Effect of Scutellaria Baicalensis on Reduction of Radiation/chemotherapy induced Inflammation

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점막염은 항암화학요법 혹은 방사선요법과 같은 항암치료에서 의해 흔히 발생 하는 부작용 중의 하나이다 . 항암화학제제 혹은 방사선으로 인한 점막의 손상은 염증반응의 결과로 생각되고 있다 . 현재까지 수많은 천연약재의 항염증 효과에 대한 연구가 있었다 . 본 연구에서는 황금 (黃芩, Scutellaris baicalensis)의 항염증 효과를 in vivo (methotrexate(MTX) 유도 장염 혹은 방사선직장염 동물모델 ) 및 in vitro 실험을 통해 알아보았다 .

In vivo 실험에서는 6-8주령의 암컷 Wistar Rat을 사용하였다 . 다양한 농도의

황금 (黃芩)을 일회 투여량이 1cc가 되도록 증류수에 녹여서 사용하였다 . 방사선조 사 혹은 MTX 투여 전 7일간 그리고 이후 쥐를 희생시켜 조직을 얻을 때까지 (방 사선직장염 모델에서는 총 17일 , MTX 유도 장염 모델에서는 총 12일간 투여 ), 1 일 1회 경구투여하고 정상대조군은 동량의 생리식염수를 투여하였다 . MTX 유도 장염을 만들기 위해 MTX 2.5mg/kg을 3일간 하루에 한번 피하주사하였다 . MTX에 의한 장점막 손상의 조직학적 변화는 치료 후 5일째에 평가하였다 . 방사 선직장염 모델의 경우 실험쥐의 골반에 17.5Gy의 선량을 일회 , 전방 일문 조사하 였다 . 급성기과 만성기 점막의 변화를 관찰하기 위하여 방사선 조사 후 10일과 6 주째에 쥐를 희생하여 조직을 얻었다 . In vitro 실험에서는 황금 (黃芩)의 항염증 작용기전을 밝히기 위한 실험을 시

행하였다 . 대표적인 염증반응 세포인 대식세포주 (mouse macrophage cell line),

RAW 264.7 세포를 30분간 황금 (黃芩)으로 전처리한 후 100ng/ml의

lipopolysaccharide(LPS)_{로 자극하였다 . 염증반응을 촉진하는 주요 싸이토카인}

(IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS, Cox-2)들의 생성 변화를 RT-PCR로 평가하였다 . 황금 (黃芩)에 의한 염증반응 조절 기전을 알아보기 위하여 Erk 및 p38의 인산화

(6)

정도 , MAP kinase-specific phosphatases (MKPs)의 발현 , 및 핵 내 NFκB p65 의 양을 측정하였다 .

In vitro 연구에서 황금 (黃芩)의 전처리는 LPS에 의해 증가된 IL-1 및 iNOS

mRNA 발현을 감소시켰다 . 이에 반해 IL-6, Cox-2 및 TNF-α mRNA의 발현은

억제시키지 못했다 . 황금 (黃芩)은 LPS에 의해 자극된 RAW 264.7 세포에서 Erk 및 p38의 인산화를 감소시켰고 , MKP-1의 발현을 증가시켰다 . 또한 황금 (黃芩)은 핵 내 NFκB의 양을 소량 감소시켰다 . 그러나 MTX와 방사선으로 유발된 소장 점막염의 쥐모델에서는 염증을 감소시키는 뚜렷한 효과가 없었다 . 이상의 연구결과는 황금 (黃芩)이 MKP-1의 활성화를 통해 Erk 및 p38를 억제 하고 덧붙여 NFκB가 핵 내로 이동하는 것을 억제함으로써 항염증 효과를 나타 냄을 보여 주었다 . 그러나 본 연구에서 사용한 황금 (黃芩)의 양으로는 MTX와 방사선에 의한 장점막 손상을 감소시킬 수는 없었다 . 핵심어 : 황금 (黃芩), 항염증 효과 , 방사선직장염 , MTX 유도 장염 , 장점막손상 , RAW 264.7 세포

(7)

차

례

국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅲ 그림 차례 ··· ⅳ 표 차례 ··· ⅴ Ⅰ. _{서론 ··· 1} Ⅱ. 연구 방법 ··· 4 A. 황금의 추출 ··· 4 B. in vivo _{실험 ··· 4} 1. 실험동물 ··· 4 2. 황금의 경구투여 ··· 4 3. _{항암화학요법제제 (MTX)의 투여 (MTX 유도 장염 모델 ) ··· 5} 4. 방사선 조사 (방사선직장염 모델 ) ··· 5 5. 육안 및 현미경에 의한 병변 관찰 ··· 5 C. in vitro _{실험 ··· 7} 1. 세포주 ··· 7 2. 염증성 싸이토카인 생성에 대한 황금의 영향 ··· 7 Ⅲ. _{결과 ··· 10} Ⅳ. 고찰 ··· 16 Ⅴ. 결론 ··· 20 참고문헌 ··· 21 ABSTRACT ··· 31

(8)

그

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차 례

례

Fig. 1. Inhibitory effects of S on the inflammation-induced expression of IL-1, IL-6, Cox-2, iNOS, and TNF-α genes in LPS stimulated RAW 264.7 cells.(RT-PCR) ··· 11

Fig. 2. S inhibits phosphorylations of Erk and p38 via MKP-1 activation in LPS stimulated RAW 264.7 cells. ··· 13 Fig. 3. Effect of S on NFκB nuclear translocation. ··· 14

(9)

표

표 차

차

차 례

례

Table 1. Effect according to concentration of S in MTX induced enteritis ··· 9 Table 2. Effect of S on MTX induced Enteritis ··· 10

(10)

I.

I. 서

서

서 론

론

방사선 및 항암화학요법은 종양의 살상효과와 함께 정상조직의 손상을 초래 하며 이 손상으로 인해 상당수의 환자들은 다양한 증상을 경험하게 된다 . 예를 들어 방사선치료 시 구강과 소화기계통의 점막염 발생률은 전체 치료 환자의 약 10% 정도이며 항암화학요법이 병합될 경우 40% 이상 , 특히 두경부 종양의 경우 방사선치료 후에 100%의 환자에서 발생하기도 한다 (NCI 2005). 비록 의학물리학 의 발달 및 표적치료의 개발로 정상세포의 손상을 최소화할 수 있는 다양한 치 료기술들이 사용되고 있지만 한계선량 이상의 방사선이 조사될 경우 부작용의 발생은 불가피하다 (Portelacne 등 , 2001). 초기 점막염은 방사선치료 중 대부분의 환자에게서 나타나며 간혹 치료의 변경을 요할 정도로 심각한 경우도 있지만 보 통은 증상이 일시적이고 치료의 종료와 함께 소실된다 . 반면 , 만성 점막염은 드 물게 발생하지만 증상이 장기간 지속될 경우 환자의 삶의 질을 저하시키고 심할 경우 생존률에 영향을 미칠 정도로 매우 중요한 부작용이다 . 본 연구에서 주로 다루고 있는 소화기계통의 점막염은 자궁경부암 , 전립선 암과 같은 골반강에 대한 방사선치료 혹은 항암화학요법 시에 흔히 발생한다 (Dewit 등 , 1983; Hanlon 등 , 1997; Pilepich 등 , 1984). 방사선에 의한 급성 부작 용의 증세 및 병상으로는 설사 , 변비 , 배변급박 (tenesmus), 이급후중 (裏急後重) 등의 장운동이상과 심할 경우 영양장애를 동반하기도 한다 (Benson 등 , 2001; Hauer-Jensen 등 , 2003; Schulthesis 등 , 1997). 만성 장점막염은 방사선치료 종 료 후 6개월에서 3년 사이에 주로 나타나며 , 장루 , 유착 , 수혈을 요할 정도의 출 혈 등 심각한 부작용의 발생은 전체 만성 장점막염 환자 중에서 10년에 5%정도 발생하는 것으로 보고되고 있다 (Nostrant 등 , 1999). 방사선 치료 후 점막염의 발 병율과 심각도는 방사선량 , 방사선이 조사된 부위의 크기 , 분할치료여부 , 동반된 항암화학요법 , 질병의 상태 , 관찰기간에 따라 다르며 (Eifel 등 , 1995; Letschert

(11)

등 , 1994; Mak 등 , 1994), 이 밖에 환자의 연령 , 체중 , 성별 , 간 및 신기능 , 약리유 전학적인 차이도 증상의 발병과 심각도에 영향을 미칠 수 있다 (Kase 등 , 1999). 대부분의 항암화학요법제제는 과도한 용량에서 구강 및 소화기계통의 점막 염을 유발할 수 있으며 특히 5-fluorouracil(5-FU), methotrexate(MTX), etoposide _{등은 점막염의 위험성이 높으며 , 흡연 , 구강위생 , 연령 , 여성 , 이전의 항} 암 치료력 등에 따라서도 위험도가 높아진다 (Avritscher 등 , 2004). 위에 기술된 방사선 및 항암화학요법에 의한 점막염의 발생기전으로 치료시 작과 함께 발생한 활성산소에 의한 직접적인 세포손상 , DNA 손상 , 전사인자 및 전염증인자의 증가 , ceramide, caspase 경로를 통한 이차적 염증인자의 증폭 등 이 제시되고 있다 . 재생된 점막은 정상적인 외형을 갖고 있으나 신생혈관의 잔류 를 포함한 점막 내부의 환경변화로 추가적인 점막염 등 항암화학요법 부작용의 위험도가 높아지게 된다 (Sonis 등 , 2004). 방사선 및 항암화학요법에 의한 점막염은 한의학적으로 살펴 볼 때 화열사 독 (火熱邪毒)으로 볼 수 있으며 이는 종양이 열에 약한 이론에 의해 극심한 화열 사독 (火熱邪毒)으로 이독제독 (以毒除毒)하는 과정에서 정기 (正氣)가 상하게 되어 발생하게 되는 것이다 . 이러한 점막염에 사용되는 한방처방은 증상과 부위에 따 라서 각 의서마다 수많은 처방이 수록되어 있으나 그 중에서 초기 소화기계통 점막염에 많이 사용되는 처방은 사심탕 (瀉心湯) 계열이다 (Kase 등 , 1999). 사심탕 (瀉心湯)의 구성약물 중에서도 황금 (黃芩, Scutellaris baicalensis)은 소화기계통 의 염증에 상용되는 약물로 그 사용빈도가 매우 높다 (李學章 등 , 1997). 황금 (黃芩)은 청열조습 (淸熱燥濕), 사화해독 (瀉火解毒), 청열양혈 (淸熱凉血), 안태 (安胎)의 효능으로 증열번갈 (蒸熱煩渴), 폐열해수 (肺熱咳嗽), 습열설리 (濕熱泄痢), 황달 (黃疸), _{열림(熱淋), 토뉵 (吐衄), 붕루 (崩漏), 목적종통 (目赤腫痛), 태동불안 (胎動不安),} 옹종정창 (癰腫疔瘡)에 활용된다 (중약대사전 ). 현대 약리학적으로 황금 (黃芩)은 40 종이상의 flavonoids를 함유하고 있는데 그 중 baicalein, baicalin, chrysin,

oroxylin-A, oroxylin-a-7-Oglucuronide, wogonin, wogonoside, skullcapflavone,

(12)

정유 , stigmasterol을 함유하고 있다 (김호철 , 2004). 주요한 효능으로는 항박테리 아 , 항바이러스 (Huang 등 , 2000; Kitamura 등 , 1998; Wu 등 , 2001), 항염증 (Li 등 , 2000; Wakabayashi 등 , 1999), 진정 (Wang 등 , 2000), 간기능 보호 (De Boer 등 , 2005; Huang 등 , 2006; Jang 등 , 2003), 항산화 (Shieh 등 , 2000), 항우울 (Hui 등 , 2002), 항암작용 (Ikemoto 등 , 2000; Matzsuzaki 등 , 1996; Zhang 등 , 2003), 항 암제의 치료효율 상승효과 (Fas 등 , 2006), 신경세포 보호작용 (Ho 등 , 2004; Lee 등 , 2003; Shang 등 , 2006; Shurygin 등 , 2002; Zhang 등 , 2006), 항남성호르몬 및 성장억제효과 (Bonham 등 , 2005)가 보고되어 있다 .

본 연구에서는 방사선 및 항암화학요법에 의한 장점막염에 대한 황금 (黃芩) 추출물의 효과를 방사선 및 MTX로 유발한 장점막염 동물모델을 통해 관찰하고 세포실험으로 그 기전을 알아보고자 하였다 .

(13)

II.

II. 연

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법

A. A. A. A. 황황황금금금 ((((黃黃黃黃芩芩)芩芩)))의의의 추추추출출출

황금 (Scutellaris baicalensis Georgi, 한국 , 의성 , 경희의료원 약재과 ) 10g을 증류수 1L에 넣어 12시간 실온에서 침출한 후 60분간 전탕하였다 . 여기서 얻은 추출액을 진공상태 하에서 고농축한 후 (Brix50; Leica corporation, Buffalo, NY.

US), _{다시 10배의 증류수로 희석하고 용매를 이용하여 hexane분획 , choloform분}

획 , ethyl분획 , butanol분획 등을 추출하였다 . 이들을 혼합한 액상추출물을 실험에 사용하였다 .

B. B. B.

B. in in in in vivovivovivovivo 실실실험험험

1. 실험동물

주령 6-8주 , 180-220g의 암컷 Wistar rat (Charles River Laboratories

Japan)을 표준화된 환경 (온도 22±2℃, 습도 55-60%, 12시간 단위의 명암주기 ) 하

에서 고형사료와 물을 자유로이 공급하면서 사육하였다 . 일주일동안의 순응기간 을 거친 후 실험을 시작하였다 .

실험쥐는 다음과 같이 군을 나누었다 ; 정상대조군 (Normal), 방사선조사 단독 군 (RT alone), Methotrexate 단독 투여군 (MTX alone), 황금 단독 투여군 (S

alone), 방사선과 황금 병용군 (RTx+S), 및 MTX와 황금 병용군 (MTX+S). 2. _{황금 (黃芩)의 경구투여} 세 가지 농도 (5, 10, 15mg/kg/day)의 황금 (黃芩)을 일회 투여량이 1cc가 되도 록 증류수에 녹여서 사용하였다. 방사선조사 혹은 MTX 투여 전 7일간 그리고 이후 쥐를 희생시켜 조직을 얻을 때까지 (방사선직장염 모델에서는 총 17일 , MTX 유도 장염 모델에서는 총 12일간 투여 ), 1일 1회 경구투여하고 정상대조군

(14)

은 동량의 생리식염수를 투여하였다 . 만성적 변화관찰의 경우 추가적인 투약은 하지 않았으며 6주째 쥐를 희생하여 조직검사하였다 . 3. 항암화학요법제제 (MTX)의 투여 (MTX 유도 장염 모델 ) MTX 2.5mg/kg_{을 피하주사로 1일 1회 , 총 3일간 연속 주사하였다 . 대조군} 은 동량의 식염수를 주사하였다 . 4. _{방사선 조사 (방사선직장염 모델 )} 쥐는 0.04 ml/200 g의 xylazine chloride (23.32 mg/ml, 바이엘코리아 )와 0.16 ml/200 g의 ketamine hydrochloride (50 mg/ml, 유한양행 )을 혼합하여 복강 내 주사로 마취하였다 . 1 cm 두께의 나무판에 5마리씩 배와위 (supine position)로 나란히 눕힌 후 직장이 위치한 골반강 전체에 방사선을 조사하였다 . 방사선은 6MV 선형가속기로 17.5 Gy를 1회 , 전방 일문 조사하였다 . 5. 육안 및 현미경에 의한 병변 관찰 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 방사선 조사 후 10일째 (급성변화 ) 및 6주 째 (만성변화 ), 혹은 MTX를 주입한 첫날로부터 5일째에 각각 실험쥐를 희생시키 고 방사선직장염 모델에서는 직장 , MTX 유도 장염모델에서는 소장의 일부 (5 cm, jejunum-ileum)를 얻었다 . 점막병변의 정도를 육안으로 관찰한 후 조직의 일부로 파라핀 블럭 및 조직 슬라이드를 만들고 헤마톡실린 -에오신 염색을 하였다 . 육안 및 조직학적 변화를 아래에 서술한 기준에 따라 점수화하여 정량적으로 분석을 하였다 . MTX 유도 장염 모델에서는 조직학적 변화만을 관찰하였다 . <MTX MTX MTX MTX 유유유도도도 장장장염염염 >

(15)

아래의 11개의 항목 각각에 대해 변화의 정도에 따라 14점까지 점수를 매기 고 이를 합산하여 비교하였다 (normal 1점 , mild 2점 , moderate 3점 , 및 severe 4 점 ). 점수는 최소 11점 (정상 )에서 최대 44점 (중증 )까지이다 .

1. villus fusion and stunting (atrophy)

2. disruption of brush border and surface enterocytes, 3. reduction in the numbers of goblet cells

4. reduction in numbers of mitotic figures 5. crypt loss and architectural disruption 6. disruption or distortion of crypt cells 7. crypt abscess formation

8. infiltration of polymorphonuclear cells and lymphocytes 9. dilatation of lymphatics and capillaries

10. thickening of the submucosal and muscularis external layers 11. edema of the submucosal and muscularis external layers

<_방_방_방사_사_사선_선_선직_직_직장_장_장염_염_{염 >}

조직을 얻은 즉시 장점막의 손상정도를 육안적으로 관찰하였고 아래에 서술 된 기준에 따라 등급 0∼4로 분류하였다 .

- 육안적 변화

0 : normal mucosa

1 : edema, mild hyperemia, or decreased vasculality

2 : diffuse hyperemia, multiple punctate areas of hemorrhage, or confluent areas of hemorrhage

3 : presence of erosions or frank hemorrhage 4 : ulcers

(16)

- 조직학적 변화

장점막의 방사선에 의한 병리학적 변화를 급성기 (10일 )와 만성기 (6주 )에 각 각 아래에 서술된 기준에 따라 등급 0∼4로 분류하였다 .

Grade 0 Grade 0Grade 0

Grade 0 Grade 1Grade 1Grade 1Grade 1 Grade 2Grade 2Grade 2Grade 2 Grade 3Grade 3Grade 3Grade 3 Grade 4Grade 4Grade 4Grade 4

Histologic Findings Histologic FindingsHistologic Findings Histologic Findings

normal or minor alterations which cannot be ascribed with certainty to radiation

slight radiation damage

(mild inflammation and/or slight crypt damage) mild damage

(more significant inflammation and/or crypt damage) moderate damage

(must have prominent loss of epithelium, variable degree of inflammation)

severe damage (ulcers, necrosis)

Grade Grade Grade Grade 0 1 2 3 4 Grade 0 Grade 0Grade 0

Grade Grade Grade Grade 0 1 2 3 4 C. C. C.

C. in in in vitroin vitrovitrovitro실실실험험험

1. 세포주

대표적인 염증반응 세포인 대식세포주 , RAW 264.7 (mouse macrophage cell line, ATCC) 세포를 사용하였다 . 0.1%의 fetal bovine serum(FBS)이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 6-well plate에 well당 5 × 105

개의 세포수로 분주한 후 배양기 (37℃, 5％ CO2)에서 배양하였다 .

(17)

2. 염증성 싸이토카인 생성에 대한 황금 (黃芩)의 영향

황금 (黃芩)이 proinflammatory genes들의 발현에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 RAW 264.7 세포를 25 μg/ml, 혹은 50 μg/ml 농도의 황금 (黃芩)으로 처 리하고 30분 후에 100 ng/ml의 lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli

Serotype 055:B5, Sigma, USA)_{로 자극하였다 . 이후 일정시간에 실험을 위해 세}

포를 수확하였다 . 염증반응을 촉진하는 주요 싸이토카인들 (IL-1β, IL-6, TNF-α,

iNOS, Cox-2)의 생성 변화를 RT-PCR로 평가하였다 . RNA 분리 및 RT-PCR

방법은 다음과 같다 .

TRIzol reagent (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)을 사용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 총 RNA를 분리하였다 . RT-PCR은 분리한 총

RNA 1 μg_을 _사용하여 _{시행하였다 .} Glyceraldehydes-6-phosphate

dehydrogenase (GAPDH), Cox-2, IL-1, IL-6, iNOS, 및 TNF-α를 위한 primer suqence는 다음과 같다 . GAPDH; 5’-GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATC-3’ 5’-GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’ iNOS; 5’-CTGAGGGCTCTGTTGAGGTC-3’ 5’-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3’ Cox-2; 5’-GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC-3’ 5’-ATGGTCAGTAGACCTTTACAGCTC-3’ IL-1β; 5’TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3’ 5’TGTCCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC-3’ IL-6; 5’TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3’ 5’TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3’ TNF-α; 5’GCGACGTGGAACTGGCAGAAG-3’ 5’TCCATGCCGTTGGCCAGGAGG-3’

(18)

β-actin과 GAPDH는 invariant housekeeping gene internal control로 사용하였 다 . RT-PCR은 54-64 °C에서 23-30 주기를 시행하였다 .

다 . 황금 (黃芩)의 항염증 기전

RAW 264.7 _{세포에 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 염증 자극을 가한}

후 , 약제가 이 염증반응을 어떻게 조절하는지를 조사하였다 . 염증반응을 조절하 는 주요 신호전달체제인 MAP kinase 경로의 활성변화를 알아보기 위하여 Erk 및 p38의 인산화 정도 , 및 MAP kinase-specific phosphatases (MKPs)의 발현을 측정하였고 염증 반응 유도의 핵심 전사인자인 NF-κB와의 관련성을 알아보기 위하여 핵 내에 존재하는 NFκB p65의 양을 측정하였다 .

RAW 264.7 _{세포를 lysis buffer (50mM Trus pH 8.0, 150mM NaCl, 1%} NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate 및 protease inhibitor cockail tablet (Beohringer Mannheim) 포함 )를 사용해서 용해시켰다 . Erk 및 p38의 인산 화는 anti-phospho-Erk1/2, 및 anti-phospho-p38 항체들 (Cell Signaling

Technology, Beverly, MA)을 이용하여 immunoblotting 방법으로 측정하였다 . Erk, p38, IkB 및 NFκB p65에 대한 항체를 Cell Signaling Technology사로부터 구입하였다 . MKP-1의 측정은 anti-MKP-1 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz, CA)를 사용하였다 . Immunoreactive bands는 control anti-α-tubulin 항체 혹은 anti-lamin B1 항체 (Santa Cruz Biotechnology)의 band를 기준으로 하여 비교하였다 . 모든 blots은 ECL reagents (Amersham, UK)를 사용하여 재현 상하였다 . RAW 264.6 세포로부터 핵내 물질의 추출은 일반적인 방법으로 시행하였다 (Like _{등 , 2004). RAW 세포를 25 μg/ml 농도의 황금 (黃芩)으로 처리하고 30분} 후에 100 ng/ml의 LPS로 자극하였다 . 이후 3시간동안 배양한 후 세포를 수확하 였다 . D. D. D. D. 통통통계계계분분분석석석 자료값은 평균 ±표준편차로 나타내었다 . 실험군 간의 비교는 student's t-test

(19)

(20)

III.

III. 결

결

과

A. A. A.

A. in in in in vivo vivo vivo vivo 실실실험험험

1. MTX 유도 장염 모델 Table 1에서 보이는 것과 같이 MTX+S군은 15 mg/kg/day 용량에서 점수 21±7.3_{점 , MTX alone군은 22±7.9점으로 황금 (黃芩)이 MTX에 의한 장염에 대해} 감소시키는 경향을 보여주었다 . Table Table Table

Table 1. 1. Effect 1. 1. Effect Effect according Effect according according according to to to to concentration concentration of concentration concentration of of of Scutellaria Scutellaria Scutellaria baicalensisScutellaria baicalensisbaicalensisbaicalensis(S) (S) (S) (S) in

in in

in Methotrexate(MTX) Methotrexate(MTX) Methotrexate(MTX) induced Methotrexate(MTX) induced induced induced enteritisenteritisenteritisenteritis

Group Histologic change (median±SD)

Normal (N=5) 11±0.9 MTX alone (N=5) 22±7.9 MTX+S 5 mg/kg (N=11) 23±5.9 10 mg/kg (N=11) 28±7.3 15 mg/kg (N=11) 21±7.3 이를 바탕으로 15 mg/kg/day 단일농도로 2차 실험을 시행하였다 . 2차 실험 에서도 황금 (黃芩)을 사용한 군에서 비슷한 정도의 차이만을 보여주었고 (29.5±4.2_{점 대 30.5±4.9점 ) 뚜렷한 MTX 유도 장염의 개선효과를 나타내지 못했} 다 (Table 2).

(21)

Table Table Table

Table 2. 2. Effect 2. 2. Effect Effect Effect of of of of Scutellaria Scutellaria Scutellaria Scutellaria baicalensisbaicalensisbaicalensisbaicalensis(S) (S) (S) (S) on on on on Methotrexate(MTX) Methotrexate(MTX) Methotrexate(MTX) Methotrexate(MTX) induced

induced induced

induced Enteritis Enteritis Enteritis Enteritis

Group Histologic Score (median±SD) *_{No. of score < 29} Normal (N=6) 11±0.0 6/6 MTX alone (N=12) 30.5±4.9 2/12 S alone (N=6) 11±0.0 6/6 MTX+S 15 mg/kg (N=12) 29.5±4.2 4/12 *Methotrexate(MTX)단독 군에서 2마리를 제외한 모둔 쥐에서 30이상의 score를 보여 타군에서도 그 score를 기준으로 손상된 쥐의 수를 비교한 것임 . 나 . 방사선직장염 모델 MTX 유도 장염 모델에서 선정된 황금 15 mg/kg/day 용량을 사용하여 방 사선직장염에 대한 황금 (黃芩)의 효과를 살펴보았다 . Table 3에서 볼 수 있는 것 처럼 방사선직장염 모델에서도 황금 (黃芩)은 개선 효과를 보여주지 못했다 . Table Table Table

Table 3. 3. 3. 3. Effect Effect Effect Effect of of of of Scutellaria Scutellaria baicalensis(S) Scutellaria Scutellaria baicalensis(S) baicalensis(S) on baicalensis(S) on on on Radiation(RTx) Radiation(RTx) Radiation(RTx) Radiation(RTx) induced induced induced induced Proctitis

Proctitis Proctitis Proctitis

Group

10th day after Irradiation 6th week after Irradiation

Gross Histology Gross Histology

Normal 0±0 0±0 0±0 0±0

RTx alone 1.6±0.9 2.4±0.5 1.1±1.1 1.3±1.0

S alone 0±0 0±0 0±0 0±0

(22)

B. B. B.

B. in in in in vitro vitro vitro vitro 실실실험험험 : 황금의 항염증 기전

동물모델에서는 황금 (黃芩)의 항염증 작용을 관찰할 수 없었다 . 그러나

lipopolysaccharide(LPS)를 이용한 다른 동물 염증모델 (Balb/c mice를 이용한

airpouch model)_{에서는 항염증 작용을 나타냈기 때문에 (personal communication)} 황금 (黃芩, S, scutellaria baicalensis)의 항염증작용을 확인해보고자 in vitro 실 험을 시행하였다 .

S

25 50 (

µ

g/ml)

+ LPS

No

IL1 IL6 GAPDH Cox2 iNOS TNF-αααα

S

25 50 (

µ

g/ml)

+ LPS

No

IL1 IL6 GAPDH Cox2 iNOS TNF-αααα Fig. Fig. Fig.

Fig. 1. 1. Inhibitory 1. 1. Inhibitory Inhibitory Inhibitory effects effects effects effects of of of of S S on S S on on on the the the the inflammation-induced inflammation-induced inflammation-induced inflammation-induced expression expression expression expression of

of of

of IL-1, IL-1, IL-1, IL-6, IL-1, IL-6, IL-6, IL-6, Cox-2, Cox-2, Cox-2, iNOS, Cox-2, iNOS, iNOS, iNOS, and and and and TNF-TNF-αTNF-TNF-αα genes α genes genes genes in in LPS in in LPS LPS LPS stimulated stimulated stimulated RAW stimulated RAW RAW RAW 264.7

264.7 264.7

264.7 cells cells cells cells (RT-PCR).(RT-PCR).(RT-PCR).(RT-PCR). Expression of IL-1, and iNOS genes were suppressed by pretreatment of S in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The supernatants were collected from the RAW 264.7 cells pretreated without (0) or with S at the doses of 25 ㎍/㎖ (25) and 50 ㎍/㎖ (50). A representative agarose gel

(23)

shown with GAPDH as an invariant housekeeping gene internal control.

황금 (黃芩)이 대표적인 염증성 싸이토카인인 IL-1, IL-6, COX-2, iNOS 및

TNF-α의 발현에 미치는 영향을 알아보았다 . 25 μg/ml 와 50 μg/ml 두 가지 농

도의 황금 (黃芩)으로 전처리한 후 lipopolysaccharide(LPS)로 RAW 264.7 세포를 자극하였다 . 황금 (黃芩)의 전처리는 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 증가된 IL-1 및 iNOS mRNA 발현을 감소시켰다 (Fig. 1). IL-1의 경우 25 ug/ml의 농도에서 더 억제효과가 좋았고 iNOS에서는 황금 (黃芩) 농도에 따른 차이는 관찰되지 않 았다 . 이에 반해 IL-6, Cox-2 및 TNF-α mRNA의 발현은 억제시키지 못하였다 .

염증반응은 세포내 신호전달경로의 활성화에 의하여 일어나며 이는 Mitogen activated protein kinases (MAP kinase)의 활성화와 관련되어 있는 것 으로 보고되고 있다 . 따라서 황금 (黃芩)의 항염증 작용의 기전을 알아보기 위하

여 먼저 RAW 264.7 세포를 황금 (黃芩) 25 μg/ml로 처리한 후

lipopolysaccharide(LPS)에 의해 활성화된 Erk 및 p38이 억제되는지를 실험하였

다 . Fig 2에서 알 수 있는 것처럼 RAW 264.7 세포에서 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 Erk 및 p38의 인산화가 증가하였고 이는 황금 (黃芩)의 전처리에 의해 감소하였다 . 반면에 Erk 및 p38의 총 단백질 양은 lipopolysaccharide(LPS) 혹은 황금 (黃芩)에 의해서 변하지 않았다 .

MAP kinase의 인산화는 MAP kinase에 의한 다양한 생리학적 효과를 증가

시키기 때문에 MAP kinase 인산화가 얼마동안 지속되는 지가 MAP kinase에 의해 매개되는 반응의 생물학적 결과를 나타내는 좋은 지표로 사용될 수 있다 . MKPs는 MAP kinase를 억제하는데 중요한 역할을 한다 . 따라서 MKP-1이 황금 (黃芩)에 의한 Erk 및 p38의 인산화 억제에 관련되는 지를 실험하였다 . lipopolysaccharide(LPS)로 자극한 후 RAW 264.7 세포에서 MKP-1 단백질 양이 약간 증가하였다 . 그러나 25 μg/ml 농도의 황금 (黃芩)으로 전처리한 결과 lipopolysaccharide(LPS)만을 처리하였을 때 보다 MKP-1 단백질이 더욱 증가하

(24)

였다 (Fig. 2). 이는 황금 (黃芩)이 MKP-1 단백질을 증가시켜 MKP-1을 활성화 시키고 결과적으로 항염증 작용을 나타낸다는 것을 의미한다 . LPS (100 ng/ml) - + + - + + S (25 µg/ml) - - + - - + 30 60 (min) p-pERK pERK p-p38 p38 MKP1 IkB α αα α-tubulin LPS (100 ng/ml) - + + - + + S (25 µg/ml) - - + - - + 30 60 (min) p-pERK pERK p-p38 p38 MKP1 IkB α αα α-tubulin Fig. Fig. Fig.

Fig. 2. 2. 2. 2. Scutellria Scutellria Scutellria baicalensis(S) Scutellria baicalensis(S) baicalensis(S) baicalensis(S) inhibits inhibits phosphorylations inhibits inhibits phosphorylations phosphorylations phosphorylations of of of of Erk Erk Erk Erk and and and and p38

p38 p38

p38 via via MKP-1 via via MKP-1 MKP-1 MKP-1 activation activation activation activation in in lipopolysaccharide(LPS) in in lipopolysaccharide(LPS) lipopolysaccharide(LPS) stimulated lipopolysaccharide(LPS) stimulated stimulated RAW stimulated RAW RAW RAW 264.7

264.7 264.7

264.7 cells. cells. cells. cells. The levels of phosphorylation of Erk, p38, and JNK kinases were measured in LPS stimulated Raw 264.7 cells treated with or without 25 ㎍/ ㎖) of S. At 0.5h after treatment with (+) or without (-) S, Raw 264.7 cells were incubated along with (+) or without (-) 100ng/ml LPS. The levels of phosphorylated (p-pErk) or total (pErk) Erk were detected by immunoblotting using anti-phospho-Erk (Thr202 and Tyr204) and anti-Erk antibodies, respectively. Also, that of phosphorylated (p-p38) or total (p38) p38 was detected using anti-phospho-p38 (Thr180 and Tyr182) and anti-p38 antibodies, respectively. Effect of S on upregulation of MKP-1. Raw 264.7 cells were untreated or treated with 25 ㎍/㎖ S for the indicated time intervals. The levels of total MKP1 was detected by immunoblotting using

(25)

anti-MKP-1 antibodies. The amount of α-tubulin is shown as a quantitative control.

S: Scutellraria Baicalensis, LPS:　lipopolysaccharide

MAP kinase의 인산화가 NFκB에 의해 매개되는 염증성 싸이토카인의 전사 를 활성화하는 신호전달경로를 활성화한다고 알려져 있다 . 따라서 본 연구에서 관찰된 황금에 의한 Erk 및 p38의 억제가 NFκB에 의해 매개되는 염증성 싸이 토카인의 감소와 연관되어 있는지를 알아보았다 . 이를 위해 NFκB에 의해 매개 되는 경로의 활성화를 위해 필수적인 과정인 NFκB의 핵내 이동을 황금이 억제 하는 지를 실험하였다 . Fig 3은 LPS에 의해 핵 내 NFκB가 증가하며 25 μg/ml 의 황금 전처리에 의해 핵 내 NFκB의 양이 감소하는 것을 보여주고 있다 (Fig 3).

NF-kB p65

Lamin B1

LPS (100 ng/ml)

-

+ +

S (25

µ

g/ml) -

-

+

3 (hr)

NF-kB p65

Lamin B1

LPS (100 ng/ml)

-

+ +

S (25

µ

g/ml) -

-

+

3 (hr)

LPS (100 ng/ml)

-

+ +

S (25

µ

g/ml) -

-

+

3 (hr)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 3. 3. 3. 3. Effect Effect Effect Effect of of of of S S S on S on NFon on NFNFNFκκκκB B nuclear B B nuclear nuclear translocation. nuclear translocation. translocation. translocation. S reduces level of NF κB present in nucleus by inhibiting LPS-induced NFκB nuclear translocation. At 0.5 h after treatment with (+) or without (-) S (25 ㎍/㎖), Raw 264.7 cells were further incubated along with (+) or without (-) 100 ng/ml LPS. Nuclear extracts were analyzed for measurement of levels of NFκB present in nuclei. The amount of lamin B1 protein is shown as a nuclear quantitative control. S: Scutellraria Baicalensis, LPS:　lipopolysaccharide

(26)

IV.

IV. 고

고

고찰

찰

방사선치료 혹은 항암화학요법에 의한 점막염은 치료부위 및 치료량 , 치료 기간에 따라 각종 증상을 나타낼 수 있다 . 방사선치료 및 항암화학요법의 부작용 은 전신성 반응과 국소성 반응으로 나눌 수 있으며 , 전신반응으로는 피로 , 식욕 감퇴 , 구역 ․구토 , 혈압하강 , 골수억제 , 면역력 저하에 따른 감염 등이다 . 국소반 응은 방사선조사부위에 따라 소화기계통의 반응 , 두경부 반응 , 방사성폐렴 등 다 양하다 . 소화기계통의 반응으로는 식도암 , 폐암 , 종격동암 등에 방사선 조사 후 연하장애 , 인후통 , 흉골후면의 통증 또는 경색감 등이 있으며 위부의 치료 후 점 막수종 및 궤양이 발생할 수 있으며 구역이 주로 나타난다 . 직장부위에는 복통 , 설사 , 점액혈변 , 이급후중 (裏急後重), 배변장애 등의 증상이 나타날 수 있으며 만 성적으로는 변비 , 혈변 , 혈뇨 , 드물게는 장루가 생길 수 있다 . 여성의 경우 질협 착이 발생할 수도 있다 . 두경부의 비인강암 , 후두암 , 구강내암 , 경부임파선종양의 치료 후에는 구강건조 , 인후종통 , 구강궤양 , 설염 등이 발생할 수 있다 . 또한 흉 곽부의 치료 후에는 객담이 없거나 조금 있는 기침 , 구강건조 , 후두부 소양감 , 단 기 및 심한 경우에는 황담 , 발열을 동반하는 폐렴이 발생할 수 있다 (陳槿彰, 1999). 이와 같은 방사선치료 및 항암화학요법의 부작용은 환자의 삶의 질을 저 하시키며 심한 경우 치명적인 결과를 가져올 수도 있으며 또한 항암치료의 지속 적인 시행과 효과적인 용량의 치료를 제한 할 수도 있다 (Hill 등 , 1992). 서양의학에서는 골반부위 방사선치료 후에 발생한 만성 부작용에 대해 5-aminosalicylic acid(Johnson 등 , 2003), balsalazide(Pruitt 등 , 2002), loperamide, sucralfate(Kochhar 등 , 1999), corticosteroid(Kochhar 등 , 1991), formalin(Counter 등 , 1999; Myers 등 1998; Pikarsky 등 , 2000), short chain fatty acid(Pinto 등 , 2001), hyperbaric oxygen(Kitta 등 , 2000; Woo 등 , 1997), antioxidants(Ehrenpreis 등 , 2005; Kennedy 등 , 1999), misoprostol(Khan 등 , 2000) 등의 약물에 의한 치료방법 , 내시경 , 레이져 (Viggiano 등 , 1993), argon

(27)

plasma를 이용한 소작법 (Fantin 등 , 1999; Silva 등 1999), 수술요법 (Von Flue등 , 1999) _{등을 사용하고 있다 . 그러나 이러한 연구들은 출혈에 대한 연구가 주를 이} 루고 있으며 기타 자주 보고되는 증상에 대한 연구는 등한시되고 있어 이런 증 상에 대해서는 추가적인 연구 및 치료의 개입이 필요하다 . 한의학에서는 이러한 항암치료 중 나타나는 증후의 기전을 방사선이나 항암 화학요법제제로 인한 열성상음 (熱盛傷陰), 진액수손 (津液受損), 기혈불화 (氣血不和), 비위실조 (脾胃失調), 모기상혈 (耗氣傷血), 간신휴손 (肝腎虧損)으로 보고 있다 . 다시 말하면 방사선 , 혹은 항암화학요법 등에 의한 염증의 증가로 음진 (陰津)이 소모되고 간 (肝), 비 (脾), 신 (腎)의 기능이 저하되는 것을 말한다 . 특히 방사선치 료를 화열독사 (火熱毒邪)로 보며 인체에 작용하게 되면 열독과성 (熱毒過盛), 진액 수손 (津液受損)하게 되며 나아가서 작진련혈 (灼津煉血), 상음모기 (傷陰耗氣)하여 기혈손상 (氣血損傷), 비위실조 (脾胃失調), 간신휴허 (肝腎虧虛)하게 된다 . 즉 화열 (火熱)이 인체의 음액 (陰液)을 손상시키고 순차적으로 장부 (臟腑)에 까지 영향을 미치게 되는 것이다 . 항암화학요법은 방사선치료에 비해 열독상음 (熱毒傷陰)의 증후가 심하지 않으므로 보기양혈 (補氣養血), 건비화위 (健脾和胃), 자보간신 (滋補肝腎)의 부정 (扶正)위주로 치료한다 (조종관 , 2005). 최근의 연구들은 한방의 각종 약물치료와 침구치료가 방사선치료 및 항암화 학요법의 후유증에 대해 일정한 작용을 하는 것으로 보고하고 있다 . 이 방면에서 현재까지 진행된 한약물 연구는 항암치료 후 면역손상에 대한 조절작용 (陳槿彰, 1999; 黃曉 _{등 , 2000; 李學章 등 , 1997; 歲志勇 등 , 1998), 위장반응에 대한 작용} (劑健 등 , 1999; 張强 1999), 골수억제 보호작용 (김정주 등 , 1997; 이능기 등 , 1997; 劑善庭 등 , 2001; 李萍萍 등 , 1995; 泥文 등 , 2000; 錢顔方 등 , 1997; 王倫先 등 , 2001), 항암치료 효율의 상승작용 (Zhang 등 , 2003; 沈國偉 등 , 1996; 歲志勇 등 , 1998; 王勁 등 , 1999; 許立 등 , 2001), 방사선치료 후 자유라디칼에 의한 손상 의 보호작용 (高碧霄 등 , 1999; 王炳勝 등 , 2000), 방사선치료 후의 동물 사망률 감 소 및 생존기간 연장 (李明 등 , 2000; 周宜强 등 , 2002), 방사선 피부염에 대한 효 과 (王倫先 등 , 2001), 방사선식도염에 대한 효과 (沈國偉 등 , 1996) 등의 보고가 있

(28)

으며 침구치료 또한 일정한 효과가 있다고 보고하고 있다 (Johnstone 등 , 2001; Lu _{등 , 2005; 高碧霄 등 , 1999; 黃曉 등 , 2000). 침술 관련 연구는 3상 임상연구로} 써 항암치료에 의한 구역 및 구토를 감소시키는 확실한 효과가 있음을 밝힌 바 있다 . 그러나 한약재를 이용한 연구들은 대부분 전신효과에 대한 것들이며 방사 선치료와 관련된 연구들도 쥐를 전신방사선치료를 한 뒤 생존기간을 확인한 연 구들이다 . 더욱이 대부분의 연구들이 중국에서 이루어진 것으로 상세한 연구결과 를 알기 힘든 경우가 많다 . 또한 임상에서 흔히 보는 항암치료에 의한 염증성 부 작용에 대한 효과를 검증한 연구는 없었다 . 본 논문에서 사용한 동물모델은 임상 에서 흔하게 경험하는 장 염증을 MTX 혹은 방사선으로 유발하고 염증 감소 효 과가 있다고 알려진 황금 (黃芩)을 사용하여 염증정도의 감소를 알아보고자 한 첫 연구이다 . Li 등은 황금의 성분 중 하나인 baicalin의 항염증 기전을 연구하였는데 백 혈구에 대한 chemokine의 결합을 감소시키는 것을 확인하였다 (Li 등 , 2000). 이 연구에 의하면 baicalin은 TNF-α와 IFN-γ에 대한 효과는 없었다 . Baicalin의 항 염증 작용은 다양한 chemokine에 대한 결합과 관련되며 다만 이의 생물학적 기 능은 제한적임을 시사한다고 하였다 . Chen 등은 황금의 주요성분인 baicalin,

caicalein _{및 wogonin이 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서 iNOS 와 Cox-2}

gene expression 및 NO 생성에 미치는 효과를 연구하였다 . 세가지 성분 모두 용

량의존적으로 iNOS gene expression 및 NO 생성을 감소시켰다 . 그러나 PGE-2 생성 및 Cox-2 gene 발현은 wogonin에 의해서만 감소하는 결과를 확인하였다

(Chen 등 , 2000). 본 in vitro 연구에서 사용한 황금 (黃芩) 추출물이 LPS로 자극 한 RAW 264.7 세포에서 MKP-1의 활성화를 통해 Erk 및 p38를 억제하고 덧붙 여 NFκB의 핵 내로의 이동을 방해함으로써 항염증 효과를 나타냄을 보여주었 다 . 그러나 이러한 in vitro 연구결과와는 달리 방사선 및 MTX로 유발된 장염의 동물모델에서는 항염증효과를 확인할 수 없었다 . 반면 , 공동연구자 김은혜가 시 행한 Balb/c mice의 airpouch 모델의 연구에서는 동일한 농도의 황금 (黃芩)이 뚜 렷한 항염증작용을 보였다 (개인적 소통 , 논문 준비중 ). 위에 인용한 연구들에서

(29)

보여주듯이 각각의 황금 구성성분에 따라 염증관련 인자에 대한 효과가 다를 수 있으며 그 결과 임상 증상의 개선효과도 상이하게 나타날 수 있을 것이다 . 따라 서 본 동물모델 연구 결과와 연관시켜 볼 때 항암치료에 의한 염증반응에 보다 효과적으로 작용할 수 있는 황금의 유효 성분을 찾아내고 이의 농도에 따른 효 과를 규명하는 연구가 필요할 것으로 생각된다 . 한의학에서는 급성기의 직장 점막염은 대장열 (大腸熱)로 인한 이급후중 (裏及後重), 열비 (熱秘), 장풍장독 (腸風腸毒), 적백리 (赤白痢)로 보며 방광점막염으로 인한 소변빈삭은 임증 (淋症)이며 전립선의 점막염으로 인한 소변혼탁은 적백탁 (赤白濁)에 해당된다 . 음부의 점막 충혈 및 궤양은 증상으로는 음식 (陰蝕), 음통 (陰痛)에 해당된다 . 이러한 증상은 급성기는 모두 음허열증 (陰虛熱症)으로 볼 수 있으며 사용되는 약물로는 황금 (黃芩), 황연 (黃連), 치자 (梔子), 용담초 (龍膽草), 차전자 (車前子), 대황 (大黃) 등의 청열약물 (淸熱藥物)을 주로 사용하며 , 염증의 상 황에 따라 복령 (茯笭), 택사 (澤瀉), 저령 (豬苓), 창출 (蒼朮) 등의 삼습약물 (滲濕藥物), _{지유 (地楡), 괴화 (槐花), 형개탄 (荊芥炭), 생강피탄 (生薑皮炭), 선학초 (仙鶴草)} 등의 지혈약물과 함께 사용하기도 한다 . 직장점막염의 아급성증상으로 나타나는 식사 후 바로 대변을 보는 손설 (飱泄)은 비양허 (脾陽虛)에 해당되며 , 만성기의 섬 유화 증상 (배변 및 배뇨장애 , 동반된 출혈 )은 기혈양허 (氣血兩虛), 신양허 (腎陽虛) 에 어열 (瘀熱)이 결합된 형태이다 (李政育, 1999). 따라서 본 연구의 동물모델 결 과에서도 알 수 있는 것처럼 실제 임상에서는 단일 약재의 사용보다는 환자의 증상에 따라 기타 약물과의 동시사용이 불가피할 것이다 .

(30)

V.

V. 결

결

결 론

론

본 연구는 황금 (黃芩)이 MKP-1의 활성화를 통해 Erk 및 p38를 억제하고 덧붙여 NFκB의 핵 내로의 이동을 억제함으로써 항염증 효과를 나타냄을 보여주 었다 . 그러나 이러한 항염증 효과를 in vivo 실험에서는 확인할 수 없었다 . MTX 유도 장염 동물모델에서 약간의 염증감소 경향을 나타내는 농도 , 15mg/kg/day를 확인할 수 있었으나 , 방사선직장염 동물모델에서는 급성 및 만성 직장염 정도가 대조군에 비해 전혀 차이가 나지 않았다 . 황금 (黃芩)은 실제 임상에서 다용되는 항염증성 약물이다 . 비록 in vitro실험 에서 항염증효과를 확인하였으나 동물모델 연구에서 항염증작용을 확인할 수 없 었던 것은 연구에서 사용한 방사선 혹은 항암화학요법제제로 인한 점막염이 일 반적인 염증보다는 매우 심한 염증변화였기 때문으로 생각된다 . 즉 , MTX나 방 사선과 같은 보다 강력한 염증반응에서는 황금의 항염증 효과가 상대적으로 미 약하여 실질적인 조직 손상을 개선시킬 정도가 되지 못했을 수 있다 . 이에 기존 연구결과의 추가적인 검증 , 보다 높은 농도의 사용 및 황금 (黃芩)의 각 분획별 연구가 필요하며 기타 약물과의 상호연계를 통한 복합약물처방에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다 .

(31)

참

참고

고

고문

문

문헌

헌

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ABSTRACT

-Effect of Scutellaria Baicalensis

on Reduction of Radiation/chemotherapy induced Inflammation:

Juno Yang

Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University

(Supervised by Professor Mison Chun)

Mucositis is a major complication associated with chemotherapy and radiation therapy for cancer. Mechanism of mucosal damage from both chemotherapy and radiotherapy are thought to be an inflammatory process. It has been known that many herbs have anti-inflammatory effect. This study was aimed to evaluate the anti-inflammatory effect of Scutellaria Baicalensis extract (S) in vitro and in vivo using Wistar rat with methotrexate (MTX) induced enteritis or radiation induced proctitis.

In vivo study, we used 6-8 week-old female Wistar rat. Rats for MTX induced enteritis were orally administrated once a day with three different concentrations (5, 10, and 15 mg/kg) of S and saline for total 12 days from one week before MTX injection and then subcutaneously injected with MTX (2.5 mg/kg/day, once a day) for 3 days to induce intestinal mucositis. The histologic severity of gut damage from MTX treatment on day 5 assessed

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semiquantitatively. For radiation proctitis model, rats received radiation with single dose of 17.5Gy to pelvic cavity They were fed daily with S 15mg/kg/day or saline for 7 days prior to radiation and continued for 10 days after irradiation. Rats were sacrificed on 10th day and 6th week after irradiation for histologic grading of acute and chronic changes, respectively. For in vitro study, RAW 264.7 cells were untreated or treated with S for 30min before exposure to 100ng/ml lipopolysaccharide(LPS). At the indicated time points following LPS stimulation, cells were harvested. To examine effect of S on transcription of the various pro-inflammatory genes, we measured levels of IL-1, IL-6, Cox-2, iNOS, and TNF-α by RT-PCR assay. And to evaluate the possible mechanisms responsible for the anti-inflammatory effects of S in LPS stimulated RAW cells, the levels of phosphorylation of Erk and p38 were measured and nuclear extracts were analyzed for measurement of NFκB p65 present in nuclei.

In vitro study, S reduced expression of IL-1, and iNOS genes in LPS stimulated RAW 264.7 cells. Also treatment with S inhibited phosphorylation of Erk and p38 and increased expression of Mitogen Activated Protein Kinase Phosphatase-1 (MKP-1), possibly leading to inhibiting the inflammation. Furthermore, S decreased slightly the NFκB retention within nucleus of the LPS stimulated RAW cells. There was no significant effect to reduce the inflammatory severity in both jejunum-ileum of rats treated with MTX and irradiated rectal mucosa.

This study shows that S has an anti-inflammatory effect by attenuating activity of Erk and p38 via activation of MKP-1 and inhibiting translocation of NFκB into nucleus. However, the amounts of S used in this study, could not reduce the mucosal damage by MTX or radiation in animal model.

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Key Key Key

Key words words words words : : : : Scutellaria baicalensis, Anti-inflammatory effect, Radiation induced proctitis, Chemotherapy induced enteritis, Mucosal damage, RAW 264.7 cell