로부터 배양된 세포로부터 DNA mini-kit
(Qiagen Inc,CA,USA)를 이용하여 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다.추출한
gDNA를 K-RAS에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 하였다.PCR 반응 조건
은 다음과 같다.gDNA를 500 ng을 template로 하여 LA Taq polymerase
(TakaraBioInc.,Otsu,Shiga,Japan)를 첨가하여 95℃에서 2분 30초로 1cycle을
여 유전자를 증폭했다.증폭한 유전자를 전기영동으로 확인 후 정확한 염기서
열을 확인하기 위해 sequencing하였다.
T
TTaaabbbllleee222...PPPrrriiimmmeeerrrssseeeqqquuueeennnccceeesssfffooorrrKKK---RRRaaasssmmmuuutttaaatttiiiooonnnaaannnaaalllyyysssiiisss...
K-Ras
exon1 RF CGCCATTTCGGACTGGGAGCGGGACCCCTAATTCATTCACTCG exon2
F GCCTGCTGAAAATGACTGAA
TATAAAC
R ACCTCTATTGTTGGATCATA
TTCGTC
exon3 RF GATTCCTACAGGAAGCAAGT AGTACACCTATAATGGTGAATATC TTCAAATG
exon4 F CCCAGAGAACAAATTAAAAGAGTTAAGG
R CTTACCTGTCTTGTCTTTGC TG
A-exon5 RF CAATGCAGAGAGTGGAGGAT GCCCTTGTTACCTTTAAAAGAC ATCTGC
B-exon5 RF CAGGGTGTTGATGATGCCTT CCCACTTGTACTAGTATGCCT TAAG
D
DD...DDDNNNAAA eeexxxtttrrraaaccctttiiiooonnn,,,BBBiiisssuuulllfffiiittteeemmmooodddiiifffiiicccaaatttiiiooonnn aaannnddMdMMeeettthhhyyylllaaatttiiiooonnn ssspppeeeccciiifffiiicccPPPCCCRRR (
((MMMSSSPPP)))
정상표현형세포에서 악성종양세포로 갈수록 발현량이 감소하는 RASA1유전자
promotor내 CpG island region의 메틸화 유무를 확인하기 위해 Methylation specificPCR(MSP)을 시행하였다.Normalskin,benigntumor,malignanttumor
tissue에서 분리․배양한 세포로부터 Genomic DNA을 추출(Qiagen Inc,CA,
Methylation Kit, Zymo Research)을 시행한 후 Purification을 하였다. Modification된 DNA는 Methylationspecificprimer를 이용하여 95℃ 20초,60℃ 30초,72℃ 30초에서 40cycle의 MethylationspecificPCR을 시행하였다.증폭된 PCR 산물은 3% agarosegel에 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 transiluminator 로 확인 후 해당유전자의 증폭된 부분을 gelextraction(Geneallbiotechnology, Korea)으로 추출한 후 sequencing으로 methylation 유무를 확인하였다.MSP에
사용된 primersequence는 다음과 같다.
Methylated
primer F,R,5´-TCGGTTACGTTAATAGGAGATGC -3´5´-ACAACTTATACGCAAACGCGT-3´ Unmethylated
primer F,R,5'-GTTGGTTATGTTAATAGGAGATGTGG-3'5'-AAAAACAACTTATACACAAACACATT-3'
E
EE...TTToootttaaalllRRRNNNAAA eeexxxtttrrraaaccctttiiiooonnnaaannndddcccDDDNNNAAA sssyyynnnttthhheeesssiiisss
Normalskin,benign,malignanttissue에서 배양한 세포에서 TizolTM reagent
(InvitrogenCo,U.S.A.)를 이용하여 RNA를 추출하고,그 중 RNA 1 μg을 이용 하여 DNaseI(InvitrogenCo,U.S.A.)1U를 처리하여 남아있는 gDNA를 제거하 였다.gDNA의 잔존여부를 확인하기 위하여 DNaseI을 처리한 RNA를 주형으로
gDNA GAPDH primerset(F,5´-GAAGCTGACTCAGCCCTGCAAAG-3';R,
5'-AGACCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3´)를 이용하여 PCR로 증폭하여 확인
하였다.사용한 primer는 RNA가 PCR의 주형이 될 수 없으며,intron 영역은
gDNA에만 존재하는 특성을 이용하여 제작하였다.PCR 결과 gDNA가 완전히 제거된 것으로 확인이 된 RNA를 TrueScriptIIReverseTranscriptasePCR Kit (QIAGEN,Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며,cDNA 합성 여부를 확인
primerset(F,5´-GCCTCAAGATCATCAGCAATGCCT-3´;
R,5´-AGACCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3´)를 제작하였고,cDNA주형으로 하여 PCR로 증폭하여 확인하였다.
F
FF...RRRTTT---PPPCCCRRR
각 조직(normalskin,benign,malignanttissue)에서 배양한 세포에서 total
RNA를 추출하여,합성한 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이 primer를 사용하
여 PCR로 증폭하였다.사용한 primer는 다음과 같다.
RASA1: F,5´-TTGGAGCTAAGGAGCCCTACATGGA-3´
R,5´-CTGTGCACCACGCTCATTACTGAGC-3´
TotalRNA로 합성한 cDNA를 주형으로,유전자 특이 primer를 이용하여 95℃
20초,60℃ 30초,72℃ 30초에서 30cycle반복하여 PCR(BioRad,MJResearch, U.S.A.)로 증폭된 산물을 2% agarose gel에 전기 영동하여 EtBr로 염색하여 transiluminator로 확인하였다.
G
GG...WWWeeesssttteeerrrnnbnbblllooottttttiiinnnggg
3가지 종류(Normalskin,benign,malignanttissue)의 조직에서 배양한 세포를 lysisbuffer(20mM TrispH 7.5,150mM NaCl,1% TritonX,2mM EDTA, 50 μg/mlPMSF,Proteaseinhibitorcocktail)와 혼합하여 단백질을 추출한 뒤 여 기서 얻어진 시료를 Braford protein assay(Bio-rad laboratories,Hercules,CA, U.S.A.)방법으로 정량 분석하여 samplebuffer(5×)와 섞은 후,95℃에서 5분간 가
열하였다.이를 각각 20∼40 μg씩 loading 한 후 6～15% SDS PAGE로 전기영
GmbH,Dassel,Germany)에 흡착 이동시켜,동정된 4개의 단백질에 대하여 다음
과 같이 각각의 특이항체로 Westernblotting방법으로 분석하였다.사용한 1차 항체
는 TotalRas1:500(UpstateBiotech.LakePlacid,NYe),p120GAP,KRas,HRas 1:200,P53 1:500 (Santa cruz Biotechnology,INC,U.S.A.),ERK, phospo-ERK, cleaved-Caspase31:500(cellsignaling,Thecnology,Inc.Beverly,MA.,USA.),DLP1 (Transduction Laboratories) 1:500,2차 항체로는 peroxidase가 conjugation된 goat anti-rabbitantibody,goatanti-mouseantibody1:5000(SantacruzBiotechnology,INC, U.S.A.)를 이용하여 반응시킨 뒤,ECL(Amersham biosciences,England)를 처리하여 필 름에 현상하였다.
H
HH...RRRaaasssAAAccctttiiivvvaaatttiiiooonnnaaassssssaaayyy
Rasactivationassaykit(UpstateBiotech.LakePlacid,NY)는 kit의 실험방법에 따라 사용되었다. assay는 cell lysate로부터 Ras-GTP를 분리하기 위하여 affinity precipitation을 이용하였다.celllysate는 Raf-1RBD fusion단백질을 결합한 agarose와 함께 incubation하였다.agarosebead는 centrifuge하여 모은 후 lysisbuffer로 washing
하였다.최종적으로 sample buffer를 첨가하여 95℃에서 5분간 가열 후 Western
blotting을 실행 하였다. I
II...HHH222OOO222tttrrreeeaaatttmmmeeennnttt
3가지 종류(Normalskin,benign,malignanttissue)의 조직에서 배양한 각각의 세포에 H2O2100 μM을 4시간 처리 후 harvest하였다.Harvest한 세포는 whole celllysis후 Westernblotting을 실시하였다.
J
JJ...유유유전전전자자자의의 과의 과과발발발현현현을을을 위위위한한 c한 ccooonnnssstttrrruuucccttt구구구축축축
악성종양조직세포에서 발현량이 점차적으로 감소하는 RASA1의 세포내 과발현
(over-expression)시스템을 구축하기 위하여 cloning하였다.해당 유전자의 cDN
A에 사용하고자 하는 제한효소 부분을 포함한 primer를 다음과 같이 제작하였
다. RASA1: F,5'-TACTCGAGGC TTCAACATGATGGCGGC-3' XhoI R,5'-TAGGATCCATGTTGGACATGCTGAATCCA-3' BamHI
RASA1에 돌연변이가 없는 cDNA를 주형으로 하여 PfuDNA Polymerase(Solg ent,Korea)를 사용하여 95℃ 20초,58℃ 40초,72℃ 2분을 35cycle반복하여 P
CR로 증폭하였다.증폭된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 EtBr로
염색 후,transiluminator로 확인하여 해당 유전자의 증폭된 부분을 gelextractio n(Geneallbiotechology,Korea)을 통해 DNA를 추출한 뒤,제한효소 XhoI,Bam HI(RocheDiagnosticsCorporation,Germany)을 이용하여 PCR로 증폭된 RAS A1과 pCDNA3.1(-)vector를 절단한 후 T4ligase(Promega,U.S.A.)를 사용하 여 16℃에서 12시간 이상 Ligation반응하였다.Ligation산물은 E.coliDH5α co mpetentcell에 transformation하고,37℃에서 배양하였다.배양 후 형성된 colon y에 대하여 다음의 primer를 이용하여 colonyscreeningPCR을 시행하였다.
pCDNA3.1(-)F,5´-GATCACCTCGGCATGGACGAGCTGTA-3´
R,5´-GTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGAT-3´ ColonyscreeningPCR은 3step(98℃ 30초,60℃ 30초,72℃ 1분,35cycle반복)
으로 PCR하여 증폭시키고,확인하였다.Colony screening PCR을 통해 해당 유 전자가 cloning 되었다고 확인이 된 colony는 ampicillin을 포함한 LB broth에 배양하여 plasmidminikit(Axygen,U.S.A.)를 이용하여 plasmidDNA를 추출한
뒤,cloning에 사용한 두 제한효소로 절단하여 vector와 insert를 확인한 뒤
sequencing하여 construct를 구축하였다. K
KK...TTTrrraaannnsssfffeeeccctttiiiooonnn
NF1환자의 악성 세포내에서 발현이 감소된 RASA1을 over-expression시키기
위해 Microporator를 사용하여 transfection(Microporator-miniTM, Digital biotechology)하였다.
L
LL...FFFllluuuoororreeesssccceeennnccceeemmmiiicccrrrooossscccooopppyyy
RASA1의 세포내 작용에 따른 cellmorphology등의 modulation 확인을 위하
여,pCDNA3.1(-)으로 cloning한 RASA1을 NF1정상표현형세포와 악성표현형세
포에 pEYFP-C1 vector와 2:1 비율로 co-transfection하여 over-expression시킨
후,형광현미경으로 세포의 형태변화를 관찰하였다.Mitochondria의 염색을 위하
여 mitotracker(MitoTracker Red,Invitrogen)를 사용하였으며,nucleus 염색을 위하여 DAPI(Pierce,U.S.A.)를 사용하였다.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ.
.
.결
결
결과
과
과
A AA...NNNFFF111환환환자자자의의의 검검검체체체로로로부부부터터터 조조조직직직절절절편편편 제제제작작작과과과 세세세포포포배배배양양양 신경계에 다발성으로 종양을 형성하는 유전성 질환인 NF1은 동일한 종류의 세 포에서 유래한 양성과 악성의 종양세포가 함께 존재하였다.NF1환자로부터 분 리한 검체조직에서 정상세포,양성세포,악성종양세포를 포함하는 조직절편을 제 작하고(Fig.6)검체조직으로부터 각각의 세포를 분리‧배양하였다.NF1 유전자 의 mutation 분석 결과,NF1유전자 exon37에서 c.6792C>G로 인한 아미노산이 Y2264X 바뀌는 nonsensemutation이 발견되었다.F
FFiiiggg... 666... NNFNFF111 tttiiissssssuuueee aaannnddd ccceeellll tllttyyypppeee... Mass of Neurofibromatosis type 1 containing Normal, Benign and Malignant tissue regions(A, B, C) and paraffin-embeded tissue sections were counterstained with Hematoxylin & Eosinstain(viewedat400×)(D,E,F).A,Normalskintissueregion;B,Benign tissueregion;C,Malignanttissueregion;D,Normaltypeoftissue;E,Benign typeoftissue;F,Malignanttypeoftissue
F
FFiiiggg...77.7..NNNFFF111 ggegeennneee mmmuuutttaaatttiiiooonn dn ddeeettteeecccttteeeddd iiinnn aaa NNNFFF111 pppaaatttiiieeennnttt The nonsense mutation,c.6792C>G(Y2264X),was detected in exon 37 ofNF1 gene. Thismutationcausesproductionoftruncated,shortenedneurofibromin.
T TTaaabbbllleee333...SSSuuummmmmmaaarrryyy ooofffcccllliiinnniiicccaaalllfffeeeaaatttuuurrreeesssaaannnddd gggeeennnoootttyyypppiiicccccchhhaararraaacccttteeerrriiistssttiiicccsssooofff a aapppaaatttiiieeennntttssswwwiiittthhNhNNFFF111... S/F S/F S/F
S/F AgeAgeAgeAge Clinical Clinical Clinical Clinical features features features features Genotypic Genotypic Genotypic
Genotypic characteristicscharacteristicscharacteristicscharacteristics
References ReferencesReferences References Mutation Mutation Mutation Mutation location location location location Nucleotide Nucleotide Nucleotide Nucleotide change changechange change Amino Amino Amino Amino acid acid acid acid change changechange change Mutation Mutation Mutation Mutation type/ type/ type/ type/ Effect Effect Effect Effect S 24 CALs, PNf, CNf, SCNf, S Exon 37 c.6792C>G Y2264X Nonsense/ Exon skipping Messiaen et al., Hum Genet, 101:75-80(1997)
Legend: S, sporadic; CALs, cafe-au-Lait Spots; CNf, Cutaneous Neurofibromas;SCNf,Subcutaneous Neurofibromas;PNf,Plexiform Neurofibromas;S,Scoliosis.
B
BB...NNNFFF111환환환자자자에에에서서서의의의 KKK---RRARAASSS mmmuuutttaaatttiiiooonnn분분분석석석
Ras의 activationtest를 통해 K-Ras와 H-Ras가 활성화되어 발현된 것을 확인하
였다.NF1의 악성화의 원인으로 알려진 K-RAS의 mutation이 존재하는지 확인하
였다.NF1환자의 조직으로부터 배양된 정상,양성,악성 세포에서 추출한 gDNA를 주 형으로 K-RAS의 Exon1,2,3,4,A-5,B-5의 mutation분석을 하였다.그 결과 많은 암에서 발견되는 K-Ras의 mutation은 발견되지 않았다.H-Ras의 경우 선행연구를 통하 여 mutation이 없음을 확인하였다.
C
CC...RRRAAASSSAAA111mmmRRRNNANAA 와와와 단단단백백백질질 발질 발발현현현량량량 평평평가가가
RASA1의 mRNA 발현량을 확인하기 위하여 normalskin,benign,malignant tissue로부터 배양한 fibroblasts에서 추출한 mRNA를 RT-PCR로 합성한 cDNA
를 주형으로 유전자 특이적 primer를 사용하여 PCR로 증폭하였다.그 결과 정 상,양성,악성세포로 갈수록 RASA1mRNA의 발현량이 감소하는 것을 확인하 였고,단백질 발현량 역시 악성으로 갈수록 감소함을 확인하였다(Fig.8). F FFiiiggg...888...RRRTTT---PPPCCCRRR ooofffRRRAAASSSAAA111 aaannnddd WWWeeesssttteeerrrnnn bbbllloootttaanannaaalllyyysssiiisss ooofffppp11122200R0RRaaasssGGGAAAPPP i
iinnn NNNFFF11 p1pprrriiimmmaararryyy ccceeellllllsss...Showed the decreased RasGAP expression in the malignantNF1cellscompairtothenormalcells.
D
DD...NNNFFF111환환환자자자 세세세포포에포에에서서서의의의 RRaRaasss및및및 RRRaaassssssiiigggnnnaaalll단단백단백백질질질 발발발현현 양현 양양상상상 분분분석석석
Endogenous Ras protein의 발현을 확인하였다(Fig.8A).NF1 환자의 세포에서 N-Ras단백질의 발현은 관찰되지 않았으나,H-Ras와 K-Ras는 악성세포로 갈
→ MAP kinase cascade pathway를 확인하였다. 정상,양성,악성에서의 ERK 단백질의 발현량은 차이 나지 않았으며 p-ERK 단백질은 악성세포에서 활성화된 것을 확인 하였다.ERK가 p-ERK로 활성화 되면 핵 내로 localization되고 Myc 의 transcription factor로 작용하여 결과적으로 anti-apoptosis단백질인 Bcl-xL
의 발현을 증가시키게 된다.따라서 Bcl-xL의 세포내 발현량을 확인하였고,그
연관 단백질인 Bax 와 p53 및 caspase3의 발현량을 함께 관찰하였다.Bax와
p53의 발현량의 차이는 없었으며 악성세포에서 Bcl-xL의 증가된 발현을 확인하
였다(Fig.8B).
F
FFiiiggg...999...WWeWeesssttteeerrrnnn bbbllolootttaaannnaaalllysyyssiiisssooofffRRRaaasss(((NNN---,,,HHH---,,,KKK---RRRaaass)s))aaannnddd RRRaaassssssiiigggnnnaaalll p
pprrrooottteeeiiinnnsssiiinnnNNNFFF111ppprrriiimmmaaarrryyyccceeellllllsss...A.WesternblotanalysisofendogenousRas in NF cellsrevealed high levelexpression ofH-Rasand K-Ras.Expression levelofERK proteinshowednodifferenceamongNF1primarycelltypes,but p-ERK protein showed theincreased expression in themalignantNF1cells. B.ExpressionlevelofBcl-xL proteinshowedup-regulationinmalignantcell, butp53andBaxshowednodifferenceamongNF1celltypes.
B B B...
E
EE...RRRaaasssaaaccctttiiivvvaaatttiiiooonnnaaassssssyyy
Ras 단백질의 활성화 형태인 GTP-Ras를 확인하기 위하여 Ras activation
assay를 시행하였으며 assay를 통해 정상표현형세포에서 악성종양세포로 진행 될수 록 활성화 형태의 H-,K-Ras가 증가된 것을 확인하였다.
F
FFiiiggg...111000...RRRaaasssaaaccctttiiivvvaaatttiiiooonnnaaasssssasaayyy iiinnn NNFNFF111ppprrriiimmmaaarrryyy ccceeellllllsss...Ras-GTPlevelinNF1 cells.H-RasandK-RasactivationwasdetectedinNF1cells.ActivatedH-,K-Ras proteinsshowedtheincreasedexpressioninthemalignantNF1cells
F
FF...HHH222OOO222TTTrrreeaeaatttmmmeeenntnttTTTeeesssttt
p53의 intact여부와 p53-induced 단백질들의 정상적인 작동유무를 확인하기
위하여 H2O2처리 후 Western blotting을 시행하였다.그 결과 정상표현형세포, 양성세포,악성세포 모두에서 증가되는 p53단백질을 확인할 수 있었고,p53단 백질에 의해 발현이 조절되는 Bax단백질 역시 정상,양성,악성세포에서 증가됨 을 확인하였다. F FFiiiggg...111111...HHH222OOO222TTTrrreeeaaatttmmmeeennntttttteesesstttiiinnn NNNFF1F11ppprrriiimmmaaarrryyyccceeellllllsss...H2O2treatmenttestin NF1primarycelltypes.AftertreatmentH2O2weobservedthatbothp53and
Baxproteinsshowedtheincreasedexpressionlevelswithoutdifferenceamong NF1primarycelltypes.
G
GG...악악악성성성세세세포포에포에에서서서 dddooowwwnn-n--rrreeeggguuulllaaatttiiiooonnn된된된 RRRAAASSSAAA11의1의의 ooovvveeerrr--e-eexxxppprrreeessssssiiiooonnn... XhoI,BamHIenzyme을 사용하여 humanRASA1을 pCDNA3.1(-)vector에 cloning하였다(Fig.12).Cloning된 construct와 vector(control)를 RASA1의 발현이 down-regulation된 NF1악성세포에 over-expression시킨 후 총
단백질을 추출하여 그 변화를 Westernblotting으로 확인하였다.악성세포에서
RASA1에 의해 totalRas및 p-ERK의 발현량이 감소되고 apoptosissignaling의 척도인 cleavaged-caspase3의 증가를 확인하였다.
F
FFiiiggg... 111222...RRRAAASSSAAA111 gggeeennneee eeennngggiiinnneeeeeerrriiinnnggg...RASA1 gene engineering using 2 restrictionenzymes,XhoI,BamHIwithpCDNA3.1(-)vector.
A A A...
F
FFiiiggg...111333...OOOvvveeerrr--e-eexxxppprrreeessssssiiiooonnn oooffRfRRAAASSSAAA111 iininn NNNFFF111 mmmaaallliiigggnnnaaannntttccceeellllll...A.Western blotanalysisafterRASA1over-expressioninNF1malignantcellrevealedthe decreased expression oftotal-Rasand p-ERK protein.B.Showed high level expressionofcleavaged-caspase3whichisapoptoticproteininNF1malignant cell.
H
HH...RRRAAASSSAAA111ooovvveeerrr---eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn에에에 의의의한한한 세세세포포포형형형태태태 변변변화화화
RASA1을 NF1정상표현형세포와 악성종양세포에 over-expression하여 세포내
기능 및 형태 변화를 형광현미경을 통해 관찰하였다.pCDNA3.1(-) vector를
control로 사용하고 RASA1이 cloning된 construct와 세포내 성공적인 도입을 확 인하기 위해 pEYFP-C1vector를 2:1비율로 co-transfection한 뒤,mitotracker
로 mitochondria를,DAPI로 nucleus를 염색하였다.그 결과 정상표현형 세포에
R R RAAASSSAAA111 DDDAAAPPPIII MMMiiitttootottrrraaaccckkkeeerrr MMMeeerrrgggeee ( ( (NNNuuucccllleeeuuusss))) (((MMMiitittoooccchhhooonnndddrrriiiaaa))) F FFiiiggg...111444...FFFllluuuooorrreeessscceceennnccceee mmmiiicrccrrooossscccooopppiiicc acaannnaaalllyyysssiiisss ooofffRRRAAASSSAAA111 ooovvveeerrr---eeexxxppprrreeessssssiiiooonnn i iinnn NNNFFF111nnnooorrmrmmaaalllaananndddmmmaaallliiigggnnnaaannntttccceeellllllsss...(A,B)NF1malignantcells,(C,D)NF1 normalcells.Fluorescence microscopic analysis of the co-transfected cells with pEYFP-C1 vector(A,C) orRASA1(B,D).We observed that high percentageofcelldeathinmalignantcellsthannormalcells.
AAA... B BB... C C C... D DD...
I
II...MMMeeettthhhyyylllaaatttiiiooonnnssspppeeeccciiifffiiicccPPCPCCRRR (((MMMSSSPPP)))
유전자의 promoter와 exon1부위의 CpG islandregion이 비정상적으로 메틸화
되면 유전자의 발현이 억제된다.을 발견하였다(Fig.15).p120RasGAP의 발현량
이 정상표현형세포에서 악성종양세포로 갈수록 감소되는 현상의 원인을 밝히기 위해 RASA1유전자의 promotor의 CpG island 영역에서 Methylation specific PCR(MSP)을 시행하였다.그 결과 예상 CpG island영역 중 primer를 제작한 부 위에서의 methylation은 확인 할 수 없었다(datanotshown).현재 다른 CpG 부
위에 primer를 제작하여 계속 진행 중이다.
F
FFiiiggg...111444...PPPrrreeedddiiiccctteteeddd CCCpppGGG iiisslsllaaannnddd sssiiittteeeiiinnnRRRAAASSSAAA111gggeeennneeeppprrrooommmoootttooorrrrrereegggiiiooonnn...We could not detect methylation of CpG which region for MSP primers in RASA1genepromotorregion(datanotshown).
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ.
.
.고
고
고찰
찰
찰
신경섬유종증 제1형(Neurofibromatosis type 1,NF1)은 3~4천명에 한 명꼴로 발생하는 높은 발병률을 나타내고 남녀,민족의 구분이 없이 발병하는 우성유전 질환이다으로 환자의 약 50%는 자연발생적 돌연변이에 의한 것으로 환자는 점 점 늘어나는 추세다.임상증상은 밀크커피색반점과 몇 개의 피부신경섬유종의 경 한 경우부터 심각한 합병증까지 매우 다양한 질병 양상과 경과를 보인다.약 10%미만의 환자에서 악성으로 발전되며 그 변화에 대한 예측이 불가능하다.그 러나 유전병이라는 특수한 상황과,다기관에 다발적으로 발생하는 질환이기 때문 에 병소의 절제 외에는 특이한 치료법이 없다.이러한 다양한 종양의 발생과 악 성화에 대한 문제는 심각하지만 그 뚜렷한 기전을 찾지 못하고 있다.신경섬유종 증 제 1형은 17번 염색체의 중심주위부에 위치하는 NF1유전자의 돌연변이에 의 해 제대로 된 neurofibromin 단백질이 만들어지지 않아 세포의 증식,분화,사멸 등에 관여하는 Ras단백질이 과잉으로 활성화 (GTP-Ras의 축적)되어 세포 증 식이 기하급수적으로 증가되고 결국 NF1이 발병하게 된다. 본 연구는 NF1의 악성화 기전 규명을 목표로 수행하였다.실험의 재료는 NF1 환자의 조직에서부터 정상표현형,양성종양,악성종양세포를 분리,배양하여 사 용하였다.NF1 유전자의 mutation 분석 결과 exon 37에서 c.6792C>G로 인하여
아미노산이 Y2264X 바뀌는 nonsensemutation이 확인되었다. NF1의 악성화 원인
으로 알려진 TP53유전자와 Ras유전자의 돌연변이분석결과 돌연변이는 확인되
지 않았다.이 NF1환자에 있어 TP53유전자의 돌연변이는 발견되지 않았지만
p53의 intact여부와 p53-induced 단백질들의 정상적인 작동유무를 확인하기 위
의 증가된 발현을 관찰함으로써 p53에 의한 악성화가 아님을 확인하였다.다음으 로 정상표현형세포,양성종양세포,악성종양세포에서 K-,H-,N-Ras 에 대한 발현량 및 활성화를 조사한 결과 악성세포로 갈수록 H-와 K-Ras의 발현량 및 활성화가 증가되었다.또한,Raspathway및 세포자멸사(apoptosis)에 관련된 단 백질의 발현량을 분석한 결과,ERK의 활성화 형인 p-ERK와 세포자멸사 억제 Bcl-2family단백질인 Bcl-xL의 발현량이 악성종양세포로 갈수록 증가되어 있었 다.Rassignaling의 증가가 이 NF1환자의 악성화에 직접적으로 관여했다고 생
각하고 neurofibromin과 함께 mammals cell에 있어 세포내 p21-RAS 신호를 negatively하게 조절하는 GTPase-activating protein(GAP)인 p120RasGAP을 확
인해보았다.RT-PCR과 Western-blotting 결과 흥미롭게도 정상표현형세포에서
악성세포로 갈수록 p120RasGAP의 발현량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.
이미 보고된 봐 있는 RASA1의 mutation은 분석결과 확인되지 않았다.
GTPase-activating protein(GAP)으로 가장 처음 기술된 p120RasGAP은 5q13.3에 위치하는 RASA1유전자에 의해 encoding되고 Earlyembryo의 develop에 필수적 으로 요구되며, anti-apoptotic 과 apoptotic 기능을 모두 가지고 있다. p120RasGAP은 Ras signalpathway의 upstream과 downstream에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다.
이 NF1환자의 경우 NF1유전자의 돌연변이에 의한 neurofibromin의 기능 상
실이 NF1 발병 원인이 되었고,또 다른 대표적 Ras-GAP인 p120RasGAP의 down-regulation에 의하여 활성화 형태의 GTP-Ras를 제어하지 못하게 되었다.그 결 과 up-regulation된 p-ERK에 의해 비정상적으로 세포 증식이 증가되었고,Bcl-xL 발 현 증가로 세포사멸이 억제된 결과 악성종양으로 발전하였다고 추측하고
악성세포에서 down-regulation된 RASA1을 over-expression 시키기 위해 human RASA1의 cDNA를 pCDN3.1(-)vector에 cloning하여 악성세포내로 도
입 후 Western blotanalysis와 형광현미경을 이용하여 세포내 단백질의 발현량
상과 세포 사멸 및 형태 변화를 조사하였다.RASA1을 과발현 시킨 후 Ras의 발
현과 Ras downstream에 있는 p-ERK의 발현이 감소되는 것을 확인하였고, caspase3의 활성화를 통한 세포자멸사를 확인하였다.
RASA1의 발현이 정상표현형세포에서 악성세포로 갈수록 down-regulation된
현상의 원인을 분석하기 위해 RASA1유전자의 promotor부위의 CpG island에
서 methylation test를 실시하였으니 primer를 제작한 부위에서의 methylation은 확인 할 수 없었다.산재되어 있는 많은 부위의 CpG 영역을 동시에 확인할 수
없는 점과 CpG island영역의 염기서열 특성으로 인한 sequencing의 어려움 등
의 원인으로 메틸화유무 확인은 쉽지 않지만,현재 다른 부위의 CpG에서 메틸화 유무를 확인 중이다.
Ⅴ
Ⅴ
Ⅴ.
.
.결
결
결론
론
론
본 연구는 신경섬유종증 제1형(Neurofibromatosis,NF1)의 악성화 기전을 규명 하기 위하여 시행하였다.NF1환자의정상표현형,양성종양,악성종양세포의 분 석결과 악성세포에서 Ras단백질의 과발현과 활성화된 Ras가 증가되어 있는 것 을 확인하고 활성 Ras의 과발현이 많은 종류의 암화에 관련한다는 보고에 착안 하여 연구를 수행하였다.Ras의 돌연변이가 Ras과발현의 원인이 되기도 함으로 돌연변이 분석을 시행하였으나 발견되지 않았다.이에 Ras의 Ras-GTP 가수분해 활성을 증가시키는 NF1과 homology를 갖는 RASA1의 발현유무를 RT-PCR과 Western blotting을 이용하여 확인 한 결과 악성세포로 갈수록 발현량이 감소하 는 것을 확인하였다.이에 NF1의 악성화에 있어 RASA1의 관련 가능성에 대하 여 조사하였다.악성화 된 NF1세포에 감소된 RASA1을 세포내 도입하여 과발 현 시킨 결과 Ras단백질의 발현 및 활성화 형태의 발현이 감소하였으며 활성화 된 caspase3의 발현의 증가로 인한 세포자멸을 확인하였다. 더 나아가서 NF1 환자의 정상표현형세포에 RNA interference 기법으로 RASA1의 발현을 억제시켜 정상표현형세포가 악성종양세포로의 악성화 여부를테스트하고 RASA1 유전자의 promotor영역에서 처음으로 발견한 CpG island
region의 methylation유무를 확인하여 NF1의 악성화에 있어 RASA1의 관련 가 능성과 함께 tumorsuppressgene으로써의 가능성에 대하여 연구할 계획이다.
본 연구결과가 NF1의 악성화 기전규명과 RASA1유전자를 응용한 NF1의 치료
참 참
참고고고문문문헌헌헌
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SuJinLee
DepartmentofMedicalSciences TheGraduateSchool,AjouUniversity
(SupervisedbyAssistantProfessorSeon-YongJeong & ProfessorHyonJ.Kim )
Neurofibromatosis type 1 (NF1) is one of the most common inherited autosomaldominantdisorders,with an estimated incidence of1 per 3,500 births.NF1 is characterized by a high incidence ofbenign and malignant tumors attributed to loss of function of NF1. NF1 gene encodes neurofibromin,a tumor suppressor with Ras-GAP activity that negatively regulates p21-RAS signaling. Neurofibromin deficiency typically causes chronic activation ofRas,which is thoughtto be a major contributor to manifestation ofNF1.The cardinalfeatures ofNF1 are cafe-au-lait(CAL) spots, neurofibromas, freckling of the axillary or inguinal region, Lisch nodules,optic nerve glioma,and bone dysplasias.NF1 is notable for the existenceofagradualmalignantdegenerationofnormaland/orbenigntumor cells.Although TP53 mutation and chromosome 17p deletions have been
detected in malignanttumors,the mechanism ofprogression to malignancy hasnotyetbeenclarified.
In this study,wehavestudied thecharacterization oftumorcells derived from aKoreanpatientwithNF1.Among threemajorRASs,K-RAS,H-RAS and N-RAS,H- and K-RAS expression weredetected by Western blotting. Particularly, significant up-regulation of K-RAS was detected in the malignantNF1cells.RAS activationtestrevealedalargeamountofactivated form (GTP-RAS)ofK- and H-RAS in the malignantNF1 cells.Mutation analysisshowedthattherecurrentnonsensemutation,Y2264X,wasidentified in theNF1 gene,butno mutationsweredetected in threeRAS and TP53 genes.Next,wecarriedoutWesternblotanalysisoftheproteinsrelatedRas pathway and apoptosisusing theisolated normal,benign and malignantNF1 cells.Expression ofthe phosphorylated-ERK and Bcl-xL were increased in themalignantNF1cells.
Interestingly,weobserved lowerRASA1geneexpression in themalignant cellscompared tonormaland benign cellsin both mRNA and protein levels by RT-PCR and Western blotanalysis.RASA1 gene encodes p120RasGAP,
which isfirstdescribed asanegativeregulatorofRasin 1988.Tofind out thereason whyRASA1genewasdown-regulatedinthemalignantcells,we had checked methylation status in CpG island on the promotor region of RASA1. But,we could notdetectmethylation ofRASA1.To clarify the cellularfunctionsofp120RasGAP in themalignantNF1cells,wehaveused vector-mediatedRASA1geneexpression.Western blotanalysisafterRASA1
over-expressionintheNF1malignantcellsrevealedthedecreasedexpression ofH- and K-Ras and p-ERK protein.In addition,high levelexpression of cleavaged-caspase3and following high percentageofapoptoticcelldeath of theNF1 malignantcells weredetected,suggesting thatRASA1 isa strong candidategeneinvolvedinthetumorigenesisandmalignanttransformationof NF1.A furtherfunctionalanalysis ofp120RasGAP may lead to notonly a better understanding the mechanisms of tumorigenesis and malignant transformationbutalsoaneffectiveapplicationtothetherapeutictreatmentof NF1.
Key words:Apoptosis,GTPaseactivating protein(GAP),neurofibromin,NF1, p120RasGAP,Ras,RASA1
