醫 學 碩 士 學 位 論 文
골 육 종 에 서 Retinoblas t om a g ene
f am ily m e m b e rs (pRb/ p 105 , p 107 ,
pRb 2/ p 130 )의 다 른 표 현 과 예 후
D if fe re nt i al e x pre s s io n o f th e re t in o bl a s t o m a g e n e
f am ily m e m b e r s (pRb/ p 105 , p 107 , pRb 2/ p 130 ) in
o s t e o s arc om a : P ro g n o s t ic s ig n ific an c e
아 주 대 학 교 대 학 원
의 학 과
박 영 준
골 육 종 에 서 Retin obla s t om a
g e n e f am ily
m e m b e r s (pRb/ p 105 , p 107 ,
pRb 2/ p 130 )의 다 른 표 현 과 예 후
D if fe re nt i al e x pre s s io n o f th e re t in o bl a s t o m a g e n e
f am ily m e m b e r s (pRb/ p 105 , p 107 , pRb 2/ p 130 ) in
o s t e o s arc om a : P ro g n o s t ic s ig n ific an c e
지 도 교 수
강 신 영
이 논 문 을 의 학 석 사 학 위 논 문 으 로 제 출 함
200 1 년 10 월
아 주 대 학 교 대 학 원 의 학 과
박 영 준
박 영 준 의 의 학 석 사 학 위 논 문 을
인 준 함 .
심 사 위 원 장
강 신 영
인
심 사 위 원
김 병 석
인
심 사 위 원
이 기 범
인
아 주 대 학 교 대 학 원
200 1 년 10 월
감 사 의 글
이 논문을 완성함에 있어 세심한 배려와 격려로 지도하여 주신 강신영 교수님, 김병석 교수님께 무한한 감사를 드리며, 논문 심사 중 훌륭한 지적 과 방향을 잡아주신 병리학교실 이기범 교수님께 감사를 드립니다. 실험하는 과정에서 항상 문제점을 잡아주시고 많은 도움을 주신 정형외과학교실 이동 신 박사님, 정형외과학교실 최선실 선생님께 깊은 감사를 드립니다. 오늘의 이 작은 결실을 맺기까지, 자식을 위하여 모든 것을 희생하여 주신 부모님과 항상 사랑과 희생으로 옆에서 내조하여 준 아내에게 이 논문 을 바칩니다.2 0 0 1 년 10 월
박 영 준
국 문 요 약
-골 육 종 에 서 retin obla s t om a g en e f am ily m em b e rs (pRb/ p 105 , p 10 7 , pR b 2/ p 13 0 )의 다 른 표 현 과 예 후
목 적 : 골육종의 세포 주기내 G1기에 pRb/ p 105, p107, pRb2/ p 130의 표현 정
도와 골육종 환자의 병리 조직학적 등급, 사망 여부, 예후와의 관계를 알아 보기 위하여 본 실험을 고안하였다.
재 료 및 방 법 : 골육종 환자 38 샘플, 정상 골조직 3 샘플, 각기 다른 5 종류
의 골육종 세포주(G292, H2OS , MG63, Saos - 2, U2OS )에서 전 RNA를 추출 하여 RT - PCR을 위하여, 분리된 RNA 1㎍에 역전사 효소를 넣고 배양하여 cDNA를 만들어 pRb/ p105, p 107, pRb2/ p130에 대한 prim er로 PCR을 수행하 였다. 또한 RT - PCR 생산물 10㎕를 이용하여 SSCP를 실시하였고, protein 30㎍을 이용하여 전기 영동을 실시한 후 일차 항체(prim ary ant ibody )와 이 차 항체(secondary antibody )를 이용하여 western blot을 실시하였다. 골육종 환자 38명 및 3명의 정상 골조직의 연령, 성별, 병리 조직학적 등급, 생존 여 부 등을 진료 기록부를 이용하여 그 결과를 확인하였다. 결 과 : RT - PCR 결과 골육종 38례, 정상 골조직 3례, 대조군 1례, 골육종 세 포주에서 pRb/ p105, p 107, pRb2/ p130의 mRNA가 모두 확인되었다. w estern blot에서 pRb가 86.8%, p 107은 23.7%, p 130은 86.8%에서 표현되었으며, S S CP 결과 pRb/ p 105와 pRb2/ p 130에서 유전자 변이는 확인되지 않았다. 임 상 결과 골육종 환자 38명 중 병리학적 등급은 저악성도 골육종 2례, 고 악 성도 골육종 36례이었고, 사망한 경우는 11례이었다. 결 론 : 골육종 환자에서 p 107는 23.7% (38례 중 9례)에서 표현되었으며, p 107 이 표현된 예중 77.8% (9례 중 7례)가 사망하였으며, p107이 표현되지 않은 예 중 17.2% (29례 중 5례)가 사망하였다. 또한 pRb/ p105는 86.8% (38례 중 33례)에서 표현되었으며 pRb가 표현된 예 중 36.3% (33례 중 12례)가 사망하
였으며, 표현되지 않은 예는 모두(17.2% ) 생존하였다. pRb2/ p 130는 86.8% (38 례 중 33례)에서 표현되었으며, 표현된 예중 27.3% (33례 중 9례), 표현되지 않은 예 중 60% (5례 중 3례)에서 사망하였다. 그리하여 p 107이 표현되거나 pRb2/ p 130가 표현되지 않은 경우 각각 77.8%, 60%에서 사망하여 골육종의 예후 인자로 사용될 가능성을 제시하였다. 핵 심 단 어 : 골 육 종 , pR b/ p 105 , p 107 , pRb 2/ p 130 , 예 후
차
례
국문요약 1 차례 3 그림 차례 5 표 차례 6 I. 서론 7 II. 대상 및 방법 9 A. 대상 9 B. 방법 9 B-1. 세포 배양 9B-2. total RNA isolation 9
B-3. RT-PCR 10 B-4 SSCP 10 B-5. protein isolation 11 B-6. western blotting 11 III. 결과 12 A. 임상 결과 12 A-1. 병리학적 등급 12 A-2. 절제연 12 A-3. 국소 재발, 폐전이, 사망 12 B. 실험 결과 13 B- 1. RT-PCT 13 B-2. western blotting 13 B-3. SSCP 14 IV. 고찰 15 V . 결론 18
참고문헌 19
그 림 차 례
그림 1.
24
그림 2.
25
그림 3.
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그림 4.
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그림 5.
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그림 6.
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그림 7.
30
그림 8.
31
그림 9.
32
표 차 례
표 1.
33
I. 서
론
골육종은 다발성 골수종 다음으로 흔하게 발생되는 악성 골종양으로, 유 골을 형성하는 비정형적인 세포로 특징 지워지는 일차성 악성 골종양이다. 발생 빈도는 인구 100만명 당 1.5명이 발생하는 것으로 알려져 있다. 골육종 의 치료는 수술전 항암치료, 수술적 절제술 후 재건술과 수술후 항암 치료의 병행 치료법(multi- m odality treatment )이 대표적인 치료 방법이다. 수술적 절제술도 Enneking7 ,8 에 의한 절제 및 절단 분류인 병소내 절제, 변연부 절 제, 광범위 절제, 근치적 절제 또는 각각의 절단 방법이 있으며 항암 치료가 병행된다는 전제 조건하에서 광범위 절제술이 권장되고 있다. 항암 치료법도 로젠 등18 이 권장하는 수술전 항암 치료, 수술후 항암 치료법을 병행하는 신 보조 항암 요법(neo- adjuvant chemotherapy )을 권장한 이래 대부분의 골육 종 전문 치료 병원에서 이 방법으로 골육종 환자를 치료하고 있다. 이런 신 보조 항암 요법의 장점은 수술전 항암 치료를 실시하고 본 수술이 시행되어 골육종이 발생된 부위의 광범위 절제하여 얻은 이환된 골을 여러(9- 25) 조 각으로 작은 절편을 만들어 수술전 항암 치료 효과에 대한 평가를 실시하여 종양 세포의 괴사 정도1 4 ,18 가 90% 이상 인 경우를 good responder , 90% 미 만의 종양 괴사를 보이는 경우를 poor responder라고 하여 good responder 는 수술전 항암 치료제를 그대로 수술후 항암 치료제로 계속 사용하고, poor r esponder는 수술전 항암 치료제가 효과가 없다고 판단하여 수술후 항암 치 료제를 다른 항암제로 바꾸어 실시하는 tailored program을 실시함으로써, 항암 치료 효과를 증대시키고, 미세 전이나 원격 전이를 예방하고, 종양 주 위 염증 부위(inflammatory zone)를 감소시켜 사지 절단술보다 사지 구제술 이 가능하게 하여준다는 장점이 있어, 골종양 전문의들은 이 방법을 일찍부 터 널리 골육종 환자 치료에 이용하고 있다. 실제로 그 치료 효과도 골육종 환자들의 절단술만을 시행한 경우 5년 생존율은 20%, 수술 및 수술후 항암 치료로 병행 치료를 실시(보조 항암 치료)할 경우 5년 생존율은 50%, 수술
전 항암 치료, 수술, 수술후 항암 치료(신 보조 항암 치료)를 병행할 경우 5 년 생존율은 80%로 알려져 있다. 최근에는 골육종의 예후 판정에 항암 치료 후 조직 괴사 정도가 제일 중요하다는 데에는 병리학자 및 정형외과 종양 전문의들이 대부분 동의하고 있으나, 종양의 괴사 정도를 판단하는 병리학과 전문의들의 개인적인 능력의 차이, 검사하는 병리학자들 간에 발생되는 편 차, 검사하려는 검체내에 항암 치료 전 골육종 세포가 얼마나 존재하는 지 여부, 검체가 전체 종양을 대표할 수 있는지 여부가 미지수이어서 종양 괴사 정도를 판단하는데 오류가 발생할 수 있다는 문제점이 제기되고 있는 것이 사실이다.
Retinoblast om a (Rb ) gene family1 6는 pRb/ p105, p107, pRb2/ p 130 등의 3 종류가 있다. R b gene(pRb/ p105)이 처음 알려졌는데, 이는 4,757 nucleotides 에 의해 형성되며 928 아미노산으로 형성된 단백질의 유전 암호를 지정한다. 106,159 Da의 전산화 분자량(comput ed m olecular m as s )을 가지며, 200kb인 27 ex on을 구성하고 있으며, 염색체 13번(chrom osom e 13q14)에 위치하고 있다. p 107은 3,960 nucleotides에 의해 형성되며 1,068 아미노산으로 형성된 단백질을 유전 암호를 지정하며, 120,876 Da의 전산화 분자량을 가지며, 염 색체 20번(chr om osom e 20q11.2)에 위치하고 있다. pRb2/ p130은 3,853 nucleotides에 의해 형성되며, 1,139 아미노산의 단백질을 유전 암호로 지정 하며, 128,402 Da의 전산화 분자량을 가진다. pRb2/ p130은 염색체 16번 (chr om osom e 16q12.2)에 위치하고 있다고 알려져 있다. 이 세 종류의 단백 질은 세포의 핵내에 주로 위치4 하고 있으며, 구조상 N - terminal portion , pocket structure, C- t erminal portion으로 구성되고 있으며, 여기서 pocket struct ur e는 dom ain A , spacer , dom ain B로 다시 나뉜다. 여기에서 pocket
prot ein은 구조적인 유사성이 있음에도 불구하고 endogenou s 또는
ex ogenou s pr ot ein과 서로 다른 결합 성질을 가지는 것으로 알려져 있다. 그 리하여 이 Rb 단백질은 세포 분화, 배아 발달, viral oncoprotein과 작용하여 세포 성장 억제 성질 상실, 종양 발생 억제 상실, 암으로의 tran sformation
또는 progression과 연관이 있다1 ,14 ,1 6 ,2 2 고 알려져 있다. 그리하여 이 Rb 단백 질의 기능 상실로 인하여 많은 암들의 pathogenesis와 progression에 영향을 줄지도 모른다1 3 ,2 1 고 알려져 있다. 대부분의 연구자들에 의해 Rb 유전자에 의한 종양 발생과 연관된 논문이 많이 연구되었으나, 최근 Rb 유전자의 표현과 관련하여 종양의 예후와의 관 계를 발표하는 논문이 보고9 되고 있어, 저자는 희귀 암의 일종인 골육종 환 자의 Rb 유전자 표현과 예후 등과의 관계를 규명하여 실제 임상 결과와 비 교하여 임상 적용 여부를 판단하여 보고자 본 실험을 고안하였다.
II . 대 상 및 방 법
A . 대 상 임상적 및 방사선학적으로 골육종이 의심되는 환자를 수술실에서 조직 생검을 실시하여 H - E stain을 실시하여 병리학 교수에 의하여 골육종이라고 확진 받은 38명의 환자 조직, 3명의 정상 조직, 1례의 태반 조직(대조군), 5 종의 골육종 세포주를 실험 대상으로 하였으며, 골육종 환자의 경우 병리학 적 등급(pathologic grade), 절제연, 국소 재발, 폐 전이, 사망 여부를 확인하 였다. 골육종 환자의 조직 및 정상 조직은 수술실에서 조직 생검 및 본 수술 시 광범위 절제 후 채취한 정상 조직(약 1cc 용량)을 채취하자마자 cryotube 에 담아 액화 질소(liquid nitrogen )(- 70℃)내에서 냉동 보관한 후 본 실험에 사용되었다. B . 방 법 B - 1 . 세 포 배 양 (Ce ll c u lt u re )골육종 세포주(ost eosarcom a cell line)인 Saos - 2, HOS , MG- 63, U2OS , G292를 AT CC에서 구입하여 10% FBS (fetal bovine serum , Hyclone), Earle ' s salt가 함유된 Minim um E ssential Medium (EMEM , GIBCO BRL )
을 사용하여 세포 배양기에서 37℃, 5% CO2 의 조건하에서 세포 배양을 실
시하였다. 세포는 70% 정도 confluent시 계대 배양을 실시하였다.
B - 2 . 전 R N A 분 리 (T o t a l R N A i s o l at i o n )
RT - P CR을 위해 70% confluent된 5 종류의 골육종 세포주(ost eosarcom a cell line)와 수술시 채취한 38례의 골육종 조직 샘플에서 t ot al RNA를 분리 하였다. 5 종류의 골육종 세포주인 Saos - 2, HOS, MG- 63, U2OS , G292에 0.25% trypsin (GIBCO BRL )을 처리하고 4℃ 12,000rpm 에서 원심 분리를 실 시하여 세포를 모았고, 골육종 조직 0.4g을 액화 질소로 급속 냉동을 시킨 후, 막자 사발에 모아 조직을 으깨고 T ri Pure isolation kit (Boehinger Manheim )를 사용하여 RNA를 분리하였다. 먼저 세포와 조직에 ly sis buffer 를 넣고 5분 동안 incubation한 후 chloroform을 첨가한 후 vortexing으로 고루 섞어 15분 동안 상온에서 incubation을 실시하였다. 12,000rpm , 4℃에서 15분 동안 원심 분리를 실시한 후 상층액만 새 tube로 옮긴 뒤 isopropanol 을 넣고 잘 섞어준 후 10분 동안 incubation을 실시하였다. 12,000rpm , 4℃ 에서 10분 동안 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고 75% ethanol을 넣고 잘 섞어 7,500rpm , 4℃에서 5분 동안 원심 분리를 실시하였다. ethanol을 완전히 제거하기 위하여 상온에서 pellet을 말린 후 DEPC 처리한 물에 다시 녹여 주었다. B - 3 . R T - P CR
분리된 RNA 1㎍을 t emplat e로 하여 oligo(dT ) 10 (CLONT ECH Labor at ories , Inc.)와 MMLV 역전사 효소(Prom ega , Inc.)를 넣고 42℃에서 1시간 incubation하여 cDNA를 합성한 후 이 cDNA로 P CR을 실시하였다. pRb , p107, p 130에 대한 prim er (T able 1)로 10X P CR buffer (1.5mM MgCl2
포함), 10mM dNT P s, 0.5U Ex T aq polymerase(T aKaRa) 94℃ 30sec - 5 5℃ 30sec - 72℃ 1m in의 조건으로 35 cy cle을 수행하였다. probe용은
placent a RNA를 사용하여 위와 같은 방법으로 cDNA를 합성하였고, pRb , p 107, p130을 prim er로 하여 위와 같은 조건으로 P CR을 수행하였다.
B - 4 . S in g l e S t ra n d Co n f o rm a t i o n P o ly m o rph i s m (S S CP )
RT - P CR product 10㎕에 S S CP form ide loading buffer (95% form ide-10m M NaOH - 0.05% br om ophenol blue- 0.05% xylene cyanole)을 첨가하 여 95℃에서 5분 동안 denatutation을 실시한 후 재빨리 얼음으로 옮겨 식힌 다. 이 샘플로 MED gel에 4℃, 4W로 4시간 동안 전기 영동한 후 EtBr (0.5 ㎍/ ㎖)로 20분간 염색을 실시한 후 3차 증류수로 20분간 탈색을 시행하고 자 외선 위에서 사진을 촬영하였다.
B - 5 . 단 백 질 분 리 (P ro t e in i s o la t i o n )
70% confluent된 골육종 세포주(ost eosarcom a cell line)를 먼저 차가운 1X phosphat e buffered saline (PBS )으로 씻은 후 이를 다시 긁어 t ube에 모 은 후 4℃하의 12,000rpm에서 원심 분리한 후 상층액을 버리고 pellet만 취 했다. 골육종 조직(osteosarcoma tissue)은 액체 질소로 얼린 후 막자 사발로 갈아서 tube에 모았다. 이렇게 모아진 pellet에 EBC ly sis buffer (120mM NaCl, 40mM T ris pH8.0, 0.5% NP - 40, 1mM EDT A )와 pr ot ease inhibit or인 luepeptin , PMSF , Aprotinin을 넣은 후 30분간 얼음 위에서 incubation한 후 4℃ 12,000rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상층액을 취하여 Pr ot ein A ssay Reagent (Bio Rad)로 정량을 실시하고 2X- SDS sample buffer (100mM T ris Cl, 10% β- m er capt oethanol, 20% glycerol, 4% SDS , 0.2% brom ophenol blue)를 첨가하였다. 95℃에서 5분간 끓인 후 다시 - 20℃ 에서 보관하였다.
B - 6 . W e s t e rn bl o t t in g
SDS - PAGE에 전기 영동하고, PVDF m em br ane에 10V로 15시간 정도 t ran sfer하였다. 이 blot을 blocking buffer (20m M T ris - Cl, pH7.5- 150m M NaCl- 5% 탈지분유- 0.05% t w een 20)에서 30분 동안 blocking한 후 prim ary antibody pRb , anti- p130(T r an sduction , #C20320/ L 1), anti- p107(Pharminga ) 를 1x T BST buffer (20mM T ris - Cl, pH7.5- 150mM NaCl- 0.05% tween20)에 1㎍/ ml의 농도로 희석시켜 24시간 incubation시켰다. 1x T BST 로 5분간 3번 w ashing한 후 Hor se r addish peroxida se (HRP )가 conjugat ed된 secondary antibody , anti- m ou se 또는 ant i- r abbit poly clonal antibody를 1x T BST 에 희석하여 1시간 동안 incubation시켰다. 1x T BST 로 antibody를 washing한 후 ECL solution (Amer sham Biochemicals )을 처리하고 필름 시간 별로 노출 시켜 현상하였다.
III. 결
과
A . 임 상 결 과 A - 1 . 병 리 학 적 등 급 (p a t h o l o g i c g ra de ) 골육종은 골에서 발생한 일차성 골육종과 다른 질환이나 다른 양성 종양 에서 속발되어 발생되는 이차성 골육종이 있는데, 일차성 골육종은 37례, 이 차성 골육종은 유잉 육종의 방사선 조사 후 발생된 방사선 조사 후 골육종 1례가 연구에 포함되었다. 골관절에 발생되는 악성 골종양의 병리학적 분류는 임상 양상, 전이 능력 등을 감안하여 분류한 Enneking7 ,8의 high grade와 low grade 둘로 나뉘는 병리학적 분류가 대부분 임상에서 이용되는데, 각각 high grade는 Broder의
병리 조직학적 분류3
상 grade 3, 4가 여기에 속하며 전이 능력이 25% 이상 이고, low grade는 Broder의 병리 조직학적 분류 상 grade 1, 2가 여기에 속 하며 전이 능력이 25% 미만이다. 저자의 경우에는 골육종 환자 38례 중에서 high gr ade는 36례, low grade는 2례이었다(T able 2).
A - 2 . 절 제 연 (re s e c t i o n m a rg in )
Enneking7 ,8
에 의한 절제연은 38례의 골육종 환자에서 병소내 절제 4례, 광범위 절제 21례, 근치적 절제 2례이었고, 11례는 절제연에 대한 기록이 없 어 정보로 이용할 수 없었다.
A - 3 . 국 소 재 발 (l o c a l re c u rre n c e ) , 폐 전 이 (pu lm o n ary m e t a s t a s i s ) , 사 망 (de ath ) 골육종 38례 중 7례에서 국소 재발이 발견되었고, 폐전이는 12례에서 발 견되었으며, 인근 림파선 전이가 1례에서 발견되었다. 골육종 38례 중에서 11례에서 사망하였다(T able 2). B . 실 험 결 과 B - 1 . R T - P CR
pRb 유전자의 ex on 10에서 ex on 27까지를 A region, B r egion , C r egion , D r egion , E r egion의 다섯 부분으로 나누어 dom ain A (A pocket )와 dom ain B (B pocket )가 모두 cov er 되도록 디자인을 실시하여 실험을 시행하였다
(F ig . 1).
골육종 환자 38례, 정상 골조직 3례, 대조군 1례(태반 조직), 5 종류의 골 육종 세포주(G292, H2OS , MG63, S aos - 2, U2OS )에서 pRb (F ig . 2), p 107(F ig . 3), p 130(F ig . 4)의 mRNA가 모두 발현되었으나. 샘플 30에서 pRb 의 E region에서 mRNA가 발현되지 않았다. 그러나 western blot에서 pRb 가 표현 되었으므로 이는 mRNA 검사시 오류가 있었음을 암시하여 주었다.
B - 2 . W e s t e r n b l o t t i n g
① pRb
1 1, 12, 13, 14 , 15 , 16, 17, 20 , 2 1, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 30 , 3 2, 3 3, 3 5, 36, 38, 39 , 40 , 4 1은 pRb가 발현되었고, 샘플 19 , 29 , 3 4은 아주 약 하게 pRb가 표현되었으며, 특히 샘플 3 4는 오랜 시간 동안 노출시 pRb가표 현되었으며, 전체 임상 예 중 8 6 .8 %(3 3/ 38)에서 pRb가 관찰되었다. 그러나 샘플 1, 2, 18, 28 , 37은 pRb가 발현되지 않았으며, 그 비율은 약 13 .2%(5/ 38)이었다(Fig . 5) . pRb가 표현된 3 3례 중 12례(3 6 .3 %)는 사망하 였고, pRb가 표현되지 않은 예는 모두 생존하였다. ② p 10 7 샘플 14, 30은 비교적 강하게 p 10 7이 표현되었으며, 샘플 1 1, 17, 2 1, 35은 p 10 7이 표현되었으며, 샘플 3 2, 33 , 3 6은 오래 노출시 아주 희미 하게 band가 관찰되었다. 그러나 이외의 샘플은 p 10 7이 표현되지 않았다 (Fig . 6). p 10 7이 23 .7%(9/ 38)에서 표현되었으며, p 10 7이 표현된 9례 중 7 례(77 .8%)에서 사망하였으며, p 10 7이 표현되지 않은 29례 중 5례(17 .2%) 가 사망하였다. ③ p 130 샘플 3 , 9, 10 , 11, 13, 2 1, 22, 23, 24 , 25, 26, 28 , 29은 p 130가 아주 강하게 표현되었으며, 샘플 1, 2, 8, 12, 14 , 15 , 16, 17, 20 , 27, 3 2, 3 8, 39 , 4 1에서도 p 130의 발현이 관찰되었으며, 샘플 4, 5, 6, 7 , 18, 19 , 30은 일반적인 시간 동안 노출시 관찰되지 않았으나 오랜 시간 노출하면 약하게 발현되는 것이 관찰되었으며, 38례 중 33례(8 6 .8 %)에서 관찰되었다. 샘플 33, 3 4, 35 , 37, 40은 p 130가 전혀 발현되지 않았으며, 38례 중 5례 에서 관찰되지 않았다(13 .2%)(Fig . 7). p 130가 발현된 33례중 9례(27 .3%) 는 사망하였고, 발현되지 않은 5례 중 3례(60 %)는 사망하였다. B - 3 . S i n g l e s t r a n d c o n f o rm a t i o n p o ly m o rp h i s m (S S CP )
pRb/ p 10 5의 A, B, C, D, E r e gion (F ig . 8)과 p 130의 ex on 19, e x on 20 , ex on 2 1, e x on 22에서의 유전자 변이는 전 예에서 발견되지 않았다 (Fig . 9). 그러나 실험을 실시하지 못한 p 10 7에 대한 연구가 향후 더 필요하 리라 사료된다.
IV . 고
찰
모든 진핵 세포는 세포 주기를 통해 하나의 모 세포가 2개의 딸 세포로 분열한다. 이러한 세포 주기는 G0기/ G1기/ S기/ G2기/ M기로 나뉘고, 세 포 주기가 진행되려면 이중에서 G1/ S tran sition에 중요하다고 알려진 check point가 있어 여기를 지나야 모든 세포의 세포 주기가 진행된다고 알려져 있 다. 이러한 세포 주기는 cyclin과 CDK (cy clin - dependent kinase), CKI(cdk inhibit or )의 상호 작용에 의해 조절된다고 알려져 있다. 분열 과정에 있는 세포는 cy clin과 cdk는 서로 결합하여 목표 단백질을 인산화(phosphorylation ) 시킴으로 해서 세포 주기를 진행시킨다고 한다. 지 금까지 이들에 대한 연구는 많이 진행되어 왔는데, 이들 중 특히 세포 주기 에서 G1 시기와 말기에 있는 check point에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포 주기에서 G1에 작용하는 cy clin인 cyclin D1은 cdk4나 cdk6와 결 합하여 암 억제 단백질의 하나인 pRb (retinoblast om a prot ein )을 인산화 (phosphorylation )시키는데, 이때 pRb와 결합하고 있던 전사 조절인자인 E2F family가 pRb와 분리되어 G1/ S tr an sition에 필수 조절인자인 cyclin E를 비 롯하여 세포 주기 중 S기에 필요한 유전자들을 활성화시킨다고 알려져 있 다. cylcin E는 cdk2와 결합하여 다시 pRb를 인산화(phosphorylation )시켜 세포 주기 S기로의 진행을 촉진시킨다고 알려져 있다. 여기에서 cyclin/ cdk 복합체가 세포 주기를 진행시키는 조절인자라면 CKI는 세포 주기의 진행을 막는 조절인자이다. p21과 p27이 속해있는 Cip/ Kip family는 cyclin/ cdk 복합 체와 결합하여 cdk의 활성화를 억제하고, p16이 속한 INK4a family는 cdk4,cdk6와 결합하여 이들의 활성화를 억제하여 세포 주기 진행을 억제시킨다고 알려져 있다1 1 ,1 2 . 하지만 이러한 조절인자들이 정상적으로 작용하지 못할 때 에는 세포 주기 진행에 문제가 발생되며, 조절인자의 기능에 따라 정상 세포 성장이 억제되거나 과도하게 촉진되어 암세포로 전환되는 경우가 흔히 있다 고 알려져 있다4 .
pRb 유전자는 활성화 형태인 hypophosphorylat ed form 이 DNA tum or viru s oncoprot ein과 결합하면 이때 E2F 와 같은 전사 조절인자가 방출되어 세포 주기가 진행되고, phosphorylated form은 cyclin/ cdk 복합체에 의해 이 루어지고 이 결과 E2F가 방출되고 세포 주기가 진행된다고 알려져 있다. 그 리하여 세포 주기 중 G1/ S기의 check point에서 pRb나 cyclin E/ cdk2 복합 체가 중요한 역할을 한다1 6
고 알려져 있어, 저자는 여기에 대한 연구의 일단 계로 pRb 유전자에 대한 연구를 시작하였다.
pRb 유전자의 그동안 알려진 기능으로는 위에서 언급한 것과 같이 세포 주기의 G1/ S tran sition의 중요한 역활의 일부를 담당하고, 세포 분화 (differentiation ) 및 배아 발달(embryonic dev elopm ent )에 관여하고 있다1 4고
알려져 있다. 또한 viral oncoprot ein인 E 1A는 pRb의 pocket에서 E2F - 1을 해리시키고 pocket 부위에 E 1A가 결합하므로서 결국 해리된 E2F - 1이 활성 화되어 세포 주기를 진행시킨다고 한다. 또한 E7과 같은 oncoprot ein은 E2F - p107 복합체 형성을 방해한다고 알려져 있으며, pRb2/ p 130는 E2F 활성
화를 억제하는데 E 1A나 E7은 E2F의 기능을 다시 회복 시켜준다6
고 알려져 있다.
pRb와 암과의 관계를 보면 pRb , p107, pRb2/ p130가 과발현 되면 암세포 의 성장 장해나 성장 억제를 한다고 알려 있다. pRb나 p 107이 없는 T 98G hum an glioblast om a multiform e나 MCF - 7 hum an m am m ary adenocarcinom a cell lines에서는 pRb2/ p130는 잔존하여 세포 증식을 방해하 나, cdk4나 cdk6의 inhibitor인 p 16I N K A 4 A
유전자의 homozygous deletion이 있고, 이 때문에 pocket prot ein은 특수 cyclin/ cdk 복합체는 광범위하게 인
산화 과정을 거쳐 세포 주기 진행을 막는데 기능적으로 불활성화를 초래한 다5 ,10 고 알려져 있다. RB 유전자에 의한 최종 단백질의 결핍이나 기능 부전을 야기 시키는 RB 유전자 구조 변화는 수많은 암에서 발견1 9 되었는데, 여기에는 소세포성 폐암 (sm all cell lung cancer ), 비 소세포성 폐암(non - sm all cell lung cancer ), 유방암, 골육종, 백혈병, 전립선암, 방광암, 악성 신경교종(malignant glioma ) 등2 ,5 이 알려져 있다. 그러나 p 107이나 pRb2/ p 130의 결손이나 기능 부전은 인 형 악성 종양에서는 아직 잘 알려져 있지 않다. 최근에는 유방암, 난소암, 간 암, 전립선암 등에서 pRb2/ p 130은 빈번하게 변화된 것을 확인2 0할 수 있었으 나, p107은 암에서 이상을 발견하기 어려웠다. 자궁암의 경우에서는 pRb2/ p 130가 감소되면 국소 재발이나 사망 확율이 높다고 보고하였으며, 소 세포성 폐암은 pRb2/ p 130와 PCNA (proliferating cell nuclear antigen ) 사이 에 음성의 상관관계(negativ e correlation )를 가지며, p 107은 거의 검출되지 않는 것으로 알려져 있다. 맥락막 흑색종(choroidal melanoma )은 pRb2/ p 130 은 암의 정도와 역관계를 유지하고 있다고 보고1 5 하였다. 저자는 본 실험에서 종양 억제 유전자인 pRb/ p 105는 RT - PCR에서 100% 발현되었으며, western blot 검사에서 86.7%에서 발현되었고, SSCP에서 변 이가 한 예도 발견되지 않는 결과를 보여주었다. 그러나 샘플 11, 2 1, 14 , 17, 30 , 3 2의 경우에는 pRb/ p 105, p107, pRb2/ p130 모두 표현되어 이 경우 에는 Rb 유전자 이외의 다른 유전자가 암발생에 주요한 역할을 할 것으로 추정되었다. 정상 골조직(샘플 5, 7, 31)은 모두 골육종 환자의 정상 조직 샘 플이었으며 이들의 정상 골조직을 채취하여 western blot의 검사 결과 3례 중 1례에서 Rb 유전자가 표현되지 않았다. western blot에서 p 107이 표현된 77.8% (9례 중 7례)에서 사망하여 향후 예후 인자로서 그 가능성이 제기되었 으며, 향후 E2F family 및 cy clin E/ cdk2에 관한 연구가 시급하리라 사료되 었다.
V . 결
론
골육종 환자의 희귀성을 감안하더라도 적지 않은 수인 38례의 골육종 환 자의 RT - PCR, w est ern blot , SSCP 검사를 실시하여, RT - PCR 검사에서 1 예를 제외한 전 예에서 mRNA가 발현되었다. western blot에서 pRb/ p 105는 86.8%에서 표현되었으며, 나머지 13.2%에서 표현되지 않았으나 S S CP에서 유전자 변이가 발견되지 않아 이는 pRb/ p 105 유전자보다는 다른 종양 억제 유전자가 암발생에 많이 관여하리라 사료되었다. p 107은 23 .7%(3 8례 중 9 례)에서 표현되었으며, p 10 7이 표현된 77 .8%(9례 중 7례)에서 사망하였으 며, p 10 7이 표현되지 않은 17 .2%(29례 중 5례)가 사망하였다. pRb 2/ p 130 는 86 .8%(3 8례 중 3 3례)에서 표현되었으며, 표현된 예 중에서 27 .3%(33례 중 9례)에서 사망하였으며 표현되지 않은 예는 모두 생존하였다. 그리하여 p 10 7이 표현되거나, pRb 2/ p 130가 표현되지 않을 경우 각각 77 .8%, 60 %에 서 사망하여 새로운 골육종의 예후 인자로서 사용될 가능성이 제기 되었다.
참 고 문 헌
1. Araki N, Uchida A, Kimura T, Yoshikawa, Aoki Y, Ueda T, Takai S-I, Miki T and Ono K: Involvement of the retinoblastoma gene in primary osteosarcoma and other bone and soft-tissue tumors. Clin Orthop 270:271-277, 1991.
2. Baldi A, Esposito V, De Luca A, Howard CM, Mazzarella G, Baldi F, Caputi M, and Giordano A: Differential expression of the retinoblastoma gene family members pRb/p 105, p 107, and pRb2/p 130 in lung cancer. Clin Ca Research 2:1239-1245, 1996.
3. Broders AC: The microscopic grading of cancer. (cited from Haeber PB ed, Treatment of cancer & allied disease, 2nd ed. Medical Book Development of Harper & Brothers, 55-72, 1940).
4. Cinti C, Claudio PP, Howard CM, Neri LM, Fu Y, Leoncini L, Tosi GM, Maraldi NM, and Giordano A : Genetic alterations disrupting the nuclear localization of the retinoblastoma-related gene RB2/p 130 in human tumor cell lines and primary tumors. Ca Research 60:383-389, 2000.
4. Claudio PP, Howard CM, Fu Y, Cinti C, Califano L, Michelli P, Mercer EW, Caputi M, and Giordano A: Mutations in the retinoblastoma-related gene RB2/p 130 in primary nasopharyngeal carcinoma. Ca Resarch 60:8-12, 2000.
5. De Luca A, Baldi A, EspositoV, Howard CM, Bagella L, Rizzo P, Caputi M, Pass HI, Giordano GG, Baldi F, Carbone F, and Giordano A: The retinoblastoma gene family pRb/p 105, p 107, pRb2/p 130 and simian virus-40 large T-antigen in human mesotheliomas. Nature Medicine 3(8):913-916,
1997.
Livingstone. 378-4 10, 1983.
7. Enneking WF, Spanier SS and Goodman MA : A system for the surgical staging of musculoskeletal sarcoma. Clin Orthop, 153:106-120, 1980.
8. Feugeas O, Guriec N, Babin-Boiletot A, Marcellin L, Simon P, Babin S, Thyss A, Hofman P, Terrier P, kalifa C, Brunat-Mentigny M, Patricot L-M, and Oberling F: Loss of heterozygosity of the RB gene is a poor prognostic factor in patients with osteosarcoma. J Clin Oncol 14(2):467-472,
1996.
9. Hinds PW and Weinberg RA: Tumor suppressor genes. Curr Opinion Genet Develop 4:135-14 1, 1994.
10. Howard CM, Claudio PP, De Luca A, Stiegier P, Jori FP, Safdar NM, Caputi M, Khalili K, and Giordanio A: Inducible pRb2/p 130 expression and growth-suppressive mechanisms: Evidence of a pRb2/p 130, p27K ip 1, and cyclin E negative feedback regulatory loop. Ca Research 60:2737-2744, 2000.
11. Levine RA and Fleischli MA: Inactivation of p 53 and retinoblastoma family pathways in canine osteosarcoma cell lines. Vet Pathol 37:54-61, 2000. 12. Levine AJ and Momand J: Tumor suppressor genes: the p53 and
retinoblastoma sensitivity genes and gene products. Biochem et Biophysica Acta 1032:119-135, 1990.
13. Li J, Hu S-X, Perng G-H, Zhou Y, Xu K, Zhang C, Seihne J, Benedict WF, and Xu H-J: Expression of the retinoblastoma (RB) tumor suppressor gene inhibits tumor cell invasion in vitro. Oncogene 13:2379-2386, 1996. 14. Massaro-Giordano M, Baldi G, De Luca A, Baldi A, and Girdano A:
Differential expression of the retinoblastoma gene family members in choroidal melanoma: prognostic significance. Clin Cancer Research 5:1455-1458, 1999.
15. Paggi MG, Baldi A, Bonetto F, and Giordano: Retinoblastoma protein family in cell cycle and cancer: A review. J Cell Biochem 62:4 18-430,
1996.
16. Picci P, bacci G, Campanacci M, Gaspirini M, Pilotti S, Cerasoli S, Bertoni F, Guerra A, Capanna R, and Albisinni U: Histologic evaluation of necrosis in osteosarcoma induced by chemotherapy. Regional mapping of viable and nonviable tumor. Cancer 56:1515-152 1, 1985.
17. Rosen G, Caparras B, Huvos AG, Kosloff C, Nirenberg A, Cacavio A, Marcove RC, Lane JM, Mehta B and Urban C: Preoperwtive chemotherapy for osteogenic sarcoma. Cancer, 49:122 1- 1230, 1982.
18. Sun Y, Hagamyer G and Colburn NH : Nasopharyngeal carcinoma shows no detectable retinoblastoma susceptibility gene alterations. Oncogene 8:791-795,
1993.
19. Susini T, Baldi F, Howard CM, Baldi A, Taddei G, Massi D, Rapi S, Savino L, Massi G, and Giordano A: Expression of the retinoblastoma-related gene Rb2/p 130 correlates with clinical outcome in endometrial cancer. J Clin Oncol 16:1085-1093, 1998.
20. Wadayama B, Toguchida J, Shimizu T, Ishizaki K, Sasaki MS, Kotoura Y, and Yamamuro T: Mutation spectrum of the retinoblastoma gene in osteosarcomas. Ca Research 54:3042-3048, 1994.
2 1. Yamaguchi T, Toguchida J, Yamamuro T, Kotoura Y, Takada N, Kawaguchi N, Kaneko Y, Nakamura Y, Sasaki MS, and Ishizaki K: Ca Research 52:24 19-2423, 1992.
ABSTRACT
-Differential expression of the retinoblastoma gene family members
(pRb/p105, p107, pRb2/p130) in osteosarcoma(OS):
Prognostic significance
Young-June Park
Department of Medical Science
The Graduate School, Aj ou University
(directed by Prof essor Shin Young Kang)
Purpose: The retinoblastoma gene is the prototype of tumor-suppressor
genes and has been shown to be involved in the pathogenesis and
progression of OS. In this study, we determined the relation between the
expression of pRb/p 105, p 107, & pRb2/p 130 and outcome in patients with
OS.
Materials & Methods: We studied 38 patients' samples with OS, 3
normal bone tissues, & 5 OS cell lines(G292, H2OS, MG63, Saos-2,
U2OS) for the expression of pRb/p 105, p 107, & pRb2/p 130 by RT-PCR
and western blotting technique. We also tried to study the point mutation
of OS by SSCP technique. We checked patient's age, sex, pathologic
grade, and survival rate by the medical records.
Results: m-RNAs of pRb/p 105, p 107, & pRb2/p 130 were expressed in
100% by RT-PCR technique. pRb/p 105 was expressed in 87%, p 107, in
23.7%,
and
pRb2/p 130,
in
86.8%
by
western
blotting
technique,
respectively. There was no point mutation for pRb/p 105 and pRb2/p 130
by SSCP technique. We noticed low grade OS in 2 cases and high grade
OS in 36 cases by Enneking's pathologic grade system. 11 patients were
dead. The patients who expressed p 107, were dead in 77.8% and the
patients who not expressed pRb2/p 130, were dead in 60%, among the
patients with OS.
Conclusion: Authors thought p 107 to be an independent poor prognostic
factor and pRb2/p 130 to be inversely correlated with poor survival rate.
Table 1. P rim ers for P CR am plification of the Rb gene in O S.
pRb
ex on a 5 ' -CA GA CT GA T T CT A T A GA CA C- 3 ' 5 ' -GCAT GGA T T CCAT T A CT CGG- 3 ' ex on b 5 ' -CA CA GCGAT A CA AA CT T GGA- 3 ' 5 ' -GGGAT T CCA T GA T T CGAT GT- 3 ' ex on c 5 ' -CCAT GGA T T CT GAA T GT GC- 3 '
5 ' -CT GA GGT T GCT T GT GT CT CT- 3 ' ex on d 5 ' -GGT T CA A CT A CGCGT GT A AA- 3 ' 5 ' -GCA T A T GCCA T A CA T GGA GC- 3 ' ex on e 5 ' -CAT GA GA GA CA GGCA T T T GG- 3 ' 5 ' -CT T GT A A GGGCT T CGA GGA A- 3 ' p 107 ex on a 5 ' -GA GCCGGT T A CA GA GT AT T G- 3 ' 5 ' -GA A CT T T GT T T GCA GAA A CC- 3 ' ex on b 5 ' -AA GA GA GCT GGGT CCT T A GC- 3 ' 5 ' -T CCAT CAT CT GGT CCT GAT T- 3 '
p 130 ex on 19 5 ' -A GGT CCT AT CA CCAA GGGT GT- 3 ' 5 ' -GCT T A GT T A CT T CT T CAA GGC- 3 ' ex on 20 5 ' -GA GAA A GT T AA T AT CCT A GCT G- 3 ' 5 ' -GT GA AT GGT CCA T AT A T A AA T CA- 3 ' ex on 21 5 ' -T GGT T T A GCA CA CCT CT T CA C- 3 ' 5 ' -GCT T A GCA CAA A CCCT AT T T C- 3 ' ex on 22 5 ' -CT GA GCT A T GT GCAT T T GCA- 3 ' 5 ' -AA GGCT GCT GCT A A CA GA T- 3 '
Table 2. Clinical data of O S an d norm al tissues.
Sample No. Sex/Age Pathologic Grade Survival
1 F/ 16 High Alive 2 M/20 High Alive 3 M/ 19 High Alive 4 M/42 High Dead 5 M/ 18 Normal Tissue – 6 M/ 18 High Alive 7 M/ 12 Normal Tissue – 8 M/ 12 High Alive 9 F/25 High Alive 10 F/21 Low Alive 11 F/ 16 High Alive 12 F/27 High Alive 13 F/71 High Alive 14 F/20 High Dead 15 F/ 17 High Alive 16 F/29 High Alive 17 M/ 14 High Alive 18 M/24 High Alive 19 M/25 High Alive 20 M/2 1 High Alive 2 1 M/ 16 High Dead 22 F/ 16 High Alive 23 F/61 High Alive 24 M/ 19 High Dead 25 M/3 1 High Alive 26 M/38 High Alive 27 F/29 High Alive 28 F/ 16 High Alive 29 F/79 High Alive 30 F/ 16 High Dead 3 1 M/28 Normal Tissue – 32 M/28 Low Dead 33 F/58 High Dead 34 M/ 18 High Alive 35 M/2 1 High Dead 36 F/43 High Dead 37 M/ 18 High Alive 38 M/ 17 High Alive 39 M/2 1 High Dead 40 M/44 High Dead 4 1 M/2 1 High Dead
