경희대학교 의과대학·의학전문대학원

전체 글

(1)

감염병의 검사실진단

Dept. of Laboratory Medicine

Hee Joo Lee

(2)

검체 채취

, 운반 및 접종

검체의 채취

오염이 안되게 감염이 있는 바로 그 부위

채취시기가 중요

충분량의 검체

적당한 채취기구

(dacron, polyester) :

Stuart, Amies, Cary-Blair 등의 수송 배지 , 혐기성 배

양용 검체 ( 주사기 흡인액

), 검체 채취에서 부터 접종까지

의 시간 단축

항균제 투여전

용기에 환자의 병록번호

, 이름 , 의뢰한 과 , 병실 , 검

체의 종류 기록

(3)

검체별 채취방법

혈액 :

피부소독을 철저히 해서 상재균이 들어가지 않도록

Iodophor, iodine tincture, chlorohexidine → 1 분간 마

르기를 기다린 후 채혈

혈액

10 mL

를 호기성 배양용 배지 (trypticase soy broth,

brain heart infusion broth

등 ) 와 혐기성 배양용 배지

(thioglycollate broth) 에 접종

충분량 접종

오한이 나기 전이 좋으나 예측할 수 없으므로 열이 나면 바로 채

혈하고 시간차이 없이

동시에 다른 부위

에서

2-3 회 채혈한다 .

급성심내막염인 경우

S. aureus 와

같은 병원성이 강한 균주

에 의한 것이 많으므로 즉시 채혈

아급성 심내막염

30 분 내지 1 시간 간격을 두고 채혈

(4)

카테터 연관 혈관내 감염

(catheter-related blood stream infection)

반정량적 배양 Roll plate 법 5 cm 잘라서 4-5 번 굴려서 배양 1 회의 혈액 배양 양성, 팁 배양 15 개 이상 : CRBSI

혈액 배양 음성이면 집락수에 관계 없이 : 집락화

중심 정맥관이나 venous access port (VAP) 추천 방법 2 회의 혈액 배양 비교 ( 말초 혈액과 카테터 허브 )

1) 동일 균종이 주심정맥관 혈액 배양에서 120 분 먼저 배양시 , 2) 5 배 이상의 균수

(5)

척수액 L3 와 L4 사이를 2% iodine tincture 로 소독 세 개의 무균 시험관에 각각 2-5 ml 첫째나 둘째 시험관을 이용 채취한 즉시 검사실로 , 지연시에는 실온 오염되지 않게 요 요도 주위를 비눗물로 씻은 다음 중간뇨 10 ml 를 무균용기에 (midstream clean catch)

즉시 검사실로 지연시 냉장보관 • 105 CFU/ml

• 젊은 여성에서 증상을 호소하는 경우 • 102 CFU/ml 도 감염으로 간주

(6)

인후 검체 : 운반 지연시 실온 보관

β-hemolytic group A str.(S. pyogenes) : 인후염

Corynebacterium diphtheriae : Albert 염색

Neisseria gonorrhoeae : modified Thayer Martin 배지

후두개염 원인균 (H. influenzae type b, S. aureus, S. pneumoniae)

농 주사기로 흡인 흡인하지 못하는 경우 : 수송배지 이용 체액 : 오염 되지 않게 • 생식기 검체 • 무염색 표본 : Trichomonas • 임균 , Clamydia trachomatis: • 핵산증폭교잡법 등

(7)

기관지 보호솔질

(protected specimen brush, PSB) 과

기관지 폐포세척액

(bronchoalveolar lavage fluid, BAL)

인공호흡기 단 환자

, 면역저하환자의 폐렴의 진단

PSB : 기관지경을 통하여 cannula 를 원하는 곳에

넣고 솔을 이용하여 검체를 채취 ( 솔을

1 mL

의 액체

배지나 식염수

)

BAL 기관지경을 통하여 140 mL 이상의 식염수를

3-4 번에 걸쳐 주입 이중 일부를 30 분이내에 미생물

검사실로 ( 지연시 냉장고

)

• 정량 배양은 진단의 특이도는 높지만 민감도는 양성결

과로 선택된 기준치에 의해 결정

(8)

BAL 검체에서 10

4

CFU/mL 이상 : 세균성 폐렴

PSB 에서 10

3

CFU/mL 세균성 폐렴 분비물 내의

세균이

10

5

-10

6

CFU/mL 임을 의미

연속배수희석법

보정된 루프법

(9)

대변 검체 급성기에 채취한 설사변 1-2 g 정도를 채취 면봉을 항문 괄약근 위 1 인치 정도 넣어 회전 Cary-Blair 나 Stuart 수송배지 C. difficile 의심시 ; 독소검사 입원한지 3 일 이후의 설사환자의 변은 : 일상적인 세균 배양은 실시하지 않 고 C. difficile 검사 혐기성 세균을 위한 검체 산소에 노출되는 것을 막기 위해 CO2 나 N2 가스를 채운 시험관 주사기로 흡인시에는 공기를 배출시킨 후 고무마개를 통하여 검체를 병에 넣는 다 . 면봉사용시에는 환원시킨 혐기성 수송배지의 고층이용 Cary-Blair 등의 수송배지

(10)

임상미생물검사

일반 검경

세균배양검사

혈청검사

(11)

일반 경검

현미경

Phase contrast microscopy Fluorescence microscopy Darkfield microscopy Electron microscopy 염색표본 Gram 염색 항산성염색

형광염색 : auramine-rhodamine (mycolic acid 와 친화성 ), Acridine orange, Calcoflour white

면역형광염색 : fluorescein isothicyanate (FITC), tetramethyl rhodamine isothianate (TMRI) 단클론성항체

(12)

혈청검사

Serologic tests

침강법

보체고정법

중화시험

응집법

효소면역분석법

항체검사

면역글로불린 검사

IgG avidity test

(13)

분자진단의 활용

진단 및 병원체 확인

세균 및 진균의 동정

질병의 예후와 진행의 확인

치료 반응 여부의 확인

병원감염의 확인 및 역학조사

(PFGE)

(14)
(15)

그람양성 구균

Staphylococcus

• 통성 혐기성 그람 양성 구균

• Coagulase positive : Staphylococcus aureus

 임상검체에서 분리되는 균의 25% 정도

 피부감염 , 중이염 , 수술 후 창상 감염 , 균혈증 ,

심내막염 , 폐렴 , 화농성 관절염 , Scalded skin syndrome, toxic shock syndrome, 식중독

90% 이상이 penicillin 내성 (β-lactamase 생성 ) Methicillin resistant S. aureus (mecA 유전자 )

-PBP2a 생성 - 세포벽에 β-lactam 계 항균제가 결합하 지 못함 : 병원에서 분리되는 세균의 70% 정도

Glycopeptide-intermediate 또는 vancomycin-intermediate Sta. aureus

(16)

• Coagulase negative Staphylococci (CNS)

S. epidermidis, S. haemolyticus, S.

lugdunensis, S. warneri, S. saprophyticus

(17)

사슬알균

Streptococcus

Gram positive cocci

혈청학적

: 탄수화물 항원

Lancefield group A, B, C, G

용혈양상

: alpha, beta, gamma hemolysis

Group A β- hemolytic streptococcus: 사구체 신

염 , rheumatic fever

Group B β- hemolytic streptococcus:

신생아 패혈증 , 수막염

Streptoccocus pneumoniae: 지역사회 폐렴 ,

(18)

그람음성세균 Gram negative bacilli

Enterobacteriaceae

호기성 또는 통성 혐기성 세균

Nitrate

를 nitrite 환원 oxidase 음성 gram neg bacilli

대변에서 검출시 : MacConkey, SS, XLD, EMB

E. coli O157: MacConkey-sorbitol

배지

Extended spectrum beta-lactamase (ESBL) E. coli, K.

pneumoniae :

병원감염의 주요 원인균

ESBL

생성균 확인

Enterobacter, Citrobacter, Serratia: 3

세대

cephalosporin

을 계속하여 투여 받은 환자에서 내성으로

변하는 경향

Salmonella

와 Shigella: 1 세대와 2 세대

cephalosporin, aminoglycoside

항균제에 의하여 치료가

되지 않기 때문에 감수성으로 보고하지 않는다 .

(19)

비브리오 및 에로모나스균

Oxidase 양성 Vibrio Comma or curved 극성 편모 V. cholerae, 01, 0139 : 콜레라 대유행과 관련 , 국내에는 간헐적으로 있 으며 해외에서 유입되어 발생 Non01, nonO139 : 콜레라 독소를 생산하지 않고 유행성 설 사와 관련이 없는 설사와 장염

V. mimicus, V. damsela, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. vulnificus…

Pseudomonas

병원환경에서 흔히 분리

Acinetobacter Haemophilus

(20)

Haemophilus 및 HACEK 세

Haemophilus :

상기도의 정상상재균

H. influenzae b: 수막염 , 패혈증 , 후두개염

X (Hemin) 와 V (nicotineamide adenine

dinucleotide, NAD) 의 증식촉진인자 필요 ( 균종에

따른 차이 있음

)

HACEK bacteria: 세균성 심내막염 흔히 유발

H. parainfluenzae, Aggregobacter

aphrophilus, Aggregobacter

actinomycetemcomitans, Cardiobacterium

hominis, Eikinella corrodens, Kingella 등이 포

(21)

Gram negative cocci

그람음성 쌍알균

Catalase

와 oxidase 양성

Neisseria meningitidis

일반적으로 penicillin 에 감수성

Neisseria gonorrhea

검체 채취시 윤활제나 소독제가 섞이지 않게 , 솜면봉 채취시

즉시 접종 , endo cervix 에서 채취

Penicillin

에 내성 70%, beta lactamase 에 의함

Spectinomycin

에 의한 내성은 드물며 ceftriaxone 에 의한 내

성은 보고된바 없다 .

(22)

혐기성세균

대부분 피부와 점막의 정상균의 무리 , 일부 기회 감염균

선행요인 : 조직의 손상 , 불충분한 혈액공급 , 조직괴

사 , 악성종양 , 조직 중에서 산소성 세균의 증식

대부분 내인성 감염

외인성 감염으로는 보툴리누스 중독 ,

C. perfringens

식중독 , 가스괴저 , 파상풍

검체의 직접검사

악취 , 농성 유황과립이 있을때 혐기성 감염을 의심할 수

있다 .

임상적으로 중요한 혐기성 세균

1. 무산소성 그람양성 알균 Peptostreptococcus

2. 무산소성그람음성막대균 Bacteroides

(23)

배양

원칙 ① 적절한 검체를 채취하여 공기에 노출되지 않게 수송 ② 접종시 검체를 산소에 노출시키지 말며 ③ 새로 만들었거나 환원시킨 배지에 접종 ④ 충분한 혐기성 조건에서 배양 • 배지 비선택배지 : CDC 혈액배지 , brucella 배지

선택배지 : PEBA (phenyl ethyl blood agar), KVLB (kanamycin vancomycin laked blood)

증균배지 : Enriched thioglycollate medium • 배양방법

무산소성 단지 (anaerobic jar)

(24)

Clostridium difficile

정상인의 장내 보균율 : 3%, 입원환자의 장내 보균율 : 30%

Antibiotic associated diarrhea, pseudomembranous colitis 신선 설사변 10-20 mL

우리 나라의 경우 B 독소만 양성인 경우가 많으므로 A & B 로 해야

(25)

미산소성 세균 Microaerophilic bacteria

Campylobacter C. jejuni ssp. jejuni 산발성 세균성 장염의 제일 흔한 원인 곡선형 , S 자형 , 긴 나선형의 그람음성간균 Skirrow 등의 선택배지에 접종 , O2 5%, CO2 10%, N2 85%, 420C 의 환경에서 배양 Helicobacter pylori 위궤양의 원인 , 발암의 원인

Urea breath test (C14 이 들은 urea 용액을 마시고 호기 중의 동 위원소 CO2 측정 )

Gastric biopsy (Giemsa 염색 )

O2 5%, CO2 10%, N2 85% 7 일간 배양 PCR

(26)

나선균 Spirochetes

Leptospira

Leptospira interrogans

가을철 , 동물을 다루거나 논 사탕수수 농장에서 일하는 사

혈액 , 척수액 , 요검체

암시야 현미경 : 빠르게 운동하는 나선형 세균

PCR

조직 : silver stain

배양 : Fletcher 반고체 배지 : 30oC, 또는 실온 암소에서 6

주간 배양

항체검사 1:100 이상이면 양성

(27)

Treponema pallidum

성병매독

쉽게 죽기 때문에 채취한 즉시 시행

병변에서 Treponema 를 찾아내는 암시야현미경검사

병원성 Treponema 는 시험관내에서 배양이 어려우므로

혈청학적 검사 중요

Nontreponemal test : Wasserman

항체 , reagin 을 검

VDRL, RPR

Treponemal test :Treponema

에 대한 특이항체 검출

FTA-ABS, TPI, TPHA

(28)

마이코박테리아 Mycobacteria

분류 및 특성

Acid fastness :

염색이 어렵지만 일단 basic fuchsin 에 염색이 되면 산 - 알코

올에 탈색되지 않음

호기성 , 비운동성 , 항산성 간균

Mycobacteria

과 -Mycobacterium 속

M. tuberculosis complex (MTB complex, M. tuberculosis,

M. bovis, M. microti, M. africanum, M. Canetti, M.

pinnipedii)

나 M. leprae 등 200 균종 이 중 40 균종 정도가

사람에 질병을 일으킴

(29)

역학

우리나라 : 결핵의 유병율 - 지속적인 감소

2007

년 총 신고환자 : 4 만 6 천명 (10 만 당 94

명 ), 신환자 3 만 5 천명 (10 만명당 72 명 )

20

대에 최고 그후 감소 50 대에 다시 증가 65 세 이

상에서 발병률이 가장 높아짐

미국 CDC : 1985 년부터 다시 증가 후천성 면역결

핍증 환자 , 죄수 , 이민자 , 요양원에 있는 노인에서

증가

HIV

중복 감염률 0.2% 정도

MOTT 7-60%

이중 M. avium-intracellulare

complex (MAC)

가장 흔함

(30)

진단법

감염을 일으키기 쉬우므로 안전에 주의 기울여야

Biologic safey cabinet class II 에서 마스크 모자 , 장갑을 착용해야 검체채취 호흡기검체 : 아침 첫 객담 하루에 한번씩 3-5 회 연속적 위세척액 : sodium bicarbonate 로 위산 중화 체액 : 소변은 이른 아침에 채취한 중간뇨가 좋다 . 한번씩 3 회채취 혈액 및 변 : 면역 억제 환자에서만 필요 액화 및 오염 제거 필요 : 2-4% NaOH

(31)

항산성 염색

Carbolfuchsin

염색법 (Ziehl-Neelsen, Kinyoun):

유침렌즈 >300 시야

형광염색법 (auramine-rhodamin): X250 에서 30

시야 관찰 : 양성인 경우 carbolfuchsin 염색법으

로 확인해야

예민도 :

5X10

3

-1X10

4

/mL 이상 되어야 양성을 보

( 배양은

10-100 균주가 존재하면 양성

민감도

: 22-80%

특이도

: 99% 이상

(32)

배양

계란배지 (Lowenstein-Jensen, Ogawa)

한천배지 (Middlebrook 7H10, 7H11) 투명하여 조

기에 집락이 자라는 것을 관찰 가능

액체배지 : 고체배지에 비해 조기에 검출

자동화기기 :

배양기간을 단축 , 민감도가 높다 .

오염률이 높고 값이 비싸다

8

주까지 배양하여 음성으로 보고

(33)

동정법

생화학적 동정

: Niacin 법

크로마토그래피법

: 지방산에 대한

chromatography pattern

분자생물학적 동정

그외 신속 동정법

(34)

분자생물학적 방법에 의한 항산균의 직접 검출법

Nucleic acid probes: DNA probe

를 이용

PCR :

결핵균의 DNA 혹은 RNA 의 특이한 부분

을 증폭시켜 이에 특이한 소식자와 교합시켜 진단

자가제조법

Mycobacterium tuberculosis direct (MTD) test

AMPLICOR MTB assay:

미국 식품의약안전청승

AdvanSure TB/NTM real time PCR kit

(35)

면역검사법

혈청학적 검사

: 아직 검사실에서 사용할 수 있는 방법은 없

다 .

인터페론 감마

(IFN-γ) 측정법 (interferon gamma

release assay, IGRA)

결핵균에 대한 세포성 면역관찰

잠복결핵의 진단

면역억제 치료를 받고자 하는 환자

면역억제 환자에서 결핵 발병 위험여부를 예측

의료진에 대한 정기적 접촉 감염 조사

결핵 발병율이 높은 나라의 이민자들에서 감염여부를 보고자

할때

(36)

진균 Fungi

1. 특징과 임상적 분류

2. 핵막에 둘러 사인 핵을 가짐

3. 엽록소가 없어 부생 , 공생 , 기생

1. 형태

1. 효모균 (yeast)

2. 사상형 진균 (Mold)

3. 두형태곰팡이 (Dimorphic fungi) : 조직 , 37

o

C,

효모 , 실

온 사상형 진균

2. 생식

1. 유성생식과 유성포자

2. 무성생식과 무성포자

3. 분류

1. 완전 진균

2. 불완전 진균

(37)

진단법

1. 검체의 채취 및 접종

건조 , 냉동 금지

객담 : 양치질 후 아침 첫 객담

뇌척수액 : 양이 많을 수록 좋음 , 보관시 실온

혈액 :

모발 , 조갑 , 피부 : 병변의 가장자리 scraping

요 : 아침 첫뇨 , 중간뇨

조직 : 마르지 않게

골수 흡인물

농 , 삼출물

(38)

2. 직접검사

10-20% KOH :

피부 , 조갑 , 모발

India ink :

뇌척수액

Calcofluor white : Pneumocystis carinii

Fluorescent monoclonal Ab. :

호흡기 검체에서 폐포

자충 검출

Giemsa

및 Wright 염색

3. 조직 , 병리학적 검사

Methenamine silver, PAS 4. 혈청학적 검사

면역확산법 , 보체고정법 , latex 응집법 , ELISA

Crytococcosis, Aspergillosis, Candidiasis, Sporotrichosis, Blastomycosis, Coccidioidosis, Histoplasmosis

(39)

5.

배양검사

1. 배지

Sabouraud dextrose agar (SDA) 비선택배지

선택배지 : 항균제와 cycloheximide 2. 배양조건

30oC 에서 최소 4 주간

3. 사상형 진균의 동정법 : 균집락과 형태학적 특성 관찰 Lactophenol cotton blue

4. 효모균 진균의 동정법

Germ tube test : C. albicans 상품화된 제품 : API 20C 등 Corn meal tween 80 agar

Nitrate(KNO3) 동화반응 , urease 검사 , CHROMagar Candida

(40)

혈청학적 검사

항원

, 항체 검사법

크립토콕쿠스 협막 다당류 항원 검사

분자생물학적 검사

높은 양성률

,

감염이 아닌 균 정착 환자에서도 양성을 보일 수 있

다 .

균종동정

: 염기순서분석법을 이용

Internal transcribed region space (ITS)

region 과 D1/D2 domain 분석 이용

(41)

기회감염균증의 진단

1. Candidiasis

와 그외 효모감염균증

1. Candidia spp.

발아관 시험 , 탄수화물 발효시험과 동화시험 상푼화된 Kit, 형태학적 특징 , CHROMagar KNO3, urease

2. Aspergillosis

1. 무색소의 격벽이 있는 균사가 45 각도 , 환경에 흔히 존재 2. 동정소견 3. 혈청학적 검사

3. Zygomycosis

4. Hyalohyphomycosis

5. Phaeohyphomycosis

(42)

항균제 감수성 검사

1. 서론

• 감수성 검사는 분리된 모든 세균에 대해서

시험하는 것이 아니라 병인균과 항균제 감수

성 양상을 예측하지 못하는 균종

, 또는 내

성이 문제가 되는 균종에 대하여 시험

• 최소억제농도 (

M

inimal

I

nhibitory

C

oncentration: MIC): 배양된 세균의 육

안적 증식을 억제할 수 있는 항균제의 가장

낮은 농도

(43)

• Breakpoint ( 임계점 ): 혈중 내에 도달할 수 있는 항균제 농 도로서 이 농도에서 균 증식이 억제되지 않으면 감수성이 없음 을 의미 • 감수성 (susceptible): 그 균종의 감염에 추천되는 항균제를 보통 용량으로 투여했을 때 치료될 수 있을 것임 • 중간 (intermediate): 완충구역 감수성인 약제가 없는 경우 중간 인 항균제의 최소 억제 농도를 측정한 후 사용 • 내성 (resistant): 일반적으로 그 균종 감염에 권장되는 항균제를 보통 용량을 투여해서는 치료되지 않을 것이라는 의미

(44)

균종에 따라 시험해야 할 항균제를 선택

동일

cluster 에 속하는 대표 약제로

A 군 항상 감수성 시험하고 보고

B 군 1 차로 시험은 하지만 특수한 경우에만 선택

적으로 보고

C 군 A 군과 B 군에 내성이 많은 병원에서 추가로

시행하고 선택적 보고

(45)

희석법

1. 액체배지 희석법

시험관법

미량배지 희석법

:

상품화 되어 사용

MIC, MBC 를 알 수 있으나 인력 , 시간 , 비용이 많

이 든다

.

2. 한천희석법

(46)

확산법

디스크확산법

(Disk diffusion methods)

일정량의 항균제가 포함된 직경

6 mm 의 디스크를 균

액이 접종된 한천배지 위에 떨어뜨린 후 일정시간 배양

하여 생긴 디스크 억제대의지름을 측정

E test (Epsilometer test)

확산법의 일종으로 최소억제 농도를 알 수 있는 장점

항균제가 들어잇는 스트립을 이용하여 스트립 주위에 항

균제의 농도 그래디언트를 통해 최소억제농도를 알 수 있

다 .

(47)

무산소성세균의 항균제 감수성검사

심내막염

, 뇌농양 , 관절 내 감염 , 인공기구 , 혈관 삽

입물과 관련된 감염

, 세균혈증과 같은 중증감염에서 분

리된 균주

Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium,

Clostridium 등

Metronoidazole, CM, imipenem,

ampicillin-sulbactam 에 대해 거의 모두 감수성

Penicillin, clindamycin, cefoxitin, cefotetan, 3

세대

cephalosporin 에 대해서는 균종에 따라 다르다

한천희석법

: B. fragilis

(48)

마이코박테리아의 항균제 감수성 검사

돌연변이에 의해 발생

병합요법 : 내성균주 선택을 방지

다제 내성 결핵균

(MDR-TB)

광범위위 항균제내성 결핵균

(XDR-TB)

절대농도법

, 내성비율법 , 비율법 , Bactec 방법 ,

rpoB 유전자의 점 돌연변이 검출 등

새로운 내성 검사법

신속감수성 검사법

분자 유전학적 방법을 이용한 내성 검출

감수성 시험의 적응증

CLSI : 모든 환자의 첫 분리주

치료실패의 증거가 있거나 치료 3 개월 후에도 배양이 음

전하지 않을 경우

수치

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참조

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