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연구노트
©The Korean Society of Food Science and Technology
미세먼지(PM
2.5)로 유도된 세포(비강, 폐, 뇌)독성에 대한
청각(Codium fragile)의 보호효과
김길한
1· 박선경
1· 강진용
1· 김종민
1· 신은진
1· 문종현
1·
김민지
1· 이효림
1· 정혜린
1· 허호진
1,*
1경상국립대학교 응용생명과학부(BK21), 농업생명과학연구원
Protective effect of Codium fragile extract on fine dust (PM
2.5)-induced
toxicity in nasal cavity, lung, and brain cells
Gil Han Kim1, Seon Kyeong Park1, Jin Yong Kang1, Jong Min Kim1, Eun Jin Shin1, Jong Hyeon Moon1, Min Ji Kim1, Hyo Lim Lee1, Hye Rin Jeong1, and Ho Jin Heo1,*
1Division of Applied Life Science (BK21), Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University
Abstract To evaluate the protective effect of Codium fragile on fine dust (PM2.5)-induced cytotoxicity, we investigated
its antioxidant activity and cell protective effect on PM2.5-exposed cells. The 40% ethanolic extract of C. fragile showed
the highest total phenolic content, whereas the water extract of C. fragile showed the highest total polysaccharide content.
The protective effect of the extracts on PM2.5-induced oxidative damage in nasal cavity (RPMI2650), lung (A549), brain
(MC-IXC), hippocampus (HT-22), and microglia (BV-2) cells was evaluated by measuring the intracellular reactive oxygen species (ROS) content and cell viability. The results showed that the 40% ethanolic extract more efficiently inhibited ROS
production than the water extract. In contrast, PM2.5-exposed cells treated with the water extract showed higher viability
than those treated with the 40% ethanolic extract.
Keywords: Codium fragile, fine dust, cell protection
서
론
산업화가 진행된 이후 지속적인 사회적 문제로 대두되어온 환 경오염과 질병 및 사망률의 증가는 유의적인 관련성을 보이는 것 으로 보고된다. 그중 미세먼지(particulate matter, PM)는 폐뿐만 아 니라 호흡기관 등을 통하여 다양한 조직으로 이동할 수 있다고 보고되면서, 인체 영향성이 가장 큰 환경오염 물질로 인식되고 있으며 이에 대한 국가 기준 또한 강화되고 있다(Hwang 등, 2005; Shin, 2007). 미국 환경 보호국(Environmental protection agency, EPA)에 따르면, 미세먼지는 대기 중에서 발견되는 고체 입자와 액체 방울의 혼합물을 아우르는 용어로 사용된다. 미세먼지는 다 양한 자연적, 인위적인 오염원에 따라 입자 크기와 물질로 구성 되어지며, 입자의 공기역학적 지름이 2.5 µm 이하인 미세먼지를 PM2.5로 명명한다(Lippmann 등, 2003). PM2.5중 질산염, 탄소, 암 모늄, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 및 금속(예; Fe. Al, Ca, Na, K, Mg, Pb 등)을 포함하는 유기 및 무기 화합물들은 인체 내 독성을 유발시키는 물질로 보고되고 있으며, 주요 발생원인은자동차의 연소 및 산업 활동 중에 발생되는 가스 및 고온 증기 의 응축으로부터 형성되는 것으로 알려져 있다(Block 등, 2009). 신체 조직에 침투한 미세먼지는 reactive oxygen species (ROS) 생 성을 통해 산화적 손상을 유도하는 것으로 보고되고 있다. 일정 수준 이상의 산화적 스트레스는 MAP 인산화 효소(mitogen-activated protein kinase, MAPK)와 핵인자 카파비(nuclear factor kappa light chain enhancer, NF-κB)와 같은 염증 관련 사이토카인 을 발현시키고 염증반응을 유도하게 된다. 높은 수준의 산화적 스트레스에 노출되면 pro-apoptotic factor를 방출하고 최종적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Song 등, 2016). 또한, 미세먼지의 입자 크기에 따른 인체 영향성이 다른 것으로 보고 되고 있는데, 약 5~10 µm의 입자는 비강을 통해 호흡기 내로 침 투할 수 있으며, 기관지에 침착될 가능성이 높다. 특히, 1 µm 미 만의 입자는 폐 세포까지 침투하여 세포조직 및 순환계를 통하 여 이동할 수 있다(Kim 등, 2015). 또한, 비강 상피 세포를 통해 후각전구(olfactry bulb)로 이동한 미세먼지는 뇌 세포에 직접적으 로 침투하는 것으로 보고되고 있으며, 미세먼지에 노출된 BALB/ c 마우스의 뇌에서는 염증성 사이토카인의 발현량 증가가 확인 되었다(Campbell 등, 2005; Cheng 등, 2016). 미세먼지에 포함된 전위 금속들은 세포 내·외부에서 ROS 생산을 유도하고, DNA 산화 및 단백질 손상을 유도함으로써 인지기능 저하를 유발할 수 있다(Valavandis 등, 2008; Xia 등, 2007). 이러한 미세먼지 노출 에 의한 다양한 조직(비강, 폐, 뇌) 위험성에도 불구하고, 미세먼 지에 대응할 수 있는 예방 소재에 관한 연구는 상대적으로 부족 한 실정이다.
*Corresponding author: Ho Jin Heo, Division of Applied Life Sci-ence (BK21), Institute of Agriculture and Life SciSci-ence, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea
Tel: +82-55-772-1907 Fax: +82-55-772-1909 E-mail: hjher@gnu.ac.kr
Received December 31, 2020; revised February 10, 2021; accepted February 22, 2021
224 한국식품과학회지 제 53 권 제 2 호 (2021) 청각(Codium fragile)은 깃털말목 청각과에 속하는 녹조류의 일 종으로 동아시아, 오세아니아 및 북유럽 해안에 널리 분포하는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2013). 청각은 우리나라에서 과거부 터 식용, 약용으로 사용됐으며, 오늘날에도 한국, 중국, 일본, 하 와이, 그리고 아프리카 등에서 식용으로 사용되고 있다. 청각 물 추출물은 항부종, 항염증, 피부보호 등 다양한 생리 활성을 가지 고 있는 것으로 보고되고 있다(Lee 등, 2017; Moon 등, 2018). Yoon 등(2011)의 연구에 따르면 청각 96% 에탄올 추출물은 대식 세포(Raw264.7)에서 지질다당류에 의해 발현된 고리형 산화효소-2
(cyclooxygenase-2, COX-2), 산화질소 합성효소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS), 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)와 같은 전염증성 사이토 카인과 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 및 산화질소(NO)와 같은 전 염증 매개체 수준을 효 과적으로 억제하는 것으로 보고되었다. 청각이 갖는 일부 염증 모델에 대한 연구가 나타나고 있지만, 미세먼지로 유도될 수 있 는 산화적 스트레스와 호흡기 및 뇌 세포 등에서의 보호효과에 대한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 미세먼지(PM2.5)로 발생되는 산화적 독성이 중요한 유입경로에 해
당되는 비강(RPMI2650), 폐(A549), 뇌신경(MC-IXC), 해마(HT-22) 및 미세아교세포(BV-2) 5종의 세포에 대한 독성과 미세먼지 유 도성 질환에 대한 예방 소재로서의 청각의 생리활성 효과를 확 인하고자 하였다.
재료 및 방법
재료 및 추출물 제조 본 실험에 사용된 청각(C. fragile)은 2018년 2월 전남 여수시 에서 채취된 것을 사용하였다. 염분 및 불순물을 제거하기 위하 여 수세하고 동결건조기(ILshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)에서 건조시킨 후, 분말화하여 냉동 보관하였다. 건조된 시료 20 g을 각각 물 (증류수), 20, 40, 60, 80, 95% 에탄올을 가한 뒤, 40oC에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하였고, 이를 No. 2 거름종이 (Whatman Inc, Kent, UK)를 이용하여 여과 및 농축하여 동결건 조한 뒤 –20oC에 보관하면서 실험에 사용하였다(Park 등, 2019).
총 페놀성 화합물 함량
총 페놀성 화합물 함량은 시료액 1 mL과 증류수 9 mL을 혼합 한 후 Folin & Ciocalteu's phenol reagent 1 mL를 넣고 실온에서 5분간 반응시킨 뒤 7% 탄산나트륨 용액 10 mL를 넣고 25 mL 정 용 플라스크를 이용하여 증류수로 정용하였다. 반응액을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤, UV-spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이후 동일한 방법으로 측정된 gallic acid의 검량곡선을 이용하여 계산하였고, 이를 mg gallic acid equivalents (GAE)/g of dried weight로 나타내었다(Kim 등, 2003).
총 polysaccharide 함량 측정 총 polysaccharide 함량은 시료액 0.2 mL, 5% phenol 용액 0.2 mL, sulfuric acid 1 mL을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤, UV-spectrophotometer(UV-1201, Shimadzu)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 polysaccharide 함량은 동일한 방법으로 측정된 glucose의 검량곡선을 이용하여 계산하였다(Park 등, 2020). 지방질 과산화물 생성 억제 효과 지방질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 생성 억제 효과는 4
주령 수컷 ICR 마우스(Samtako, Osan, Korea)를 구입 후, 뇌를 적 출하여 실험에 사용하였다. 본 실험은 경상대학교 동물윤리심의 위원회로부터 승인(인가번호: GNU-181019-M0054)을 받아 진행 하였다. 적출한 뇌 조직은 20 mM 트리스 염산 완충용액(pH 7.4) 을 가하고 조직파쇄기(Storm 24, Next Advance Inc., Troy, NY, USA)를 사용하여 균질화한 뒤, 10,000×g에서 10분 동안 원심분 리한 상등액을 이용하였다. 추출물에 뇌 조직 상등액, 10 μM FeSO4(II), 0.1 mM ascorbic acid을 혼합하여 37oC에서 1 시간 동 안 반응시켰다. 반응 후, 30% trichloroacetic acid와 1% thiobarbituric acid를 첨가하여 95oC의 항온 수조에서 20분 동안 가열하였다. 최 종 반응물은 원심분리(10,000×g, 10 min)하여 상층액을 UV-spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu)를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다(Park 등, 2020).
세포 배양
본 실험에 사용된 폐세포(A549)와 비강세포(RPMI2650)는 한국 세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 구입하였으며, 뇌신경 세포(MC-IXC)는 American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA)로부터 구매하여 사용하였다. BV-2세포는 한국식품연 구원으로부터 HT-22세포는 경상대학교 수의과대학 조직학실험실 에서 분양받았다. BV-2 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (P/S)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM)배지 를 사용하였다. RPMI2650세포는 10% 소태아혈청, 1% 50 units/ mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(P/S)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640 배지를 사용하였다. A549 세 포와 HTe-22 세포는 10% 새끼소 혈청(bovine calf serum), 1% P/S가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 그리고 MC-IXC 세포 는 10% 소태아 혈청, 1% P/S가 포함된 minimum essential medium (MEM) 배지를 배양액으로 하여 배양하였다. 실험에 사 용된 미세먼지는 Arizona test dust를 powder technology Inc. (Arden Hills, MN, USA)로 부터 구입하였으며, phosphate buffer saline에 현탁하여 실험에 이용하였다. 세포 내 산화적 스트레스 측정 세포 내 산화적스트레스를 측정하기 위해 96 well에 세포를 분 주하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 청각 추출물을 전처리하고 30분 뒤, 미세먼지(PM2.5)를 추가 처리하였다. 미세먼 지 처리 24시간 후, 50 μM DCF-DA를 처리하여 40분간 배양하 고 형광광도계(Infinite F200, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사 용하여 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다(Park 등, 2019). 세포 생존율 측정 세포 생존율 측정을 위하여 청각 추출물 전처리 후, 미세먼지를 처리한 세포에 MTT stock 용액 10 μL를 처리하여 2시간 동안 반응 시키고, 배지를 모두 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 20분간 상온에서 반응시킨 뒤 570 nm (determination wavelength)와 690 nm (reference wavelength)에서 흡광도를 측정하였다(Park 등, 2019). 통계처리
통계처리는 SAS 9.4 version (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(analysis of variance)을 실시하며, Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)으로 유의 성을 검정하였다.
결과 및 고찰
총 페놀성 화합물 및 총 polysaccharide 함량 측정
총 페놀성 화합물 함량 측정 결과는 Fig. 1A와 같다. 총 페놀 성 화합물 함량은 청각 40% 에탄올 추출물에서 376.33 mg GAE/ g of dried weight로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 60% 에탄올 추출물(201.33 mg GAE/g of dried weight), 80% 에탄올 추출물 (143.00 mg GAE/g of dried weight), 20% 에탄올 추출물(124.66 mg GAE/g of dried weight), 물 추출물(118.00 mg GAE/g of dried weight), 95% 에탄올 추출물(38.00 mg GAE/g of dried weight) 순으로 높은 함량을 나타냈다. 총 polysaccharide 함량을 분석한 결과 총 페놀성 화합물 함량 에서 상대적으로 낮은 함량을 나타냈던 물 추출물과 20% 에탄 올 추출물에서 각각 46.31%, 29.86%로 높은 함량을 나타냈으며, 60% 에탄올 추출물에서 13.47%, 40% 에탄올 추출물에서 12.28%, 95% 에탄올 추출물에서 6.16%, 80% 에탄올 추출물에서 4.87% 순으로 높은 함량을 나타냈다(Fig. 1B). 지방질과산화 억제 효과 청각 추출물의 지질과산화물 생성 억제효과를 측정한 결과는 Fig. 1C와 같다. 청각 40% 에탄올 추출물과 60% 에탄올 추출물 에서 54.46, 52.57%로 높은 활성을 나타냈으며, 물 추출물 및 20% 에탄올 추출물에서는 활성이 거의 나타나지 않았다. 미세먼지는 인체 내 유입 시 산화적 세포 독성을 나타내는 것 으로 알려져 있으며, 그 결과로써 다양한 조직(뇌, 간, 신장)에서 지질과산화물 생성하는 것으로 보고되고 있다(Araujo 등, 2008; Hajipour 등, 2020). Kim 등(2015)의 연구에 따르면, 청각 에탄올 추출물의 in vitro 항산화 활성(ABTS/DPPH 라디칼 소거활성, superoxide dismutase 활성, reducing power, MDA 생성억제)은 총 페놀성 화합물 함량과 높은 관련성이 있는 것으로 보고하였다. 비록 물 추출물에서의 MDA 생성억제 효과가 상대적으로 미흡 하였지만, Kolsi 등(2017)의 연구에 따르면 물 추출물에서 높은 함량을 나타내는 sulfated polysaccharide의 식이가 고지방 식이로 유도된 비만 wistar rats 모델에서 간과 신장에서의 지질과산화물 생성을 효과적으로 억제한다고 보고하였다. 이에 따라, 청각의 주 요 생리활성물질인 polysaccharide 함량이 우수하게 나타난 물 추 출물과 총 페놀성 화합물 함량 및 지질과산화 활성이 우수하게 나타난 40% 에탄올 추출물의 미세먼지 유도성 산화적 손상에 대 한 세포 보호효과를 확인하였다. 미세먼지(PM2.5) 유도성 세포 내 ROS 생성 억제 효과 미세먼지 처리로 유도된 세포독성에 대한 세포보호효과를 확 인 함에 앞서, 청각 물 추출물과 40% 에탄올 추출물 단독처리를 통하여 비강(RPMI2650), 폐(A549), 뇌신경(MC-IXC)세포주에서의 시료 독성을 평가하였다. 청각 추출물의 단독 처리는 100 μg/mL 농도까지는 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였고, 최 대 농도를 100 μg/mL로 설정하여 실험을 진행하였다(data not shown). 비강세포(RPMI2650)에서 미세먼지 처리 군(695.15%)에서는 대 조군(100%) 대비 약 6.9배 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈 Fig. 1. Total phenolic contents (A), total polysaccharide content (B), and inhibitory effect of malondialdehyde (MDA) production (C) of extracts from Codium fragile. Data were analyzed using ANOVA with Duncan’s SAS and expressed as mean±SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical difference.
226 한국식품과학회지 제 53 권 제 2 호 (2021) 으며, 양성대조군(ascorbic acid)은 약 112.05%로 효과적으로 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(Fig. 2A). 청각 물 추출물과 40% 에탄올 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 세포 내 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였으며, 100 μg/mL 농도에서 는 각각 221.49, 202.71%로 나타났다. 폐세포(A549)에서 미세먼지 처리군(1329.13%)은 대조군(100%) 대비 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈다(Fig. 2B). 반면, 청각 물 추출물 및 40% 에탄올 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였다. 특히, 40% 에탄올 추출물 100 μg/mL 농도에서는 299.50%로 ROS 생성량을 감소하는 것으 로 확인되었으며, 이는 양성대조군(518.54%)과 비교시에도 높은 ROS 생성 억제효과를 나타냈다. 뇌신경세포(MC-ⅨC)에서 미세먼지 처리군(465.66%)은 대조군 (100.00%) 대비 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대 조군에서는 119.78%로 높은 억제 효과를 나타냈다(Fig. 2C). 20 μg/mL이상 농도에서 두 가지 추출물 모두 미세먼지 처리군보다 낮은 ROS 함량을 나타냈으며, 물 추출물(216.60%)과 40% 에탄 올 추출물(125.69%)은 100 μg/mL에서는 미세먼지 처리군 대비 우 수한 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다. 뇌 해마세포(HT-22)에서 미세먼지 처리군(800.77%)은 대조군 Fig. 2. Intracellular ROS content of water and 40% ethanolic extracts from Codium fragile on PM2.5-induced oxidative stress
in RPMI2650 (A), A549 (B), MC-IXC (C), HT-22 (D), and BV-2 (E) cells. Data were analyzed using ANOVA with Duncan’s SAS and expressed as mean±SD (n=3). Data were statistically considered at p < 0.05, and different small letters represent statistical difference.
(100%) 대비 증가된 ROS 생성량을 보였으며, 양성대조군으로 사 용된 ascorbic acid에서는 97.65%로 대조군과 유사한 세포 내 ROS 생성량을 나타냈다(Fig. 2D). 청각 물 추출물에서는 100 μg/ mL에서 440.96%로 미세먼지군 대비 44.93% 감소된 함량을 나타 냈다. 청각 40% 에탄올 추출물에서는 10 μg/mL 농도 이상에서 감소하는 경향을 나타냈으며, 100 μg/mL 농도에서는 미세먼지 처 리군 대비 약 59.64% 억제되는 효과를 나타냈다. 미세아교세포(BV-2)에서 미세먼지 처리군(312.15%)은 대조군 (100%) 대비 약 3.12배 높은 ROS 생성량을 보였으며, 양성대조 군에서는 78.54%로 유의적으로 높은 세포 내 ROS 생성 억제효 과를 나타냈다(Fig. 2E). 청각 추출물은 농도가 증가함에 따라 세 포 내 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였으며, 물 추출물은 20 μg/mL에서 136.27%, 40% 에탄올 추출물은 100 μg/mL에서 144.83%로 높은 세포내 ROS 생성 억제효과를 나타냈다. 미세먼지(PM2.5) 유도성 세포사멸 억제 효과 비강세포(RPMI2650)에서 미세먼지 처리군(63.37%)에서는 대조 군(100.00%)대비 약 36.63%의 세포 사멸이 유도되었다. 양성대조 군(ascorbic acid)과 청각 추출물(물, 40% 에탄올)에서는 미세먼지 처리군 대비 유의적인 세포 생존율의 증가는 확인되지 않았다. 폐세포(A549)에서 미세먼지 처리군(74.59%)에서는 대조군(100%) 대비 약 25.41% 세포사멸이 유도되었으며, 양성대조군은 102.31% Fig. 3. Cell viability of water and 40% ethanolic extracts from Codium fragile on PM2.5-induced cytotoxicity in RPMI2650 (A), A549 (B), MC-IXC (C), HT-22 (D), and BV-2 (E) cells. Data were analyzed using ANOVA with Duncan’s SAS and expressed as mean±SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical difference.
228 한국식품과학회지 제 53 권 제 2 호 (2021) 로 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타냈다(Fig. 3B). 청각 물 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하는 경 향을 보였으며 100 μg/mL 농도에서 132.05%를 나타냈다. 40% 에 탄올 추출물에서는 20 μg/mL 농도에서 세포 생존률 119.95%를 나타냈다. 뇌신경세포(MC-IXC)에서 미세먼지 처리군(65.06%)은 대조군 (100.00%) 대비 약 34.94% 감소된 세포 생존율을 나타냈으며, 양 성대조군에서는 90.74%로 증가한 세포 생존율을 나타냈다(Fig. 3C). 청각 추출물 처리군에서는 40% 에탄올 추출물 대비 상대적 으로 물 추출물이 우수한 세포 생존율을 나타냈으며, 물 추출물은 5 μg/mL (118.93%), 40% 에탄올 추출물은 20 μg/mL (99.60%)의 농도에서 대조군과 유사한 생존율을 나타냈다. 해마세포(HT-22)에서 미세먼지 처리군(80.57%)은 대조군 대비 약 19.43% 세포 생존율이 감소하였으며, 양성대조군에서는 96.21% 로 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타냈다(Fig. 3D). 청각 물 추출물은 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하는 경향을 보였고, 5 μg/mL (97.71%)농도에서 대조군과 유사한 세포 생존율 을 나타냈다. 반면 40% 에탄올 추출물의 경우에는 1 μg/mL에서 는 97.82%로 대조군과 유사한 세포 생존율을 보였지만, 농도가 증가함에 따라서 감소되는 경향을 보였다. 미세아교세포(BV-2)에서 미세먼지 처리군(22.40%)은 대조군 (100%) 대비 약 77.60% 낮은 세포 생존율을 보였다. 청각 40% 에탄올 추출물은 농도에 상관없이 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 물 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였고, 100 μg/mL에서 96.25%로 높은 세포 생존율을 나타냈다. 반면, 양성대조군에서는 17.77%의 세포 생존 율을 나타냈는데, Oh 등(2017)의 연구결과에서도 ascorbic acid가 BV-2 세포의 세포 생존율 영향을 미치는 것으로 보고하였다. 미세먼지로 인한 세포독성의 주요 메커니즘은 ROS 생성에 의 한 DNA 산화 및 단백질 손상 등으로 보고되고 있다. 퀴논 및 다환 방향족 탄화수소와 같은 유기 탄소 화합물은 미세먼지의 주 요 산화-환원 활성 인자로써 cytochrome P450 환원 효소에 의해 산소라디칼과 같은 ROS를 형성한다. 또한, 미세먼지에 포함될 수 있는 전위 금속들은 세포 내·외부에서 ROS 과잉 생산에 기여할 수 있으며, 이들은 DNA 산화 및 단백질 손상을 유발함으로써 세 포 손상 및 기능 저하를 유발하게 된다(Valavandis 등, 2008; Xia 등, 2007). 본 연구에서 40% 에탄올 추출물은 총 페놀성 물질 함량, 지질 과산화 억제 효과에서 물 추출물 대비 우수했고, 미세먼지 유도 성 세포 내 ROS생성 억제 효과에서는 물 추출물과 유사하거나 더 높은 활성을 보였다. 하지만, 미세먼지로 유도되는 세포사멸 억제효과 측정에서 40% 에탄올 추출물의 경우 뇌 신경세포(MC-IXC)를 제외한 모든 세포에서 세포 생존률에 영향을 미치지 않 거나(RPMI2560, BV-2 cell) 처리 농도가 높아짐에 따라서 오히려 일정 수준의 세포독성(A549, HT-22 cell)을 나타내는 것으로 확 인되었다. 반면, 물 추출물의 경우, 비강세포(RPMI2650)를 제외 한 모든 세포에서 뚜렷한 세포사멸 억제효과를 나타내는 것을 확 인하였다. 일반적으로 해조류의 생리활성은 dieckol과 같은 polyphenol로 부터 기인하는 것으로 추정되어 왔지만, 최근 연구 에서는 해조류가 포함하고 있는 다양한 polysaccharide 또한 해조 류의 주요 생리활성물질로 밝혀지고 있고 그로 인해 다양한 연 구가 진행되고 있는 추세이다(Juárez-Portilla 등, 2019). Wang 등 (2020)의 연구에서 청각 효소 분해물로부터 분리한 sulfated polysaccharide는 신장(Vero)세포에서 H2O2로 유도된 산화적 스트 레스로 인한 세포 사멸 및 ROS 함량을 유의적으로 감소시켜 주 었으며, zebrafish 배아를 이용한 in vivo 모델에서 H2O2로 유도된 ROS 함량 수준, 세포사멸 및 지질 과산화를 유의적으로 감소시 키는 것으로 확인되었다. 이러한 물 추출물의 우수한 세포보호 효과는 청각의 sulfated polysaccharide와 같은 생리활성물질에서 기인된 효과로 유추된다. 본 실험의 결과를 종합하여 볼 때, 청각은 미세먼지의 유입경 로에 해당하는 비강, 폐, 뇌(신경, 해마, 미세아교) 조직의 세포보 호 및 기능 개선 등에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 다 만, 청각 40% 에탄올 추출물의 경우 고농도에서 일부 세포독성 이 나타남에 따라 물 추출물에 대한 잠재적 활용 가치가 높을 것 으로 판단되며, 이는 in vivo 동물모델 연구 및 생리활성 물질분 석과 같은 추가적인 연구를 통해 밝혀질 필요가 있다.
요
약
본 연구에서는 미세먼지로 유도될 수 있는 질환에 대한 예방 소재로써 청각(C. fragile)의 산업적 활용 가능성을 확인하고자 하 였다. 청각의 총 페놀성 화합물 함량 및 지방질과산화 억제 효과 는 40% 에탄올 추출물이 가장 우수한 결과를 나타냈고, 총 polysaccharide 함량에서는 물 추출물이 가장 높은 함량을 나타냈 다. 미세먼지 유도성 산화적 손상에 대한 비강(RPMI2650), 폐 (A549), 뇌신경(MC-IXC), 해마(HT-22), 미세아교(BV-2)세포에서의 세포보호 효과를 검증하기 위하여 세포 내 ROS 형성 억제 효과 와 세포사멸 억제 효과를 측정하였다. 세포 내 ROS 형성 억제 효과 실험 결과에서 40% 에탄올 추출물이 전반적으로 우수한 활 성을 나타내는 것으로 확인되었다. 세포사멸 억제 효과 실험 결 과에서는 물 추출물이 전반적으로 우수한 세포 생존율을 나타냈 고, 40% 에탄올 추출물은 뇌신경세포(MC-IXC)을 제외한 세포에 서 사멸 억제 효과가 미비하거나 농도가 높아짐에 따라서 세포 독성을 일부 갖는 것으로 확인되었다. 결과적으로, 청각 추출물 은 비강, 폐, 뇌(신경, 해마, 미세아교) 세포에서 미세먼지로 유도 된 산화적 손상을 효과적으로 억제할 수 있는 천연 소재로서 산 업적 활용 가능성이 기대된다.감사의 글
본 연구는 정부의 재원으로 한국연구재단의 개인기초연구 (2018R1D1A3B07043398)의 지원을 받아 수행된 결과로 이에 감 사드립니다.References
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