식품미생물학실험 강의계획서
기본적인 미생물 배양 및 보존방법, 염색 및 현미경 관찰 술기 습득 식품관련 미생물의 취급(식품위생지표 및 발효식품제조) 방법을 실습 추후 식품관련 업무 수행 시 필요한 기초지식과 술기능력을 습득 출석 20% 참여도 20% 중간 30% 기말 30% 극동대학교 학사규정 실험참여 및 정리정돈 (7 주차까지)실험보고서 (보고서제출) 실험시험 일자 주제 1 주 08/29 실험의 기초 및 주의사항 전달과 조편성 2 주 09/05 배지이론 및 제조 ★1~2 조 청소 3 주 09/12 세균의 접종 및 관찰 ★3~4 조 청소 4 주 09/19 Gram 염색법(1~2 조) ★1~2 조 청소 // 3~4 조 휴강 5 주 09/26 추석연휴 6 주 10/03 개천절 7 주 10/10 Gram 염색법(3~4 조) ★3~4 조 청소 // 1~2 조 휴강 8 주 10/17 중간고사(실험보고서 제출) 9 주 10/24 위생지표미생물 검출 ★1~4 조 각자 정리정돈 10 주 10/31 식품의 생균수 측정법 숙지(1~2 조) ★1~2 조 청소 // 3~4 조 휴강 11 주 11/07 (실험시험) 식품의 생균수 측정(1 조) ★1 조 청소 // 2~4 조 휴강 12 주 11/14 (실험시험) 식품의 생균수 측정(2 조) ★2 조 청소 // 1, 3~4 조 휴강 13 주 11/21 식품의 생균수 측정법 숙지(3~4 조) ★3~4 조 청소 // 1~2 조 휴강 14 주 11/28 (실험시험) 식품의 생균수 측정(3 조) ★3 조 청소 // 1~2, 4 조 휴강 (보강) 12/05 (실험시험) 식품의 생균수 측정(4 조) ★4 조 청소 // 1~3 조 휴강 15 주 12/12 기말고사(실험시험보고서 제출) 제1주. 실험의 기초 및 주의사항
◈ 실험기구 1. 초자류 ① 시험관(test tube): 미생물 보존 및 배양. 실험목적 및 시료량에 따라 적 정 크기 선택 ② 플라스크(flask): 배지제조, 미생물 배양, 각종 반응실험에 사용. 눈금사용 유무에 따라 건조주의③ 슬라이드 글라스(slide glass)와 커버글라스(cover glass): 현미경 관찰시 사용
④ 배양접시(petri dish): 평판배양에 사용. 유리(멸균요함) 또는 플라스틱 (ethylene oxide gas로 멸균된 제품)
⑤ 피펫(pipette): 배지제조, 미생물 이식, 균수측정 등에 사용
⑥ 도말봉(spreader, conradi 봉): 미생물을 고루 펴서 접종 시 사용 ⑦ 기타 : 비이커(beaker), 깔대기(funnel), 실린더(mass cylinder) 등 2. 접종기구 ① 백금이(loop): 1백금이 균액 중량이 2mg이 되도록 고리의 크기제조. 효 모나 호기성 세균 접종 ② 백금구(went wire): 백금선의 앞 끝 2-3mm를 직각으로 구부린 것. 곰팡 이 등의 포자 접종 ③ 백금선(needle): 혐기성 세균의 고층배지 천자접종 3. 실험용 기기 ① 고압증기멸균기(autoclave): 배지 및 초자류 멸균(121℃, 15Lb, 15-20분) ② 건열멸균기(dry oven): 유리기구, 금속, 도자기 등의 멸균(150-200℃) ③ 배양기 또는 항온기(incubator): 접종 미생물의 배양. 곰팡이와 효모 25-30℃, 세균 30-37℃. 액체배지의 경우에는 진탕배양기 사용 ④ 무균상(clean bench): 무균실험대. 사용 전후 자외선등 작동 ⑤ 집락계수기(colony counter): 미생물 군락의 수를 측정
⑥ 항온수조(water bath): 멸균한 한천배지를 잠시 보관하는 경우 ⑦ 광학현미경(light microscope): 미생물 형태관찰
⑧ 기타: pH meter, 저울(balance), magnetic stirrer, vortex mixer, 온도계 (thermometer), 냉장고(refrigerator) ◈ 실험 시 주의사항(이에 대한 실천여부가 실험태도 평가점수에 포함됨!!!) 1. 실험복 착용, 실험실과 실험대 청결유지 및 소독, 실험대 위 필요 도구만… 2. 실험기구 취급 시 주의 및 실험기구 및 약품 등의 정리정돈 3. 실험실 내 흡연 및 음식물 섭취 금지 4. 실험 중 창문이나 출입문을 닫아 공기유통에 따른 잡균오염 방지 5. 실험과정을 상세히 기술하고 결과는 사실대로 기록 6. 실험에 사용된 미생물이나 재료 및 기타 폐기물은 멸균 후 처리 7. 실험기구의 청결한 세척 및 실험종료 후 전등, 가스, 수도, 전열기 전원확인
제2주. 배지이론 및 제조
◈ 멸균법(sterilization) 1. 화염멸균법(flame sterilization) ① 가장 확실하고 신속한 방법 ② 알코올 램프나 버너의 불꽃으로 직화멸균 ③ 접종기구나 시험관입구 등2. 건열멸균법(dry heat sterilization)
① 건열멸균기 150-170℃에서 0.5-2시간 ② 신문지나 호일에 싸서 멸균
③ 유리기구, 금속, 도자기 등
3. 고압증기멸균법(high pressure steam sterilization) ① 고온의 포화수증기 멸균(121℃, 15Lb, 15-20분) ② 신문지에 싸서 멸균
③ 배지, 기구 등
4. 여과멸균법(sterilization by filtration): 열에 불안정한 시료(효소, 당, 혈액 등) 5. 가스멸균법(gas sterilization): 살균성 가스(ethylene oxide, formaldehyde) 6. 조사멸균법(irradiation sterilization): X선, γ선, 자외선 등 조사 7. 화학제멸균법(chemical sterilization) ① 가열멸균이 불가능한 고무, 플라스틱, clean bench, 실험대 및 손 ② 70% ethanol, 역성비누 등 [Autoclave 사용법] I. 하부망(꼭지가 위로 오도록)을 넣고 증류수를 채운 뒤 배기밸브 잠근다. II. 멸균할 것을 금속망에 담아 멸균기안에 넣는다. III. 뚜껑 잠그고 적정조건(121℃, 15Lb, 15-20분)으로 조절 후 스위치 켠다. IV. 멸균이 끝나고 압력계가 0가 될 때까지 기다린다.
◈ 배지(medium) 1. 주요성분
① 펩톤(peptone): 탄소 및 질소원으로 거의 모든 배지에 포함 ② 육즙추출물(beef or meat extract), 효모추출물(yeast extract)
: 아미노산, 펩타이드, 유기산, 인산, 비타민, 헥산류 공급으로 주로 세균 ③ 맥아추출물(malt extract), 감자즙(potato extract)
: 당을 함유하며 곰팡이나 효모 배양에 필요 ④ 혈액(blood) 및 혈청(serum)
: Heme 성분을 필요로 하는 Haemophilus 속 등의 균주 배양 ⑤ 담즙(bile) 및 담즙산염(bile salt)
: 균의 증식을 억제 또는 촉진하는 증균배지나 감별배지 ⑥ 한천(agar) 해초류에서 추출한 다당체(agarose, agaropectin) 고도의 gel화 능력을 갖춘 고형화제로 1.5-2.0%로 배지에 첨가 90-95℃ 가열 시 용해, 40-45℃에서 응고 2. 종류 (1) 성분에 따른 분류 ① 천연배지(natural medium): 천연물질 제조, 미생물 증식, 분리, 배양용 ② 합성배지(synthetic medium): 화학적 성분이 분명한 순수물질로 제조한 최소영양배지로 미생물의 생화학적 성상, 균체성분, 대사 및 유전용 (2) 물리적 성상에 따른 분류
① 액체배지(liquid medium, broth): agar를 첨가하지 않은 배지로 미생물의 증식, 당분해, 생화학적 성상, 대사산물 검출용
② 고체배지(solid medium): 고형화를 위해 agar를 첨가한 배지로 집락의 형태관찰, 순수분리, 장기보관용
평판배지(plate medium): Petri dish에 4mm(15-20mL) 두께로 굳힌 것으로 미생물 분리, 배양, 집락관찰, 용혈능 및 항생제 감수성 검사 사면배지(slant medium): 시험관에 고체배지를 30°경사로 굳힌 것으
고층배지(stab medium): 시험관에 고체배지를 수직으로 굳힌 것으로 미호기성균과 혐기성균 배양, 균주보존, 세균 운동성 시험 ③ 반고체배지(semisolid medium): 젤리같은 형상으로 소량(0.3-0.5%)의 agar를 첨가하여 세균의 설탕 이용성이나 운동성 관찰용 (3) 사용목적에 따른 분류 ① 증식배지(growth medium): 여러 영양소를 적당량 함유하여 미생물 증 식, 순수배양, 보존 등 일반적인 목적에 사용 ② 증균배지(enrichment medium): 많은 균 중에서 특정 균종만을 빨리 증 식시켜 분리하고자 특정 물질(증식 촉진 혹은 억제)을 첨가 ③ 선택배지(selective medium): 두 가지 이상의 균 중에서 원하는 미생물 분리하고자 타균주 억제물질을 첨가 ④ 감별배지(differential medium): 균종의 감별과 동정을 위해 지시약 등의 화 학물질 첨가 3. 제조법 ① 평량: 필요한 배지량을 계산한 후 배지와 증류수를 정량 ② 용해: 플라스크나 비이커에 담고 가온용해 ③ pH 조절: 적정 pH 범위를 확인 후 필요하면 1N HCl or NaOH로 조정 ④ 분주: 용도에 따라 적당 용기에 분주 ⑤ 멸균: 121℃ 15기압에서 15-20분간 멸균 ⑥ 고정: 평판용은 petri dish, 사면용은 30°경사, 고층용은 꽂이에서… 4. 제조 시 주의사항 ① 배지를 담을 용기는 깨끗한 것으로 준비 ② 특별히 언급하지 않으면 증류수 사용 ③ 상품화된 배지는 보관법, 기간, 제조법, 멸균법 등을 준수 ④ 장시간 가열 또는 필요이상의 온도와 압력에서 배지성분 파괴주의 ⑤ 중탕 또는 가열한 배지는 투명해야 함(필요 시 여과) ⑥ 멸균 시 거품으로 넘칠 수 있기에 용기는 두 배 용량을 선택 ⑦ 시험관에 배지를 부을 때 위쪽 벽면에 묻지 않도록 주의 시험관 입구는 멸균 시 반드시 봉함
제3주. 세균의 배양과 균주보관법
재료 및 기구
1. 배지: NA, NB
2. 균주: E. Coli, Staphylococcus aureus 3. 재료: 80% glycerol, eppendorf tube
4. 기구: 삼각플라스크, petri dish, test tube, autoclave, incubator
실험방법 1. 배지제조: 평판배지(개인), 사면배지(조별), 액체배지(조별) 2. 접종: 화염멸균한 백금선을 공중에서 냉각 후 독립집락에서 1-3 백금이 취 해 접종 3. 배양: 37℃에서 24-48시간 배양 4. 균주보관: -20℃ 2시간 후 -70℃에 보관 ① 평판배지: 독립집락 부분을 배지와 함께 잘라 멸균 glycerol에 보관 ② 액체배지: 균주액과 glycerol을 반씩 취해 보관 미생물 접종법을 익히고자 각종 배지에 세균을 접종하고 배양 후 형성된 세균 의 집락과 증식형태를 관찰하며, 균주보존방법을 습득한다.
제4~7주. Gram 염색법
재료 및 기구
1. 균주: NA에 18-24시간 배양한 균주(E. Coli, Staphylococcus aureus)
2. 재료: Gram 염색시약(crystal violet, iodine solution, alcohol, safranine O), 멸균 증류수, 여과지 3. 기구: slide glass, 백금이, 알코올 램프, 현미경 실험방법 1. 도말: slide glass 위에 멸균 증류수를 도말 후 균주를 소량 도말 2. 건조: 자연건조 3. 고정: 불꽃에 타지 않도록 천천히 2-3회 통과
4. 염색: Crystal violet 1분 → 수세 → iodine 1분 → 수세 5. 탈색: Alcohol 30초 → 수세
6. 대조염색: Safranine O 1분 → 수세 → 여과지로 물기제거 후 검경
감별염색방법 중 하나로 네 가지 시약(염기성 염색액, 매염제, 탈색제, 대조 염색제)을 이용하여 Gram 양성균과 음성균으로 분류하는 방법인 Gram 염색 법을 익힌다.
제9주. 위생지표미생물 검출
□ 준비물
1. 시료: 조별로 각자 준비(액상)
2. 패트리필름(일반세균, 대장균, 대장균군, 곰팡이효모; 조별 배분) 3. 기타: 일회용 스포이드, 라텍스 장갑, 네임펜, 알코올램프, 킴와이프스 4. 기기류: vortex mixer, incubator (25℃, 35℃)
□ 방법
1. 패트리필름에 시료명, 실험일자, 실험자 적고, 액상시료 1 mL을 넣기
제10~15주. 식품의 생균수 측정
재료 및 기구
1. 배지 : PCA(평판배지, 액화 한천배지) 2. 재료 : 식품, 멸균 생리식염수
3. 기구 : 백금이, 콘라디봉, 멸균 tip, 삼각플라스크, petri dish, cap tube, vortex, autoclave, incubator
실험방법 1. 혼합희석평판배양법 ① 액화 한천배지 준비(굳지 않도록 항온수조에 보관) ② 시료 분쇄 : 시료 10 g + 생리식염수 90 mL ③ 현탁액 희석(단계별) : 시료 현택액 1 mL + 생리식염수 9 mL ④ Petri dish에 현탁액(단계별) 1 mL씩 분주 ⑤ 배지를 붓고 응고(뚜껑닫고 진행) 후 도치시켜 배양(37℃ 2-3일) 2. 평판도말배양법 ① 평판배지에 시료 현택액 1 mL을 분주 후 콘라디봉으로 분산 ② 도치시켜 배양(37℃ 2-3일)
생균수(viable cell count)는 식품 중 총 생균수가 아닌 일정 조건에서 형성 된 호기성균의 colony수로, 혼합희석평판배양법과 평판도말배양법을 이용하 여 시료 1 g 또는 1 mL당 생균수를 조사하는 방법을 익힌다.
