Genistein-Induced Potentiation Effect on Glucose-Stimulated Insulin Secretion (GSIS) in INS-1 β-cells

(1)

(2)

이

이학

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

I

IN

N

NS

S

S-

-

-1

1 1베

베

베타

타

타 세

세

세포

포

포에

에

에서

서

서 G

G

Ge

e

en

n

ni

i

is

s

st

t

te

e

ei

i

in

n

n에

에

의

의한

한

한 포

포

포도

도

도당

당

당 자

자

자극

극 인

극

인

인슐

슐

슐린

린

린 분

분

분비

비

비 항

항

항진

진

기

기작

작

작 연

연

연구

구

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

의

의 학

학

학 과

과

이

이 수

수

수 진

진

(3)

I

IN

N

NS

S

S-

-

-1

1 1베

베

베타

타

타 세

세

세포

포

포에

에

에서

서

서 G

G

Ge

e

en

n

ni

i

is

s

st

t

te

e

ei

i

in

n

n에

에

의

의한

한

한 포

포

포도

도

도당

당

당 자

자

자극

극 인

극

인

인슐

슐

슐린

린

린 분

분

분비

비

비 항

항

항진

진

기

기작

작

작 연

연

연구

구

지

지도

도

도교

교

교수

수

수 강

강

엽

이

이 논

논

논문

문

문을

을

을 이

이학

이

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

문으

으

으로

로 제

로

제

제출

출

출함

함

함.

.

2

20

0

00

0

07

7 7년

년

8

8 8월

월

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

의

의 학

학

학 과

과

이

이 수

수

수 진

진

(4)

이

이수

수

수진

진

진의

의 이

의

이

이학

학

학 석

석

석사

사

사학

학

학위

위

위 논

논

논문

문

문을

을

을 인

인

인준

준

준함

함

함.

.

심

심사

사

사위

위

위원

원

원장

장

강

엽

인

심

심 사

사

사 위

위

위 원

원

이

이 관

관

관 우

우

인

심

심 사

사

사 위

위

위 원

원

이

이 수

수

수 환

환

인

아

아 주

주

주 대

대

대 학

학

학 교

교

교 대

대

대 학

학

학 원

원

2

20

0

00

0

07

7 7년

년

년 6

6 6월

월

월 2

2

25

5 5일

일

(5)

-국문요약-I

I

IN

N

NS

S

S-

-

-1

1 1베

베타

베

타

타 세

세

세포

포

포에

에

에서

서

서 G

Ge

G

e

en

n

ni

i

is

s

st

t

ti

i

ie

e

en

n

n에

에

에 의

의

의한

한

포

포도

도

도당

당

당 자

자

자극

극

극 인

인

인슐

슐

슐린

린

린 분

분

분비

비

비 항

항

항진

진

진 기

기

기작

작

작 연

연

연구

구

제2형 당뇨병의 특징은 인슐린 분비 이상과 인슐린 저항성이다.인슐린 분비 이상의 교정과 인슐린 작용의 개선은 제2형 당뇨병의 치료에서 중요하다. surfonylurea는 과거부터 제2형 당뇨병 환자에서 인슐린 분비를 촉진하는 약제로

사용되어 왔지만 포도당 비의존적 약물로서 저혈당 (hypoglycemia)에 빠질 위험

이 있으며,오랜 기간 노출될 경우 베타 세포에 독성을 나타낸다.그러므로 포도 당 의존적 인슐린 분비 약제의 개발이 필요하다.

Genistein은 콩과식물 씨앗에서 분리된 물질로써 식물성 estrogen 기능과

tyrosinekinase를 억제하는 기능뿐만 아니라 동물 모델에서 인슐린 분비를 항진

하는 효과를 가지고 있다.Genistein이 pancreaticINS-1베타 세포에서 포도당

의존적으로 인슐린 분비를 항진하는 사실은 이미 보고되었지만 인슐린 분비 항 진에 관여하는 신호 전달 기작에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않았다.그러므로

본 연구에서는 genistein에 의해 항진되는 인슐린 분비 기작을 밝히고자 한다.

첫 번째로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과가 다른 인슐린 분비 촉진

물질에도 있는지 조사하였다.L-leucine/L-glutamine(Leu/Gln),pyruvate와 같은

영양분에 의한 인슐린 분비에서 genistein에 의한 분비 항진 현상이 나타났으며,

tolbutamide,KCl,BayK8644와 같이 단순히 Ca2+_{유입의 증가만을 유발하는 약}

제에서는 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상이 나타나지 않았다.따라서

genistein은 인슐린 분비를 유발하는 triggering pathway 단계보다는 인슐린 분

비를 강화시켜주는 amplifying pathway를 증가시킬 것으로 생각된다. 또한,

genistein은 surfonylura로 알려진 glimepiride에 의해 유도되는 인슐린 분비를 항

(6)

두 번째로 인슐린 분비에 관여하는 대표적인 amplifying pathway 신호 protein kinase A (PKA),protein kinase (PKC),Ca2+_/Cal_modul_i_{n ki}_{nase Ⅱ}

(CaMK Ⅱ)와 genistein과의 연관성을 알아보고자 저해제 (Pharmacological

inhibitor)를 사용하여 연구를 수행하였다.CaMK Ⅱ 저해제들은 genistein에 의

한 인슐린 분비 항진 현상을 감소시키는 반면 PKA,PKC 저해제들은 genistein

에 의한 인슐린 분비 항진 현상을 감소시키지 않았다.Immunoblotting 실험에서

genistein에 의해 CaMK Ⅱ의 활성이 증가했지만 PKA,PKC는 활성이 증가되지

않는 결과를 얻었다.

세 번째로 genistein에 의해 유도되는 CaMK Ⅱ의 활성에 Ca2+_{의 영향을 조사}

하기 위해 genistein을 처리하고 세포 내 Ca2+_{양을 조사해 보았다.Geni}_stei_n을

처리하면 Leu/Gln,glimepiride에 의해 유도되는 세포 내 Ca2+_{양이 더욱 증가 되}

었다.

네 번째로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과가 genistein이 가지는 식물

성 estrogen 기능 또는 tyrosinekinase을 억제하는 기능 때문인지를 알고자 β

-estradiol과 tyrosinekinase억제 기능을 가진 다른 약제 tyrphostin 25를 사용

하여 실험을 수행하였다.β-estradiol을 처리 하였을 때 인슐린 분비가 더 항진되

는 효과는 나타나지 않았다.Tyrphostin25를 처리하였을 때 genistein과 마찬가

지로 Leu/Gln에 의한 인슐린 분비 항진 효과는 나타났지만 glimepiride에 의한

인슐린 분비 항진 효과는 나타나지 않았다.그러므로 genistein에 의한 인슐린 분

비 항진 효과는 tyrosinekinase를 억제하는 기능이 아닌 다른 활성에 의해서 항

진되었을 것으로 생각된다.

마지막으로 CaMK Ⅱ를 과발현시킨 세포를 이용한 실험에서 CaMK Ⅱ를 과발

현시키면 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상이 더욱 증가하였으며 CaMK

Ⅱ 활성 또한 증가하였다.

결론적으로 genistein은 Ca2+_{매개 CaMK Ⅱ 활성을 통해 인슐린 분비를 항진}

시키며 genistein은 포도당 의존적 인슐린 분비 항진 제로서 당뇨병 치료에 기여

(7)

핵심어:Genistein,Glucosestimulatedinsulinsecretion(GSIS),Ca2+_/Cal_modul_i_n

(8)

차

례

국문 요약 ···ⅰ 차 례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅴ 약 어 표 ···ⅶ Ⅰ. 서 론 ···1 A.제 2형 당뇨병 ···1 B.인슐린 합성과 분비 ···2 1.인슐린 생합성 ···2 2.인슐린 분비 ···2 C.인슐린 분비 기작 ···5

1.Triggeringpathway ···5

2.Amplifyingpathway ···6

D.인슐린 분비 촉진 ···9 1.Surfonylurea···9 2.GLP-1···10 E.Genistein···10 F.연구목적 ···11 Ⅱ.재료 및 방법 ···13 A.재 료 ···13 1.재 료 ···13 B.방 법 ···13 1.세포주 및 세포 배양 ···13 2.인슐린 정량 ···14

(9)

4.세포 내 Ca2+_{량 측정 ·}_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·15

5.westernblotting···15

6.Transfection···16

7.RT-PCR···16

Ⅲ.결 과 ···18

A.INS-1베타 세포에서 Genistein에 의한 인슐린 분비 항진 양상 ···18

B.Genistein에 의한 인슐린 분비 항진 효과 ···20

C.인슐린 분비 이상에서 Genistein의 역할 ···23

D.Genistein에 의한 인슐린 생합성량 변화 ···25

E.Genistein에 의한 ATP 합성량 조사 ···26

F.Genistein에 의한 세포 내 Ca2+_{변화 ·}_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·27

G.Genistein에 의한 인슐린 분비 항진에 관련된 기작 조사 ···28

1.Leu/Glnmodel···35

2.Glimepiridemodel···36

H.Genistein이 가지는 다른 기능이 인슐린 분비에 미치는 영향 조사 ····39

I.Ca2+_/Cal_modul_i_{n(CaMK Ⅱ)유전자 과발현 세포주 ·}_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·_·42

IV.고 찰 ···45

참고 문헌 ···48

(10)

그

그림

림

림 차

차

차례

례

Fig.1. Glucose-stimulatedbiphasicinsulinreleaseinratislets.···5 Fig.2. insulinexocytosis.···5 Fig.3. Mechanism ofinsulinsecretioninpancreatic β-cell···8 Fig.4. Potentiationeffectofgenisteinonglucose-stimulatedinsulin

secretion(GSIS)inINS-1cells.···19 Fig.5. Potentiationeffectofgenisteinonnutrient-stimulatedinsulin

secretion.···21 Fig.6. Potentiationeffectofgenisteinonvariousinsulin

secretagogues-stimulatedinsulinsecretion···22 Fig.7. PotentiationeffectofgenisteinonGSIS indesensitized

INS-1cells···24 Fig.8. EffectGenisteinoninsulinsynthesis.···25 Fig.9. EffectGenisteinonATP production.···26 Fig.10. Effectofgenisteinon[Ca2+_]

i.···27 Fig.11. Effectofdifferentpharmacologicalagentongenistein

-inducedpotentiationofinsulinsecretion ···31 Fig.12. InvolvementofPKA ingenistein-inducedpotentiationof

insulinsecretion.···32 Fig.13. InvolvementofPKC ingenistein-inducedpotentiationof

insulinsecretion.···33 Fig.14. InvolvementofCaMK Ⅱ ingenistein-induced

potentiationofinsulinsecretion.···34 Fig.15. Effectofdifferentpharmacologicalagentsongenistein

-inducedpotentiationofinsulinsecretion.···37 Fig.16. InvolvementofCaMK Ⅱ ingenistein-induced

(11)

potentiationofinsulinsecretion. ···38 Fig.17. Potenentiationeffectoninsulinsecretionis

genistein-specific.···40 Fig.18. Over-expressionofCa2+_/Cal_modul_i_{n(CaMK Ⅱ)i}_nINS-1cel_l_s.

(12)

약

약 어

어

어 표

표

I IIDDDDDDMMM IIInnnsssuuullliiinnnDDDeeepppeeennndddeenenntttDDDiiiaaabbbeeetttssMsMeMeelllllliiitttuuusss N NNIIIDDDDDDMMM NNNooonnnIIInnsnsusuullliiinDnnDDeeepppeeenndnddeeennntttDDiDiiaaabbbeeettstssMMMeeelllllliiitttuuusss G GGLLLUUUTTT222 GGGllluuucccooossseeTeTTrrraaannnsssppopoorrrttteeerrr222 G GGPPPCCCRRR GGG ---PPPrrrooottteeeiiinnnCCoCoouuupppllleeedddRReReeccceeeppptttooorrr P PPKKKAAA PPPrrrooottteeeiiinnnKKKiiinannaassseeeAAA P PPKKKCCC PPPrrrooottteeeiiinnnKKKiiinannaassseeeCCC C CCaaaMMMKKK ⅡⅡⅡ CCCaaa2+22++_/_/_/c_c_ca_a_al_l_l_mo_m_m_o_od_d_du_u_ul_l_li_i_in_n_nk_k_ki_i_i_n_n_na_a_as_s_se_e_eⅡ_Ⅱ_Ⅱ I IIPPP333 IIInnnooossisiitttooolll111,,,444,,,555---tttrrriiissspphphhooossspphphhaaattteee D DDAAAGGG DDDiiiaaacccyyylllggglllyyycceceerrrooolll G GGSSSIIISSS GGGllluuucccooossseeessstttiiimmmuuulllaaattteeedddiiinnnsssuuullliiinsnnsseeecccrrreeetttiiiooonnn K KKiiirrr666...222 iiinnnwwwaaarrrdddrrreeecctcttiiifffiiieeerrrKKK ccchhhaanannnnneeelllsssuuubbbuuunnniiitttsss666...222 S SSUUURRR111 SSSuuulllfffooonnnyyyllluuurrreeeaaarrreeecceceeppptttooorrr111 K KKAAATTTPPPccchhhaaannnnnneeelll AAATTTPPP dddeeepppeeennndddeeennntttKKK ccchhhaaannnnnneeelll

(13)

Ⅰ

Ⅰ.

.

. 서

서

론

A A A...제제제222형형형 당당당뇨뇨뇨병병병 제2형 당뇨병은 제1형 당뇨병과 달리 인슐린이 어느 정도 분비됨에도 불구하고 인슐린 작용이 적절하게 이루어지지 못해 발병하는 질병으로써 발병 후에도 계속 당 조절이 악화되어 혈당이 지속적으로 증가하는 진행성 대사 질환 (progressive

metabolicdisease)이다 (Hosker등,1989).

인슐린의 작용 이상 (인슐린 저항성 :insulin resistance)과 인슐린 분비 이상

(beta-celldysfunction)은 제2형 당뇨병에서 나타나는 특징이며,이것은 이미 유전

적으로 결정된다고 믿고 있다.여기에 과영양,운동부족,비만과 같은 환경적인 요

인이 더해져서 당뇨병이 유발된다 (LeRoith,2002).비만으로 인해 유도된 인슐린

저항성은 인슐린의 표적기관인 간,골격근 지방조직에서 인슐린 작용에 결함을 나 타내고 이 때문에 혈중 포도당 농도가 높아지게 된다.이를 극복하려고 처음에는 베타세포의 수가 양적으로 증가하며 인슐린 분비 또한 증가함으로 정상적인 혈당을

유지할 수 있다 (NGT :nomalglucosetolerance).이 단계를 베타세포의 보상 작

용 (β-cellcompensation)이라고 한다.그러나 시간이 지날수록 인슐린 저항성에 대

한 베타세포의 보상 작용이 감소하게 되고,나중에는 베타세포의 기능이상으로 이 어져서 인슐린 분비가 감소하고 혈중 포도당 농도는 더욱더 증가하게 된다 (IGT :

impairglucosetolerance)(Prentki등,2006;Gordon등,2004).증가된 혈중 포도

당 농도는 (hyperglycemia:glucotoxicity)지방산 (freefattyacids:lipotoxicity)

과 함께 베타 세포의 양적 감소를 초래하고 (β-cellfailure)포화 지방산,restin,

TNF-α등은 인슐린 저항성을 악화시켜서 더욱더 혈중 포도당 농도가 높아지게 된

다 (LeRoith,2002).이 단계는 명백한 당뇨병으로 고혈당이 지속적으로 유지되고

(14)

B B B...인인인슐슐슐린린린 합합합성성성 및및및 분분분비비비 1 1 1...인인인슐슐슐린린린 합합합성성성 인슐린은 췌장 소도의 베타 세포에서 합성되어 분비된다.소도 세포에는 펩타이 드를 분비하는 내분비 세포들이 밀집되어 있는데 그 중 70%~90%를 차지하고 있는 것은 인슐린을 분비하는 베타 세포 (β cell)이며 그 외 글루카곤을 분비하는 알파 세포 (α cell),소마토스타틴을 분비하는 델타 세포 (δ cell),췌장 폴리펩타이드를 분 비하는 PP 세포 이렇게 4가지 세포로 구성되어있다.베타 세포에서 인슐린 생합성 의 전반적인 과정을 살펴보면 포도당 자극에 의해서 인슐린 유전자에서 전 전구인

슐린 (preproinsulin)이 만들어지고 전 전구인슐린에서 N-terminal부위에 위치한

소수성 아미노산 24개로 구성된 leaderpeptide가 잘려나가고,disulfidebond가 형성

되면서 전구인슐린 (proinsulin)이 된다.전구인슐린에서 다시 4개의 아미노산이 잘 려나가면서 51개의 아미노산을 가진 인슐린과 31개의 아미노산을 갖는 C-peptide로 변환된다. 2 2 2...인인인슐슐슐린린린 분분분비비비 췌장 소도 베타 세포는 혈중 포도당 농도의 항상성을 유지하는 데 중요한 기능을 담당하는 인슐린을 합성하고 분비한다.베타세포에 문제가 생기면 포도당 항상성

유지에 영향을 준다.인슐린이 과도하게 분비되면 저혈당 (hypoglycemia),인슐린이

부족해지면 고혈당 (hyperglycemia)이 되어 당뇨병으로 이어진다.따라서 인슐린의

분비는 매우 엄격하게 조절되며 매우 좁은 범위 내에서 조절된다.인슐린 분비를 자극하는 인자로는 포도당,아미노산,지방산과 같은 영양분,신경전달물질 (아세틸

콜린),호르몬 (GLP-1 :Glucagon-likepeptide-1,인슐린)등이 있다 (Henquin 등,

2003).

포도당 자극에 의한 인슐린 분비는 1기 분비와 2기 분비로 나누어지는 이상성 분

비 양상을 나타낸다 (Fig.1)(Straub등,2002;Bratanova-Tochkova등,2002).1

(15)

며,10-20분 내에 기저 치로 회복된다.2기 분비는 증가된 포도당에 노출된 이후 25-30분부터 점진적으로 인슐린 분비가 이루어지는 시기이며,1기 분비보다 지속 적이고 많은 양의 인슐린이 분비된다.인슐린 분비의 이상성은 인슐린 낭의 구별된

pool의 존재와 포도당에 의해 활성화되는 신호들의 kinetics의 차이로 나타난다

(Porksen atal,2002).합성된 인슐린은 인슐린 낭에 담겨서 이동 과정에 따라

reservepool,dockedpool,readilyreleasablepool의 순서로 이동하며,인슐린 분비

자극이 왔을 때 인슐린 낭과 세포막과의 fusion과정을 통해 분비된다 (Fig.2).

또 인슐린 분비의 다른 특징은 포도당 대사과정,세포 내 Ca2+_{유입,세포막 전위}

차의 박동성 (oscillation)에 따라 인슐린 분비에도 박동성이 나타난다 (Gilon 등,

(16)

(Straub,DiabetesMetabResRev,2002)

FFFiiiggg...111...GGGllluuucccooossseee---ssstttiiimmmuuulllaaatteteedddbbbiiippphhhaaasssiiiccciiinnnsssuuullliiinnnrrreeellleeeaaassseeeiiinnnrrraaatttiiisssllleeetttsss...

(Straub,DiabetesMetabResRev,2002)

(17)

C C

C...인인인슐슐슐린린 분린 분분비비비 기기기작작작

췌장 소도의 베타세포에서 인슐린 분비 기작은 Triggering 경로 (KATP-dependent

pathway)와 Amplifying (KATP-independentpathway)경로를 통해 이루어진다 (Fig.

3)(Henquin등,2000,2004;ToruAizaw,2005).

1 1 1...TTTrrriiiggggggeeerrriiinnngggpppaaatththhwwwaaayyy 베타 세포에서 인슐린 분비를 위해서는 일차적으로 세포 내 Ca2+_{이 증가하는 것} 이 필수적이다. 포도당 농도가 증가하면 베타 세포에 있는 GLUT2 (Glucose Transporter2)라는 포도당 수용체에 의해 세포 안으로 포도당이 들어오고 들어온

포도당은 해당 작용과 TCA cycle을 통해 ATP를 만들어 낸다.ATP 증가에 따른

ATP/ADP 비율의 증가는 베타세포막의 KATPchannel을 닫음으로써 세포막의 탈분

극이 일어난다. KATP channel은 Kir 6.2 (inward rectifier potassium channel

subunits6.2)와 SUR1(Sulfonylureareceptor1)과 같은 하위구조 단백질로 구성되

어있다. KATP channel을 닫음으로써 인슐린을 분비하는 물질로는 glimepiride,

tolbutamide같은 sulfonylurea류 제제와 efaroxan,phentolamine과 같은 Imidazoline

화합물 등이 알려져 있는데 sulfonylurea류 제제와 imidazoline화합물은 각각 KATP

channel의 하위구조 중 하나인 SUR1과 Kir6.2와 상호작용하여 인슐린 분비를 일

으키는 것으로 밝혀져 있다 (Hoenig 등,1986 ;Korytkowski등,2004 ;Ball등,

2004;Efendic등,2002).막 전위차 변화에 의해 voltage-dependentCa2+_channel_이

열리고 세포 내부로 Ca2+_{가 유입되어 인슐린 분비를 유발시킨다.즉,베타 세포 내}

에 Ca2+_{을 급속히 증가시키는 경로,이것이 인슐린의 1차 분비 (Tri}_ggeri_{ng 경로,}

KATPchannel-dependent경로)에 해당한다.포도당뿐만 아니라 고농도의 KCl은 세

포 내로 유입되면 세포막의 탈분극을 유발시켜 인슐린을 분비한다.또한,세포 외부

에 arginine의 농도가 증가하면 cationicamino acid transporter(CAT2A)를 거쳐

베타 세포 내로 양이온이 유입되면서 탈분극을 유도하여 인슐린 분비를 유발시킬

(18)

충분하지만 효과적이지는 못하다.그러므로 Amplifying 경로를 통해 인슐린 분비 효율을 증가시킨다. 2 2 2...AAAmmmpppllliiifffyyyiiinnnggg pppaaattthhhwwwaaayyy Amplifying 경로를 통한 인슐린의 지속적인 분비는 세포 내 Ca2+의 증가를 유발

시키는 Triggering신호가 필수적이다 (Henquin등,2003).Amplifying경로를 통한

인슐린 분비는 인슐린의 2차 분비 (Amplifying 경로,KATP channel- independent

경로)를 담당한다.해당 작용으로부터 만들어진 신호는 amplifying 경로의 효율을

증가시키지만 아직 그 작용 기작은 분명하게 밝혀져 있지 않다.첫 번째 가설은

malonyl-CoA 가설로서 지속적인 포도당의 유입은 citrate양을 증가시키며 증가된

citrate는 acetyl-CoA보다 malonyl-CoA로 많이 변환되어 세포 내에 malonyl-CoA

양이 증가한다. 이렇게 증가된 malonyl-CoA는 CTP-1 (carnitine palmitoyl

transferase-1)를 저해하여 지방산의 베타 산화를 감소시킴으로 세포 내 long-chain

CoA가 양적으로 증가되어 이체된 FA-CoA 및 그 하위 대사물질이 amplifying

pathway를 증가시키는 것이다 (Farfari등,2000;Corkey 등,2000).두 번째 가설

은 포도당에 의해 증가된 glutamate가 인슐린 낭에 직접적으로 작용함으로써 인슐

린 분비를 증가 시킨다는 것이다 (Bertrand 등,2002).세 번째 가설은 베타 세포

내에 ATP/ADP level의 변화가 인슐린 분비를 조절한다는 것이다 (Detimaryatal,

1998).그 외에 amplifying 경로를 증가시키는 신호로 protein kinase A (PKA),

protein kinase C (PKC),Ca2+/Calmodulin kinase Ⅱ (CaMK Ⅱ)를 들 수 있다

(Nesher등,2002;Jones등,1998).신경전달물질인 acetylcholine은 PKC의 활성에

의해 인슐린 분비를 항진시킨다.그 기작은 ligand에 의해 G-protein coupled

receptor가 활성화되면 phospholipase C가 활성화되어 inositol-1,4,5- triphosphate

(IP3)와 diacylglycerol(DAG)가 생성된다.이때 생성된 IP3는 ER membrane에 존재

하는 IP3receptor에 작용하여 세포질 내로 Ca2+을 방출하고 DAG는 PKC를 활성화

시켜서 인슐린 분비를 촉진한다 (Gembal등,1993).인슐린 분비 자극 호르몬인 GLP-1 (glucagon-like peptide 1) 은 G-protein coupled receptor를 활성화시켜

(19)

adenylylcyclase를 활성화시킨다.활성화된 adenylylcyclase에 의해 cAMP가 생성

되고 PKA와 Epac(cAMP-regulatedguaninenucleotideexchangefactors)를 활성

화시켜 인슐린 분비를 촉진한다 (Ashcroft등,1999;MacDonald 등,2002;Holz

(20)

(Henquin,EurJClinInvest,2003) F F Fiiiggg...333...MMMeeeccchhhaaannniiissmsmm ooofffiiinnnsssuuullliiinnnssseeecccrrreeetttiiiooonniniinnnpppaaannncccrrereeaaatttiiiccc

β

---ccceeellllll L-Leucine Glutammin KCl

Site 2

Site 1

Site 3

Site 4

Site 5

Site 4

Epac L-Leucine Glutammin KCl

Site 2

Site 1

Site 3

Site 4

Site 5

Site 4

Epac

Site 1 : Glucose influx Site 2 : Glucose metabolism Site 3 : Increase of [Ca2+_]

iby closure of KATPchannel

Site 4 : Stimulation of amplifying pathways Site 5 : Insulin Exocytosis

(21)

D D

D...인인인슐슐슐린린 분린 분분비비비 촉촉촉진진진

인슐린은 앞에서 설명한 분비 기작 (Triggering pathway,Amplifying pathway)

에 의해 엄격하게 조절되어 세포 외로 방출된다.인슐린 분비를 촉진하는 물질로서

베타 세포의 대사 물질인 포도당,아미노산,지방산은 인슐린 분비의 triggering

pathway,amplifyingpathway를 만들어 내고 인슐린 분비를 촉진한다.인슐린 분비

자극 호르몬 (incretin:GLP-1)과 신경전달 물질 (부교감 신경 물질 :아세틸콜린)

또한 인슐린 분비의 amplifying pathway를 만들어 내고 영양분에 의해 활성화되는

인슐린 분비 amplifying pathway와는 독립적으로 인슐린 분비의 amplifying

pathway를 활성화시킴으로 인슐린 분비를 촉진한다.

제2형 당뇨병에서는 인슐린 분비가 감소되어 있다.당뇨병에 치료에 사용되는 약 제들은 기본적으로 제2형 당뇨병에서 나타나는 감소된 인슐린 분비와 인슐린 저항 성의 교정에 초점을 맞추고 있다.그동안 많은 약제가 개발되었지만 약제 독성이나

유효성,안전성 등이 문제 되어 실제 임상에서 사용되는 약제는 sulfornylureas,

bigunides,thiazolidinediones등이 있다.인슐린 분비와 관련된 인슐린 분비 촉진 약

제로는 sulfornylureas와 repaglinide,최근에 알려지기 시작한 nateglinide,십이지장

추출물에서 연구되었으며 glucagon 분비를 억제하고 인슐린 분비를 항진시키는 물

질 GLP-1 (glucagon-like peptide-1), GLP-1의 분해를 억제하는 DPP-Ⅳ

(dipeptidyl-peptidase-Ⅳ)억제제가 대표적이다 (Tielmans 등, 2007 ; 당뇨병학,

2007). 1 1

1...SSSuuulllfffooonnynyyllluuurrreeeaaasss

제2형 당뇨병에서 사용되는 약제 sulfonylureas는 베타 세포막에 존재하는 KATP

channel의 하위구조 단백질인 SUR1 (sulfonylurea receptor1)과 상호작용을 통해

KATPchannel을 닫음으로 세포막에 탈분극을 유도한다.따라서 세포막에 전위차를

인식하는 voltage-dependent-Ca2+_channel_{이 열리고 Ca}2+_{가 세포 내로 이동하여 세}

(22)

Ashcroft,1999). Repaglinide는 nonsulfornylureas로서 KATP channel의 하위구조

단백질인 SUR1 (sulfornylurea receptor1)과는 다른 부위에 결합하여 선택적으로

KATPchannel을 닫아서 인슐린 분비를 촉진한다 (Fig.4)(당뇨병학,2007).

2 2

2...GGGLLLPPP---111

GLP-1(glucagon-likepeptide-1)은 소장 점막 L-cell에서 만들어져 분비되는 인크

레틴 호르몬으로 인슐린 분비 촉진뿐만 아니라 세포 내에서 인슐린 유전자 발현을 증가시키거나 베타 세포의 증식,사멸예방 그리고 ER stress감소 등과 같은 유익

한 효과를 나타낸다 (Fig.5)(MacDonald등,2003;Drucker등,2002;Baggio등,

2007).GLP-1은 progucagon gene에서 mRNA로 만들어진 다음 posttranslational

processing을 거쳐 GLP-1로 합성된다 (Lim 등,2006).합성된 GLP-1은 포도당 지

방산 등과 같은 영양분에 의해서 분비가 촉진되며 (Fehmann 등,1995)우리가 음 식을 먹어서 소화 작용이 일어날 때 빠르게 분비되어 글루카곤의 분비를 억제하고 인슐린의 분비를 촉진한다.

GLP-1에 의한 인슐린 분비 촉진은 GLP-1receptor를 통한 adenylylcyclase활

성으로 cAMP을 생성하게 된다.cAMP는 2가지 다른 기작을 통해 인슐린 분비를 촉진한다.첫 번째로 PKA를 통한 다음 신호의 활성이고 두 번째로 PKA를 통하지 않는 Epac2를 통한 활성이다.각각의 신호전달 과정을 통해 Kv current 상에

antagonistic 효과를 나타내어 인슐린 분비를 촉진한다.따라서 GLP-1은 KATP

channel에 을 거치지 않고 포도당 자극 인슐린 분비를 촉진시킨다. E E E...GGGeeennniisissttteeeiiinnn Genistein은 콩과 작물에서 만들어 내는 항생물질의 공통적인 전구체이며 씨앗에 서 추출된 물질로서 최근 몇 년간 유방암,전립선암,심혈관질환,갱년기 등을 예방

하는 유익한 효능을 나타낸다고 보고되었다 (Dixon,2002).또 genistein은 동물세포

(23)

으로 기능과 tyrosinekinase를 억제하는 기능을 가진다 (Akiyama등,1987). 최근 동물과 사람에서 수행된 연구에서 콩 단백질과 고혈당의 조절이 연관되어

있음이 보고되었다 (Lavigne등,2000).그리고 당뇨병 동물 모델에서 콩 단백질을

처리했을 때 plasma포도당 농도가 낮게 유지되었다 (Ali등,2005).따라서 콩에서

분리된 genistein또한 베타 세포에서 포도당 자극 인슐린 분비 촉진 물질로 밝혀서

콩 단백질에 의한 혈당 조절 효과를 담당할지 모른다.그러나 아직 genistein이 어

떻게 혈당 조절 효과를 나타내는지에 대한 기작이 정확하게 밝혀지지 않았다.

췌장 베타 세포에서 Genistein에 의한 직접적인 영향에 대해 이미 보고된 바가

있다.대부분의 연구에서 genistein은 tyrosinekinase억제제로 널리 사용되고 있는

데,genistein을 베타 세포에 처리하면 인슐린 분비가 항진된다는 논문도 보고되었

다 (Ohno등,1993;Sorenson등,1994;Jonas등,1995;Dongmin등,2006).반면

에 인슐린 분비가 억제된다는 논문도 보고되었다 (Jones 등,1994 ;Verspohl등, 1995 ;Persaud 등,1999).이는 아마도 실험 모델의 차이점과 실험에 사용되는

genistein의 농도 차이에 의한 것으로 보인다.

Genistein에 의한 인슐린 분비가 항진되는 기작 연구에 따르면 mouse췌장 베타

세포주인 MIN6세포 (Ohno등l,1993)와 mouse췌장 소도 (Dongmin등,2006)에

genistein을 처리했을 때 인슐린 분비를 촉진했으며 이때 cAMP의 축척이 증가된다

고 보고되었다.하지만,각각 논문에서 genistein의 처리 농도가 다양하고 효과 또한 다양하게 나타나므로 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 기작은 논란의 여지가 있 다. F F F...연연연구구구 목목목적적적

췌장 베타 세포주인 MIN6cell과 췌장 소도에서 genistein에 의해 인슐린 분비가

증가된다는 사실은 이미 보고되었다 (Ohnoatal,1993;Jonasatal,1995;Liuat

al,2006).하지만,인슐린 항진 기작에 대해 아직 논란의 여지가 있으며,연구 결과

(24)

분비가 어떻게 이루어지며 어떤 기작에 의해 이루어지는지 연구하였다.그 결과

genistien에 의해 증가된 인슐린 분비는 세포 내 Ca2+_{증가를 통한 CaMK Ⅱ의 활성}

화 때문일 것이라 생각된다.

Genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상에 대한 연구는 인슐린 분비를 항진하는

물질로 인슐린 분비 항진 기작을 알 수 있으며 나아가서는 인슐린 분비를 개선하는 약제로서의 가능성을 제시할 수 있다.

(25)

Ⅱ

Ⅱ.

.

.재

재

재료

료

료 및

및

및 방

방

방법

법

A A A...재재재료료료

세포 배양에 사용하는 Fetalbovineserum (Cellgrow.Mediatech,Heydon,VA)

과 RPMI1640(Cellgrow.Mediatech,Heydon,VA)은 Cellgrow에서 구입하였다.

antibiotics과 antimycotics (GibcoBRL,Life Technology,NY)는 GibcoBRL,Life

Technology에서 구입하였다. Genistien, Diazoxide, H89 (PKA inhibitor),

GF109203X (PKC inhibitor),GO6976 (PKC inhibitor),GO6983 (PKC inhibitor), PD98059 (ERK inhibitor),SB203580(p38 inhibitor),SP600125 (JNK inhibitor),

AICAR (AMPK activator), Rapamycin (mTOR inhibitor), KN93 (CaMK Ⅱ

inhibitor),KN 62(CaMK Ⅱ inhibitor),W-7(Calmodulin antagonist)등 저해제들

은 Calbiochem (Calbiochem ,Germany)에서 구입하였다.L-leucine,L-glutamine,

pyruvate,Glimepiride,Tolbutamide,Phentolamine,Efaroxan등은 Sigma-Aldrich

(StLouis,Missouri)에서 구입하였다.Western blotting에 사용된 PKA substrate,

PKC substrate,phospho-CaMK Ⅱ 항체는 Cellsignaling Technology (USA)에서

구입하였다.세포 내 ATP측정에 사용되었던 CellTiter-Glo Luminescent Cell

Viability Assay Kit는 Promega(Madison,WI)에서 구입하였다.인슐린 측정에 사

용되었던 Ratinsulinassay Kit는 LincoResearch(St.Louis,MO)에서 구입하였

다. Immunoblotting에 사용되었던 chemiluminescence detection system은

Amersham PharmaciaBiotech(ArlingtionHeight,IL)에서 구입하였다.

B B B...방방방법법법 1 1 1...세세세포포포주주주 및및및 세세세포포포 배배배양양양

(26)

bovineserum과 100IU/mlpenicillin과 100㎍/㎖ streptomycin의 항생제를 첨가하

여 5% CO2와 37℃의 온도를 유지하면서 배양하였다.

2 2

2...인인인슐슐슐린린린 정정정량량량

INS-1베타 세포를 24welldish에 well당 2×105_{개로 분주하고 24시간 배양하}

였다.Genistien와 각각의 저해제들을 함께 2시간 처리한 후에 인슐린 분비량을 조

사하였다.0.2mM 포도당이 첨가된 KRB buffer(24mM NaHCO2,1.2mM MgCl2,

1mM Hepes,129mM NaCl,4.8mM KCl,1.2mM KH2PO4,2.5mM CaCl2,0.2%

BSA)로 1시간 동안 전 배양을 수행한 후,먼저 Genistien과 저해제들이 포함된

배지를 500㎕씩 각 well에 넣어주었다.2시간 동안의 배양이 끝난 뒤,각 상등액

을 200㎕씩 모아 Ratinsulinassay kit로 Radioimmunoassay 방법을 통해 인슐린

양을 측정하였다.세포 내 존재하는 인슐린 양을 측정하기 위해서 acid-ethanol

(75% ethanol,0.2mM HCl)을 각 well당 200㎕씩 넣고 4℃에서 12시간 동안 두

었다.그 추출물을 모아서 700g에서 3분간 원심분리 후 RatinsulinassayKit를

사용하여 Radioimmunoassay법으로 인슐린을 측정하였다.

3 3

3...세세세포포포 내내내 AATATTPPP량량량 측측측정정정

INS-1세포를 24wellplate에 2×105_{으로 분주한 후,20시간동안 배양했다.포}

도당이 없는 KRB buffer로 세포를 1회 씻어준 후,0.2mM 포도당이 포함된 KRB

buffer로 1 시간 동안 전 배양을 했다.그 후 시간별로 (30분,60분,120분)

Genistein을 처리 하였다.처리 후 상등액을 모두 거둬들이고 PBS로 한번 닦은 다

음 ATP 합성관련 효소 활성을 억제하기 위해서 5% trichloroaceticacidinPBS를

0.5㎖ 첨가했다.세포들을 pipetting하여 모은 다음 13000rpm,10분간 원심분리

하여 0.1㎖의 상등액을 1.5㎖ tube에 옮긴 후,trichloroaceticacid를 제거하기 위

해서 1㎖의 diethylether를 섞었다.여기서 아래층에 있는 sample을 0.1㎖ 따서

새로운 1.5㎖ tube에 옮긴다.sample을 bufferA (20mM HEPES,3mM MgCl2,

(27)

Kit(Promega)을 사용하여 ATP 양을 측정하였다. 4

4

4...세세세포포포 내내내 CCCaaa222+++_량_량_{량 측}_측_측정_정_정

세포 내 Ca2+ _{측정은 FLUO3-AM를 이용하여 형광을 발산시키고 confocal}

microscopy (Axiovert,Zeiss,Germanny)를 이용하여 정량하였다.cover glass에

5×104_{의 INS-1세포를 올려 둔 다음 6시간 동안 배양기에서 붙인 다음.medi}_a첨

가하여 12시간 동안 배양기에서 배양하였다.Staining buffer(HBSS buffer:145

mM NaCl,2.5 mM KCl,1 mM MgCl,20 mM Hepes )에 5 μM FLUO3-AM

(Calbiochem ,Germany)과 Pluronic F-127 0.018 g/l(MolecularProbe,Eugene,

OR)를 첨가해 30분 동안 염색한 후 staining buffer로 두 번 닦아 내었다.세포를

confocalmicroscopy 위에 올려두고 340nm,380nm의 파장으로 excitation시켜서

방출되는 510nm 파장 형광을 측정하였다. 5

5

5... WWWeeesststteeerrrnnnbbblllooottttttiiinnnggg

INS-1세포를 6wellplate에 well당 1×106_{개씩 분주하고 24시간 동안 배양하였}

다.Genistein과 약제들을 각각 조건에 따라 처리한 후 세포들을 수거하여 RIPA

buffer (1% triton X-100,1% sodium deoxycholate,50 mM NaCl2,50 mM

Tris-HCl,1mM sodium vanadate,2mM PMSF)를 넣고 단백질을 분리,정량하였

다.정량 값대로 sample buffer (187 mM Tris-HclpH 6.8,10% SDS,30%

glycerol,100 mM DTT,0.3% bromophenolblue)에 희석하여 5분간 끓인 다음

phospho CaMK Ⅱ 항체를 붙일 경우는 12% SDS-polyacrylamid gel을 사용하고

PKA,PKC substrate항체를 붙이는 경우는 10% SDS-polyacrylamidgel을 사용하

여 전기영동 하였다.Gel에서 PVDF membrane (phospho CaM Kinase Ⅱ),NC

membrane(PKA,PKC substrate)으로 이동시키고 5% skim milk로 blocking하였

다.각각의 항체와 반응시키고 horseradish peroxidase-linked2차 항체로 반응시킨

(28)

6 6

6... TTTrrraaannnsssffefeeccctttiiiooonnn

INS-1세포를 6wellplate에 well당 8×105_{개씩분주하고 20시간 동안 배양하였}

다.Eppendorftube에 serum 없는 RPMI600㎕를 넣고 원하는 DNA 4.5㎍을 섞

어준 다음 9㎕의 lipofectamine을 더해 pipet으로 부드럽게 섞어준 후,30분 정도

상온에 두었다.Transfection 시킬 세포를 serum 없는 RPMI로 2회 씻어준 다음,

serum freeRPMI를 well당 1.4㎖씩 분주하고 준비해둔 DNA와 lipofectamine이 혼

합된 배지를 세포위로 천천히 골고루 뿌려주었다.4~6시간 배양시키고 나서 RPMI

1640 (10% FBS 포함)으로 교체하였다.48~72 시간 내에 세포를 100 mm culture

dish로 옮겨서 24시간 배양한 후,배지에 100㎍/㎖의 hygromycin을 넣어서 48시

간 배양하였다.그 이후에 살아남은 세포들을 배양하여 stableclone세포를 얻었다.

7 7

7...RRRTTT---PPPCCCRRR

INS-1세포를 RPMI1640(10% fetalbovineserum과 1% 항생제 포함)배지로

24wellplate에 2×105_{개씩 분주해서 37℃,5% CO}

2에서 20시간 동안 배양한 후,

각각의 약제들을 처리하였다.18~24 시간 이후에 세포를 PBS로 2회 씻어준 후,

RNA Zol-B를 이용해 전체 RNA를 뽑고 정량하였다.1㎍의 RNA를 1000U AMV

0.5㎕,2.5mM dNTP 4㎕,Random 9mer1㎕,RNaseinhibitor0.5㎕,Mgcl24

㎕,10배 RT buffer를 이용해서 30℃ 10분,42℃ 30분,99℃ 5분 동안 역전사 반 응을 시킨다.이렇게 얻어진 cDNA로 PCR을 수행하였다.

실험에 사용된 primer는 CaMK Ⅱ

(foward) 5'-ggCCATgAgTATgCAgCTgCgATCATTAACACCAAgAAGc

(Reverse) 5'-gCTTCTTggTgTTAATgATCgCAgCTggATACTCATggcc 이다.

1.2% agarosegel에서 PCR 반응물을 전기영동 하여 EtBr로 염색하여 사진을 찍었

(29)

저저저해해해제제제(((IIInnnhhhiiibbbiiitttooorrr)))

Diazoxide(DZX) KATPchannelopener

H89 PKA inhibitor

GF109203X PanPKC inhibitor

GO6976 cPKC inhibitor

GO6983 cPKC,nPKC inhibitor

PD98059 ERK inhibitor

SB203580 p38inhibitor

SP600125 JNK inhibitor

AICAR AMPK activator

Rapamycin mTOR inhibitor

BayK8644 L-typeCa2+_channelagoni_st

KN62 CaM kinaseⅡ inhibitor KN93 CaM kinaseⅡ inhibitor W-7 Calmodulinantagonist CaM K peptideinhibitor CaM kinaseⅡ inhibitor PKI PKA peptideinhibitor

(30)

Ⅲ

Ⅲ.

.

.결

결

결 과

과

Pancreatic β-cell과 MIN6cell에서 genistien에 의해 인슐린 분비가 증가된다고

이미 논문에서 보고되었다 (Ohno 등,1993 ;Jonas등,1995).그러나 INS-1 cell

line에 genistien에 의한 인슐린 분비 항진 효과에 대한 연구 (Verspohl등,1995)는

우리의 실험 조건과 다르며 genistein에 의한 인슐린 분비 증가에 대해서 정확한 기 작이 규명되지 않았다.따라서 genistein에 의해 증가된 인슐린 분비 기작을 연구하 였다. A A A...IIINNNSSS---111베베베타타타 세세세포포포에에에서서서 GGGeeennniiisssttteeeiiinnn에에에 의의의한한한 포포포도도도당당당 의의의존존존 인인인슐슐슐린린린 분분분비비비 항항항진진진 양양양상상상

INS-1베타 세포에서 genistein에 의한 포도당의존 인슐린 분비 항진 양상을 확

인하기 위해 genistein 농도별,처리 시간별,포도당 농도별 인슐린 분비 항진 양상 을 조사해 보았다.포도당이 없는 상황과 고농도 포도당 (16.7mM)이 포함된 상황 에서 genistein를 25 μM,50 μM,100 μM,200 μM 농도로 처리한 후,2시간 동안 의 인슐린 분비를 조사했을 때 포도당이 포함되어 있지 않은 상황에서는 인슐린 분 비가 증가되지 않았지만 고농도 포도당이 포함된 상황에서는 genistein 50μM 농도 에서 인슐린 분비가 가장 많이 증가함을 확인하였다 (Fig.4A).또 고농도 포도당 (16.7mM)과 genistein (50 μM)처리 후 시간별 (15분,30분,60분,120분)로 인슐린 분비를 조사하였을 때 처리 시간 의존적으로 인슐린 분비가 증가함을 확인

하였다 (Fig.4B).그리고 Genistein이 포도당 농도 의존적로 증가하는지를 알아보

기 위해 genistein50 μM을 포도당 농도별로 처리했을 때 인슐린 분비가 포도당 농

도 5mM 이상에서부터 증가하는 것을 확인하였으며,포도당 의존적으로 증가함을

다시 한 번 확인하였다 (Fig.4C).따라서 INS-1세포에서 genistein에 의한 인슐린

(31)

G GGeeennniiisssttteeeiiinnn(((μμμμMM)M)) TTTiiimmmee(e((mmmiiinnn))) G G Gllluuucccooossesee(((mmmMMM))) F F Fiiiggg... 444... PPPooottteeennntttiiiaaatttiiiooonnn eeeffffffeeeccctt ot oofff gggeeennniiissstteteeiiinnn ooonnn gggllluuucccooossseee---sssttitiimmmuuulllaaattteeeddd iiinnnsssuuullliiinnn s s seeecccrrreeetttiiiooonnn(((GGGSSSIIISSS)))iiinnnIIINNNSSS---111ccceeellllllsss... ( (

(AAA)))Insulinsecretionwasstimulatedwithvariousconcentrationofgenistien(25,

50,100,200 μM)for2 hrs in the presence ofhigh glucose (HG :16.7 mM).

Secretedinsulininmedium wasmeasuredbyinsulinRIA.(((BBB)))INS-1cellswere treated with high glucose (HG :16.7 mM)and genistein (50 μM).Secreted insulin forthe indicated times (15,30,60,120 min)was measured by insulin RIA.(((CCC)))Insulin secretion wasstimulatedwithvariousconcentration ofglucose (0,3,5,11,16.7 mM)in thepresenceofgenistein.Secreted insulin for2 hrs

* 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 25 50 100 200 NG HG * _* **

A

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 25 50 100 200 NG HG * _* **

A

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 15 30 60 120 HG HG+Genistien (50 µM) * *

B

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 15 30 60 120 HG HG+Genistien (50 µM) * *

B

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 3 5 11 16.7 25 glucose Genistein (50 µM) * ** _*

C

* In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 3 5 11 16.7 25 glucose Genistein (50 µM) * ** _*

C

* In s u li n ( n g /m l)

(32)

**_P<0._01vs.Geni_stei_{nuntreatedINS-1cel}_l_s.

B B

B... GGGeeennniiistssttiiieeennn에에 의에 의의한한한 인인인슐슐슐린린린 분분분비비비 항항항진진진 효효효과과과

Genistien이 포도당 이외에 인슐린 분비 자극 물질들에 의해 인슐린 분비 항진

효과가 있는지 알아보고자 다양한 인슐린 분비 자극 물질에서 인슐린 분비를 조사 하였다.베타 세포 포도당 대사 과정 중에 바로 TCA 회로에 에너지 합성 대사물질

로 사용되는 것으로 알려져 있는 L-leucine과 L-glutamine를 genistein (50 μM)과

동시에 처리해서 2시간 동안의 인슐린 분비를 조사하였다.포도당에 의한 인슐린 분비 항진 현상과 동일하게 인슐린 분비가 대조군에 비교하여 3배 항진됨을 확인하 였다.포도당 대사과정 중의 중간산물인 pyruvate의 경우에도 인슐린 분비가 항진

됨을 확인하였다.그러나 L-typeCa2+_channel_{에 직접 작용하여 세포 내 Ca}2+_유입

을 증가시킴으로 인슐린 분비를 유발시키는 BayK8644을 gesnistien과 함께 처리했

을 때에는 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상이 관찰되지 않았다.마찬가지로

KATP channelopener인 diazoxide와 탈분극을 일으키는 KCl을 동시에 처리하여

KATPchannel을 거치지 않고 세포막에 탈분극을 일으켜서 Ca2+유입을 증가시킨 다

음 genistein을 처리했을 때 또한 인슐린 분비 항진 현상이 나타나지 않았다.따라

서 genistien에 의한 인슐린 분비 항진 현상은 단순히 Ca2+_{증가만으로는 일어나지}

않으며 대사산물이 존재할 때 인슐린 분비가 항진됨을 알 수 있었다 (Fig.5).

또 다른 인슐린 분비 촉진 물질로써 포도당 대사과정에 의한 ATP 생성과정을

거치지 않고 바로 KATP channel을 닫음으로써 인슐린 분비를 자극하는

sulfonylurea류의 일종인 glimepiride와 tolbutamide 그리고 imidazoline계열인

phentolamine과 efaroxan을 genistein과 함께 처리한 후 2시간 동안 인슐린 분비

항진 현상을 조사하였다.tolbutamide 또는 efaroxan과 genistein을 같이 처리했을

때는 인슐린 분비 항진 현상이 나타나지 않았지만 glimepiride또는 phentolamine와

(33)

F F Fiiiggg... 555... PPPooottteeennntttiiiaaatttiiiooonnn eeeffffffeeecccttt ooofff gggeeennniiissstteteeiiinnn ooonnn nnnuuuttrtrriiieeennnttt---ssstttiiimmmuuulllaaattteeeddd iiinnnsssuuullliiinnn s s seeecccrrreeettitiiooonnn...

INS-1cellswerepreincubatedwithKRB buffercontaining 0.2mM glucosefor 1 hrs.Insulin secretion was stimulated by differentinsulin secretagogues,i.e.,

high glucose (HG :16.7 mM),Bay K8644 (10 μM),KCl(30 mM)/diazoxide

(DZX : 300 μM), Sodium pyruvate (20 mM), L-leucine (Leu : 20

mM)/L-glutamine(Gln:10mM)for2hrsinthepresenceofgenistein(G :50

μM).Secreted insulin in medium was measured by insulin RIA.Data are

represntativeoffourindependentexperimentsandareexpressedasmean± SD.

**_P<0._01vs.Geni_stei_{nuntreatedINS-1cel}_l_s.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 LG HG Bay Bay +G KC l/DZX KC l/DZX +G pyru vate pyru vate +G Leu/ Glu Leu/ Glu +G

**

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 LG HG Bay Bay +G KC l/DZX KC l/DZX +G pyru vate pyru vate +G Leu/ Glu Leu/ Glu +G

**

In s u li n ( n g /m l)

(34)

F F

Fiiiggg...666...PPPoototteeennntttiiiaaatttiioioonnn eeeffffffeeeccctttooofffgggeeennniiisssttteeieiinnn ooonnn vvvaaarrriiiooouuusss iiinnnsssuululliiinnn ssseeecccrrreetettaaagggoogogguuueeesss ---ssstttiiimmmuuulllaaattteeedddiiinnnssusuullliiinnnssseeecccrrreeetttiiiooonnn

INS-1cellswerepreincubatedwithKRB buffercontaining0.2mM glucosefor1 hrs.Insulin secretion wasstimulatedby differentinsulinsecretagogues,i.e.,low

glucose(LG :0.2 mM),high glucose(HG :16.7 mM),tolbutamide(500 mM),

glimepiride(5mM),efaroxan(500mM),phentolamine(50mM)for2hrsinthe

presenceofgenistein(G :50μM).Secretedinsulinin medium wasmeasuredby insulin RIA.Data are represntative offour independentexperiments and are expressed asmean ± SD.*_P<0._05and**_P<0._{01 vs.Geni}_stei_{n untreated INS-1} cells. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 LG HG Tolb utam ide Tolb utam ide+ G Glim epir ide Glim epir ide+ G Efar oxan Efar oxan +G Phen tola min Phen tola min +G

*

**

In s u li n ( n g /m l) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 LG HG Tolb utam ide Tolb utam ide+ G Glim epir ide Glim epir ide+ G Efar oxan Efar oxan +G Phen tola min Phen tola min +G

*

**

In s u li n ( n g /m l)

(35)

C C C...인인인슐슐슐린린린 분분분비비비 이이이상상상에에에서서서 GGeGeennniiisssttteeeiiinnn의의의 역역역할할할 베타 세포가 포도당 또는 그 외 인슐린 분비 자극에 지속적으로 노출되어 있으면 그 인슐린 분비 자극에 대한 베타 세포의 인슐린 분비 반응이 감소한다.그리고 인 슐린 분비 자극을 제거하게 되면 인슐린 분비 반응이 정상으로 회복되는 데 이러한

상태를 인슐린 분비의 desensitization이라 한다.이때 인슐린 분비 반응의 감소가

세포 내 인슐린의 양적 감소를 동반하는 경우는 베타 세포 exhaustion이라 일컫는 다 (Rustenbeck등,2004).당뇨병이 오랜 기간 지속되면 인슐린 분비 자극을 제거 함에도 불구하고 인슐린 분비 반응이 더 이상 회복되지 않는 상태에 이르게 되고 이 상태는 베타 세포 기능이상과 구조의 변화를 동반한다 (WeirGC등,2001).인슐 린 분비를 항진하는 genistein이 다른 인슐린 촉진 물질과 마찬가지로 지속적으로 노출되었을 때 인슐린 분비 반응이 어떻게 변하는지 알아보고자 인슐린 분비 자극 에 대한 인슐린 분비 반응에 미치는 영향을 조사하여 보았다.인슐린 분비 자극에

지속적으로 노출시켜 인슐린 분비가 감소한 INS-1베타 세포에 genistein을 처리하

였을 때,그 결과 각각의 대조군보다 상대적으로 포도당 자극 인슐린 분비량은 많

(36)

F F Fiiiggg...777...PPPoototteeennntttiiiaaatttiiiooonnn eeeffffffeeecccttt ooofff gggeeennniiisssttteeeiiinnn ooonnn GGGSSSIIISSS iiinnn dddeeessseeennnsssiiitttiiizezzeeddd IIINNNSSS---111 c c ceeellllllsss...

INS-1cellswereincubatedwith high glucose(25mM)(((AAA))),phentolamin (25 μ M,50 μM,100 μM)(((BBB)))ortolbutamide(250 μM,500 μM,1 mM)(((CCC)))for24 hrs.Insulinsecretionwasstimulatedbyhighglucose(HG :16.7mM)andhigh glucose (HG :16.7 mM)+genistein (50 μM).Insulin release for 2 hrs was

measuredbyinsulinRIA.Dataarepresentedasmean±SD.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 LG 11 25 HG HG+Genistein (50 µM)

A

In s u li n ( n g /m l) Glucose (mM) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 LG 11 25 HG HG+Genistein (50 µM)

A

In s u li n ( n g /m l) Glucose (mM) 0 1 2 3 4 5 6 LG 0 25 50 100 HG HG+Ge nistein (50 µM)

B

In s u li n ( n g /m l) Pentolamin (μμμμM) 0 1 2 3 4 5 6 LG 0 25 50 100 HG HG+Ge nistein (50 µM)

B

In s u li n ( n g /m l) Pentolamin (μμμμM) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 LG 0 250 500 1000 HG HG+Genistein (50 µM)

C

In s u li n ( n g /m l) Tolbutamide (mM) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 LG 0 250 500 1000 HG HG+Genistein (50 µM)

C

In s u li n ( n g /m l) Tolbutamide (mM)

(37)

D D

D...GGGeeennniiisssttteeeiiinnn에에에 의의의한한한 인인인슐슐슐린린린 생생생합합합성성성량량량 변변변화화화

INS-1베타 세포에 genistein을 처리하면 인슐린 분비가 증가하였다.증가된 인

슐린 분비가 인슐린 생합성량의 증가에 의한 것인지 알아보고자 genistein을 12시 간,24시간 처리 후 세포 내 인슐린 양을 측정하였다.결과 인슐린 생합성량에는 변화가 없었다.따라서 genistein에 의한 인슐린 분비 항진 현상은 인슐린 생합성 량의 변화와는 관계가 없음을 확인하였다 (Fig.8). G G Gllluuucccooossese(e((mmmMMM))) GlGGlluuucccooossesee(((mmmMMM))) F F Fiiiggg...888..E.EEffffffeeeccctttooofffgggeeenniniisssttteeeiiinnnooonnniiinnnsssuuullliiinnnsssyyynnnttthhheeesssiiisss...

INS-1 cells were incubated with genistein (50 μM)for12 hrs (((AAA)))or24 hrs (

(

(BBB)))...Theintracellularcontentofinsulin wasisolated by acid-etanolextraction. IntracellularInsulin wasmeasured by insulin RIA.Dataarepresented asmean ±SD. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 11 con Genistein (50 µM) In s u li n ( n g /m l)

A

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 11 con Genistein (50 µM) In s u li n ( n g /m l)

A

B

(38)

E E

E...GGGeeennniisissttteeeiiinnn에에에 의의의한한한 AAATTTPP 합P합합성성성량량량 조조조사사사

베타 세포에 유입된 포도당이 해당과정을 거쳐 만들어내는 ATP는 ATP/ADP 비

율의 변화를 가져오고 ATP/ADP 비율의 증가는 베타 세포막의 KATPchannel을 닫

음으로써 세포막의 탈분극이 일어난다.막 전위차 변화에 의해 voltage-dependent

Ca2+channel이 열리고 세포 내부로 Ca2+가 유입되어 인슐린 분비를 유발시킨다.그

러므로 ATP/ADP 비율의 변화는 인슐린 분비의 조절에 중요하다.Genistein이

ATP의 합성에 영향을 미치는지 알아보고자 세포 내 ATP 합성량을 측정하여 보았

다.결과 대조군과 비교하여 genistein을 처리했을 때 ATP level에는 변화가 없었

다.INS-1세포에서 해당과정을 거쳐 ATP를 생성하는 당대사 경로는 genistein에

의한 인슐린 분비 항진 현상과 관련이 없음을 확인하였다 (Fig.9).

F F

Fiiiggg...99.9.. EEEffffffeececctttooofffggegeennniiissstteteeiiinnnooonnnAAATTTPPP ppprrorooddduuucccttitiiooonnn...

INS-1cellswerepreincubatedwithKRB buffercontaining0.2mM glucosefor1 hrs.INS-1cellsweretreatedwithgenistein(G :50 μM)fortheindicatedtime (30,60,120 min) in the presence of Leu (20 mM)/Gln (10 mM) (((AAA))) or gelimepiride(5 μM)(((BBB))).IntracellularATP wasobtain by TCA/etherextraction

method. Quantity of ATP was detected by Luminescent assay. Data are

0 80 160 240 320 400 con 30 60 120 Leu/Gln Leu/Gln+G A T P l e v e l Time (min)

A

0 80 160 240 320 400 con 30 60 120 Leu/Gln Leu/Gln+G A T P l e v e l Time (min)

A

0 80 160 240 320 400 con 30 60 120 Glim epiride Glim epiride+G A T P l e v e l

B

Time (min) 0 80 160 240 320 400 con 30 60 120 Glim epiride Glim epiride+G A T P l e v e l

B

Time (min)

(39)

F F F..G.GGeeennniiistsstteeeiiinnn에에 의에 의의한한한 세세세포포포내내내 CCaCaa222+++_변_변_변화_화_화 인슐린을 분비하는 과정에서 Ca2+_{은 중요한 역할을 한다.인슐린의 1기 분비에서} 는 인슐린 낭과 세포막의 융합에 중요한 작용을 하며 인슐린 2기 분비의 다양한 신 호 전달에서 중요한 역할을 한다.Genistein을 처리하였을 때 세포내 Ca2+_{에는 어떠} 한 영향을 주는지 알아보기 위해 confocalmicroscopy을 이용하여 세포내 Ca2+_의

변화를 측정하였다.Leu/Gln에 genistein (50 μM)를 처리했을 때 Leu/Gln에 의해

증가되는 Ca2+_{농도 보다 더 증가함을 확인하였다 (Fi}_{g. 10A). 마찬가지로}

glimepireide(5 μM)에 genistein(50 μM)를 처리했을 때 세포내 Ca2+_{의 농도가 증}

가함을 확인하였다 (Fig.10B). 따라서 genistein에 의한 인슐린 분비 항진은 세포

내 Ca2+_{의 증가가 관련이 있음을 확인하였다.}

F F

Fiiiggg...111000... EEEffffffeeeccctt ot oofff gggeeenniniisssttteeeiiinnnooonnn[[[CCCaaa222+++]]]iii...

INS-1cellsstainedwithFruo3-AM (5μ M)for30minandthenstimulatedwith

genistein (G :50 μM)in the presence ofLeu (20 mM)/Gln (10 mM)(((AAA)))or glimepiride (5 μM)(((BBB))).IntracellularCa2+ _l_{oad were assessed by fl}_uorescence emissionoftheFruo-3loading.ThedatarepresentintracellularCa2+_changewi_th

0 100 200 300 400 0 60 120 180 Time (sec) 34 0 n m / 38 0 n m LG Glimepiride Glimepiride+G

B

0 100 200 300 400 0 60 120 180 Time (sec) 3 4 0 n m / 3 8 0 n m LG LG+G Leu/Gln Leu/Gln+G

A

B

A

(40)

G G G... GGGeeennniiisssttteeeiiinnn에에에 의의의한한한 인인인슐슐슐린린린 분분분비비비 항항항진진진에에 관에 관관련련련된된된 기기기작작작 조조조사사사 베타 세포에서 인슐린 분비에는 많은 신호전달 물질이 관여한다.대표적으로 PKA,PKC,CaMK Ⅱ를 들 수 있다 (Nesher등,2002).신호 전달 물질의 활성은 인슐린 2기 분비에 관여하며,인슐린 분비 효율을 증가시킨다.그러므로 genistein에 의해 증가된 인슐린 분비가 어떤 신호 전달 과정에 관여하는지 알아보고자 각각 신 호 전달 물질의 저해제로 실험을 수행하였다.또 단백질 level에서 신호전달 물질의 활성을 조사하였다. 1 1 1...LLLeeeuuu///GGGlllnnnmmmooodddeeelll Genistein에 의해 인슐린 분비 항진 효과를 보였던 포도당 외에 다른 영양물질인

Leu/Gln,pyruvate중 glucose보다 metabolite신호가 더 간결한 Leu/Gln에서 실험

을 수행하였다.Leu/Gln에 genistein을 처리하면 인슐린 분비가 촉진되는 데 이런

상황에서 각각 신호전달 저해제를 처리하여 인슐린 분비를 조사하였다.PI3kinase

저해제로 알려진 LY294002,wortmannin을 처리하였을 때 genistein에 의해 항진된

인슐린 분비가 감소되지 않았다.따라서 PI3kinase에 관련된 신호 전달은 genistein

에 의해 증가되는 인슐린 분비와 관련이 없음을 확인하였다 (Fig.11A).마찬가지로

mTOR 저해제로 알려진 rapamycine,AMPK (CAMP kinase) 활성제로 알려진

AICAR를 처리하였을 때 genistein에 의해 항진된 인슐린 분비가 감소하지 않았다

(Fig.11B).MAP kinase 저해제인 PD98059 (ERK inhibitor),SB203580 (p38

inhibitor),SP600125(JNK inhibitor)를 처리했을 때도 genistein에 의해 항진된 인

슐린 분비가 감소하지 않았다 (Fig.11C).그러므로 MAP kinase에 관련된 신호 전

달 또한 genistein에 의해 항진된 인슐린 분비와 관련이 없음을 확인하였다.

베타 세포에서 genistein에 의해 인슐린 분비가 항진되는데 그 기작은 cAMP 증

가를 통한 PKA 활성일 것이라는 논문이 보고되었다 (Liu등,2006).우리 실험 조

건에서도 PKA 활성이 genistein에 의한 인슐린 분비에 영향을 주는지 알아보고자

(41)

H89를 처리했을 때 genistein에 의해 항진된 인슐린 분비가 50% 감소했다.그러나

또 다른 약제인 PKA에 특이적인 peptide저해제를 처리했을 때에는 증가된 인슐린

분비가 감소하지 않았다 (Fig.12A).또 단백질 level에서 PKA 활성을 조사해 보고

자 immunoblotting방법을 통해 genistein을 처리한 후 PKA의 활성을 조사해 보았

을 때 음성 대조군과 비슷한 양상을 보였으며,양성 대조군 (Forskoloin)과 비교하

여 활성화되는 양상을 나타내지 않았다 (Fig.12B).여기서 사용된 양성 대조군

(Forskoloin)은 인슐린 분비가 Leu/Gln만큼 되는 농도 10 μM을 사용하였다.너무

높은 농도는 당연히 PKA를 너무 많이 활성화 시킬 것이므로 genistein에 의한 인

슐린 분비 항진 효과를 보기 위한 대조군으로 적절하지 않다.따라서 우리의 실험

조건에서는 PKA 활성이 genistein에 의해 증가된 인슐린 분비와 관련 없음을 확인

하였다.

인슐린 분비에 관여하는 중요한 신호 전달 과정 중 PKC 활성의 영향을 알아보기

위해 PKC의 모든 isoform을 저해하는 것으로 알려진 GF109203X 과 PKCα,β,δ,

ε,ζ,η 를 저해하는 Go6983과 PKCα,β,g를 특이적으로 저해하는 Go6976을 처리

하고 인슐린 분비를 조사하였다.그 결과 저해제를 처리하여도 증가된 인슐린 분비

에는 변화가 없었으며 (Fig.13A),단백질 level에서 genistein에 의한 PKC 활성 또

한 양성 대조군인 PMA와 비교하여 크게 증가하지 않았다 (Fig.13B).여기서 사용

된 PMA 농도 또한 forskoloin과 동일하게 인슐린 분비를 Leu/Gln만큼 증가시키는

농도를 사용하였다.그러므로 genistien에 의한 인슐린 분비 항진 효과에서 PKA 뿐

만 아니라 PKC 활성과 관련이 없음을 확인하였다.

CaMK Ⅱ의 저해제로 알려진 KN-62,KN-93을 처리했을 때 genistein에 의해 증

가된 인슐린 분비가 기저 농도로 감소하였고,calmodulinantagonist인 W-7을 처리

했을 때는 인슐린 분비가 50%이상 감소하였다.좀 더 정확한 확인을 위해 CaMK

Ⅱ에 특이적인 peptideinhibitor(281-309)를 처리하였을 때 앞의 저해제들과 마찬

가지로 genistein에 의해 증가된 인슐린 분비가 감소하는 것을 확인하였다 (Fig.

14A).마찬가지로 단백질 level에서 CaMK Ⅱ 활성을 조사하였다.Genistein (50 μ

(42)

Genistein에 의한 CaMK Ⅱ활성이 어떤 양상을 나타내는지 알아보기 위해

genistein을 시간별로 처리하여 보았을 때 7.5분,15분에서 CaMK Ⅱ활성이 대조

군인 Leu/Gln에서 보다 더 증가함을 확인하였다 (Fig.14C).그리고 genistein에 의

한 CaMK Ⅱ 활성은 빠른 시간 내에 증가했다가 감소하였다. 따라서 genistein에