서
론
천연약용식물을 이용한 약초요법은 대체 민간요법으로 수백 년 전부터 사용되어 왔으며(Park et al. 1997; Bielory 2004), 최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 이러한 천연 약용식물을 이용하여 여러 가지 질병에 대한 치료제를
개발하려는 연구가 활발히 이루어지고 있을 뿐 아니라 질병의 예방과 최적의 건강을 유지하려는 노력도 증대되 고 있다 (Sa et al. 2003; Hwang et al. 2004; Lee et al. 2004). 특히 환경의 변화에 따른 알레르기 질환은 매년 환자의 수가 급증하고 있으나 아직까지 근본적인 치료법은 없는 실정이다. 현재 사용되고 있는 알레르기 질환 치료제는 거의 대부분 화학적 합성제품이며, 염증제거를 위해 스 테로이드 제제를 사용하고 있으나 장기간의 사용으로 인 한 부작용 등을 고려하지 않을 수 없다 (Simons 1992; ─ ─ 305 ──
천연약용식물 추출물의 사이토카인 발현에 미치는 영향
권희정∙임윤묵∙김해경1∙김용수∙노영창* 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소, 1전북대학교 의학전문대학원 면역학교실Study on Cytokine Modulation in Mast Cell-Induced Allergic
Reactions by using Gamma-Irradiated Natural Herbal Extracts
Hui-Jeong Gwon, Youn-Mook Lim, Hae-Kyoung Kim1, Yong-Soo Kim
and Young-Chang Nho*
Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 580-185, Korea
1Department of Immunology, Chonbuk National University Medical School, Jeonju, Korea
Abstract -- We previously described that some natural herbal extracts such as Houttuynia cordata (H), Centella asiatica (C), Plantago asiatica (P), Morus alba L. (M), and Ulmus davidiana (U), differ-entially suppress an atopic dermatitis like skin lesions. The objective of this study was to evaluate the pro-inflammatory cytokine modulation of the water extract of the H, C, P, M, U, and those mixtures (M) and their mechanism in a phorbol myristate acetate (PMA) plus calcium inopore A23187 treated human mast cell line (HMC-1). The H, C, P, M, U, and M inhibited the inflamma-tory cytokines such as TNF-αα, IL-6 and IL-8 stimulated by PMA plus A23187 from HMC-1 cells. In addition, the M did not significantly affect the cell viability and had no toxicity on the HMC-1 cells. Based on these results, M can be used for the treatment of an allergic inflammation response. Key words : Houttuynia cordata (H), Centella asiatica (C), Plantago asiatica (P), Morus alba L. (M),
Ulmus davidiana (U), Allergic response
* Corresponding authors: Young-Chang Nho, Tel. +82-63-570-3060, Fax. +82-63-570-3079, E-mail. [email protected]
Schafer-Korting et al. 1996). 또한 알레르기 질환의 증가 율이 성인에 비해 상대적으로 면역체계가 약한 영, 유아 에게서 더 빠른 속도로 증가되고 있어 독성이 적은 천연 물을 이용한 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있어 실 제로 각종 천연물에 의한 알레르기 반응 억제 효과에 대 한 보고가 이어지고 있다(Kim et al. 2005, 2007; Park et al.
2007).
어성초 (Houttuynia cordata) (H)는 삼백초과의 다년생 초본으로 약모밀 (Houttuynia cordata Thunb.)로 불리우며 항균작용이 있고, 항염, 진통, 조직재생 등의 효과가 있다. 또한, 어성초는 잎에서 특유의 비린내가 나기 때문에 붙 여진 이름으로 다양한 생리활성물질들은 함유하고 있어 해독 및 이뇨에 효과가 있으며, 특히 아토피, 항 알레르기 등 피부질환의 개선 목적으로 많이 사용되어 왔고, 최근 에는 건강 보조식품으로써 그 사용이 증가하고 있다(Seo et al. 2003; Song et al. 2003; Shin et al. 2006).
금전초(Centella asiatica) (C)는 ‘병풀’ 이라는 이름으로 미나리과에 속하는 다년생 식물로 인도, 스리랑카, 벵갈, 히말라야산까지 널리 분포하면서 중국이나 인도 등에서 상처 치유 등의 약용으로 많이 사용하였다. 주요성분은
asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid으로 항산화 효과 가 우수하고 피부트러블과 노화예방에 효과적이며 피부 의 손상을 복구해주는 피부의 재생에 효능이 있는 것으 로 보고되고 있다 (Chatterjee et al. 1992). 차전초 (Plantago asiatica) (P)는 질경이라고도 하며, 쌍 떡잎식물, 질경이목, 질경이과에 속하는 다년생 초본으로 서, 이뇨 작용, 진해 작용, 해독 작용이 있는 것으로 알려 져, 변비, 천식, 백일해, 관절통, 위장병, 부인병, 산후 복통, 신경쇠약, 두통, 뇌질환, 축농증 같은 다양한 질병의 치료 에 효능이 있는 것으로 알려져 왔으며, 특히 피부 진균을 억제하는 효능이 있어서 피부 궤양이나 상처에 찧어 붙 이면 고름이 멎고, 새살이 빨리 돋아 나오는 것으로 알려 져 있다 (Chiang et al. 2003). 상엽 (Morus alba L.) (M)은 뽕나무과에 속하는 낙엽교 목 또는 관목을 총칭하는 뽕나무의 잎을 말하며, 당뇨병 예방과 치료에 효과가 있으며 동물실험 결과 콜레스테롤 을 낮추고 동맥경화증, 고지혈증 예방치료에 효과가 있다 고 보고되어 있다. 또한, 항암작용을 하는 플라보노이드 성분들도 상당량 들어 있어 간 기능 향상, 중성지방 분해, 중금속 배출, 정혈작용 등에 효과가 있다고 알려져 있다
(Lee et al. 1995; Ahn et al. 2001).
느릅나무(Ulmus davidiana) (U)는 쌍떡잎식물 쐐기풀목 느릅나무과 (Ulmaceae)의 낙엽활엽 교목으로, 한방에서는 껍질을 유피라는 약재로 사용되며, 치습, 이뇨 소종독의 처방에 사용되고 있다. 느릅나무 껍질에는 플라보노이드,
사포닌, 타닌질 등 많은 양의 점액질의 성분이 있으며, 느 릅나무 뿌리껍질은 항염증작용을 하는 것으로 보고되고 있다(Hiroshi et al. 1972; Seiichi et al. 1989). 느릅나무 뿌리 껍질의 진액을 먹거나 피부에 바르면, 스며드는 속도가 빠르며 각종 피부질환을 치료하고 피부를 아름답고 매 끄럽게 하는 데 효과가 있다고 한다. 그러나 이러한 천연물에 관한 연구들은 대부분 한 가 지 물질에 대한 것이며, 여러 시료를 혼합한 혼합추출물 의 생리적 활성이나 기능을 비교한 연구는 미흡한 실정 이다. 염증반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 하는 사이토카인은 다양하고, 강력한 생물학적 활성을 가지고 있는 작은 크기의 단백질 혹은 당단백질로서, 면역 세포 가 분비하는 단백질의 총칭으로, 특이적인 수용체를 가 지고 있는 세포와 반응하여 작용을 나타낸다. 현재까지 적어도 60종류의 다양한 사이토카인들이 존재하는 것으 로 알려져 있으며, 이들은 Table 1과 같이 분류될 수 있 다. 사이토카인들은 면역반응, 조혈작용, 골발달, 상처치 유, 염증반응 중에서 매우 다양한 작용을 하는 매우 필수 적인 물질들이므로, GM-CSF, G-CSF 등처럼 이들이 직접 치료에 사용되기도 하지만, 경우에 따라서는 사이토카인 들의 비정상적인 분비나 불균형을 이룬 생성이 질병을 초래할 수도 있다. 특히 면역학적 질환이나 악성종양, 염 증성질환 등에서는 사이토카인의 비정상적인 생성이 질 병의 원인이 될 수도 있고, 바이러스나 세균에 의한 감 염증에서는 감염 후 이차적인 사이토카인의 생성이 질 병을 악화시킬 수도 있다. 요컨대, 이러한 사이토카인들 중 활성화된 비만세포에서 분비되는 사이토카인은
TNF-α를 비롯하여 IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13 등이 있 으며, 실제로 만성적인 알레르기성 염증반응을 보이는 천식이나 아토피 환자들에게서 TNF-α, IL-4, IL-6, IL-8 의 농도가 두드러지게 높다고 알려져 있다 (Moller et al. 1998; Kim et al. 2005, 2007; Park et al. 2007; Galli et al. 2008).
따라서, 본 연구에서는 상기의 천연약용식물 추출물(H, Table 1. Cytokine families and examples of their members
Cytokine family Members
Interferons IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc. Interleukins IL-1α, IL-1β, IL-1~IL-15, etc. Chemokines GRO-α, GRO-β, GRO-γ, MIP-α,
MIP-β, MCP-1, MCP-2, MCP-3, etc. Colony stimulating
G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EFO, etc. factors
Growth factors TGF-α, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β5, EGF, FGF basic, etc.
C, P, M, and U)과 각 추출물의 혼합물(M)을 사용하여, 각 각의 강력한 항염 효과와 면역 효과가 증강될 수 있을 것으로 예상하고 human mast cell line (HMC-1)을 이용하 여 비만세포 매개성 알레르기 모델에서의 사이토카인 (TNF-α, IL-6 및 IL-8) 억제 효과를 비교 평가해 보았다.
재료 및 방법
1. 시료의 조제 실험에 사용한 어성초 (H), 금전초 (C), 차전초 (P), 상엽 (M), 느릅나무 (U)의 건초를 0.02 g ml-1의 농도로 3차 증 류수를 용매로 사용하여, 75�C 항온수조에서 24시간 동 안 중탕 가열한 후 추출하였다. 추출 후 여과한 여액은 60Co 감마선 (5 kGy H-1, 25 kGy)으로 조사 멸균하였고, 혼 합물 (M)은 각각의 추출물을 동량으로 혼합하여 제조하 였다. 필요한 경우에는 냉동 건조시킨 분말을 사용하였다. 2. 세포배양 사람의 비만세포주세포주인 HMC-1은 100 mm 세포배 양접시에 배양하였으며, 3~4일 간격으로 계대 배양 하였 다. 배양액으로는 2 mM L-glutamine, 200 IU penicillin ml-1,200 mg streptomycin ml-1그리고 10% fetal bovine serum
(FBS)가 함유된 Iscove’s Modified Dulbecco’s Media (IMDM, Gibco Co., USA)를 이용하였으며, 37�C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
3. 세포 독성 측정
혼합추출물과 방사선 조사에 의한 HMC-1에 대한 세 포 독성을 측정해 보기 위해 CCK-8 assay (Dojindo Lab., Japan)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다 (Isabelle et al. 2003). 동량의 비율로 혼합된 추출물은 냉동 건조시킨 후 비율별로 IMDM에 최종농도 10μg ml-1로 용해시켜 준비하였다. HMC-1을 5×103cells ml-1의 농도로 96 well plates에 접종하고 각 혼합추출물을 24시간 동안 처 리한 후 CCK-8 용액을 각 well에 첨가시켜 37�C에서 4 시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 plate는 450 nm 파장 에서 ELISA reader (BioTek, Vermont, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
4. 사이토카인 측정
HMC-1을 24well plate에 5×105cells ml-1으로 접종 후 각각의 추출물과 혼합물을 1시간 동안 전처리하였다. 전
처리가 끝난 후 phorbol myristate acetate (PMA) (sigma) 0.05 mM과 calcium inopore (A23187) (sigma) 1mM로 7시 간 동안 자극하고 원심분리 후 얻은 세포 부유액을 ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용 하여 각각의 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-8)을 측정하였 고, 최종 OD값을 측정하기 위해 micro-plate scanning spec-trophotometer (BioTek, Vermont, USA)를 사용하였다.
5. 통계처리 본 실험에서 측정된 결과는 mean±S.D.로 나타내었고, 군 간의 차이는 Student’s t-test를 이용하였으며, p⁄0.05 인 경우를 유의한 차이로 인정하였다.
결과 및 논의
1. HMC-1에서 추출혼합물에 의한 세포 독성 추출혼합물과 방사선 조사에 의해 HMC-1에 미치는 세포 독성을 알아보기 위하여 세포 생존율을 실시한 결 과, 추출혼합물의 농도가 10μg ml-1일 때 대조군에 비 해 세포 생존율은 각각 93~98%로 모든 비율에서 세포 독성은 나타나지 않았다 (Fig. 1). 또한, 고농도인 100μg ml-1로 24시간 동안 처리하였을 때에도 세포 생존율에 영향을 주지 않았다. 방사선 조사에 의한 각각의 천연추 출물의 HMC-1 세포에 대한 세포 독성을 측정해 본 결 과, 유의할 만한 세포 독성은 나타나지 않았다 (Fig. 2). Fig. 1. Cytotoxicity of natural herb extracts (H, C, P, M, and U) inHMC-1 cells. There was no cytotoxicity effect on HMC-1 cells. The survival rate was measured by performing CCK-8 assay. Three replicate measurements are included in a sin-gle experiment. The data are expressed as means±S.D. of two independent experiments.
Cell survival (%) 120 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 10 0 Natural extracts (%) H P C M U
2. HMC-1에서 추출물에 의한 TNF-αα 억제 효과
HMC-1은 비만세포주로서 TNF-α, IL-6, IL-8 등 세포내
염증성 인자를 다량으로 함유하고 있어 비만세포 의존적 알레르기 반응 메커니즘 해명 및 치료법의 연구에 다양 하게 이용되고 있다. PMA와 A23187 (PMACI)로 자극한
HMC-1에서 TNF-α 분비는 정상세포군에 비해 현저히 증 가되었음을 보였다. 그러나 추출물로 전처리 후 PMACI 로 자극한 실험군에서는 PMACI에 의한 HMC-1에서의 TNF-α 분비가 현저하게 감소됨을 알 수 있었다. 특히 추출물 각각을 처리한 그룹보다 혼합추출물 (M)을 처리 한 그룹이 약 60% 이상 더 강하게 억제하는 양상을 나타 내었다 (Fig. 3). 3. HMC-1에서 추출물에 의한 IL-6 억제 효과 PMACI로 자극한 사람의 비만세포주에서 대조군의 IL-6 분비는 정상세포군에 비해 현저히 증가되었음을 보였 으나, 추출물로 전처리 후 PMACI로 자극한 실험군에서 는 현저하게 감소되었다. 또한 IL-6의 발현은 각각의 추 출물을 단독으로 처리한 그룹보다 추출혼합물 (M)을 처 리한 그룹에서 더 억제되는 것으로 관찰되었으며, 약 80 % 이상 IL-6 분비가 감소됨을 보였다 (Fig. 4). 4. HMC-1에서 추출물에 의한 IL-8 억제 효과 PMACI로 자극한 사람의 비만세포주에서 대조군은 정 상세포군에 비해 IL-8의 발현이 현저히 증가되었음을 보 였다. 그러나 추출물로 전처리 후 PMACI로 자극한 실험 군에서는 발현이 억제되었음을 알 수 있었다. 또한 각각 의 추출물을 단독 처리한 그룹보다 혼합물 (M)을 처리한 그룹에서 더 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이는 앞서 보인 TNF-α와 IL-6의 발현양상과 비슷했으며, 혼합물 처리의 경우가 약 35%가량 더 감소됨을 보였다 (Fig. 4).
결
론
염증반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 하는 사이토카인들 중 활성화된 비만세포에서 분비되는 사이Fig. 3. Inhibitory effect of natural herb extracts (H, C, P, M, and U) and their mixture (M) on PMA plus A23187-induced IL-6 production. The HMC-1 cells were treated for 1 h and then stimulated with PMA plus A23187 for 7 h. The IL-6 levels in the supernatant were measured with the ELISA method. Each data represents the mean±S.D. of three independent
experiments.
Fig. 4. Inhibitory effect of natural herb extracts (H, C, P, M, and U) and their mixture (M) on PMA plus A23187-induced IL-8 production. The HMC-1 cells were treated for 1 h and then stimulated with PMA plus A23187 for 7 h. The IL-8 levels in the supernatant were measured with the ELISA method. Each data represents the mean±S.D. of three independent
experiments. IL-6 (pg ml -1) 350 300 250 200 150 100 50 0 P.C H C P M U M Control (Positive) Extracts (H, C, P, M and U) Extracts mixtures IL-8 (pg ml -1) 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 P.C H C P M U M Control (Positive) Extracts (H, C, P, M and U) Extracts mixtures
Fig. 2. Inhibitory effect of natural herb extracts (H, C, P, M, and U) and their mixture (M) on PMA plus A23187-induced TNF-α production. The HMC-1 cells were treated for 1 h and then stimulated with PMA plus A23187 for 7 h. The TNF-α levels in the supernatant were measured with the ELISA method. Each data represents the mean±S.D. of
three independent experiments.
TNF-α (pg ml -1) 1000 800 600 400 200 0 P.C H C P M U M Control (Positive) Extracts (H, C, P, M and U) Extracts mixtures
토카인은 TNF-α를 비롯하여 IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13 등이 있으며, 실제로 만성적인 알레르기성 염증반응을 보 이는 천식이나 아토피 환자들에게서 TNF-α, IL-4, IL-6,
IL-8의 농도가 두드러지게 높다고 알려져 있다. 본 연구 의 in vitro 실험은 human mast cell line인 HMC-1으로 실 행되었는데, pro-inflammatory 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-8의 발현을 관찰하였다. 각 열수 추출물들과 추출혼 합액은 PMACI에 의해 증가된 HMC-1 세포 내 염증성 사이토카인 발현 등의 증상을 전반적이고 효과적으로 개선하여 비만세포 매개 염증반응을 효과적으로 억제하 였다. 특히 단독으로 적용하였을 때보다 추출혼합물을 적용하였을 때 더 효과적으로 염증관련 사이토카인의 발현이 억제되었다. 본 연구 결과를 토대로 보다 더 강 력한 항염 효과를 나타내는 각 천연물 간의 적정 혼합 비율과 각 천연추출물에 함유되어 있는 특정 유효성분 의 화학분석이 추가적으로 연구될 필요가 있다. 본 연구 결과는 향후 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염과 같은 만성적인 비만세포 매개 알레르기성 염증질환의 완화를 위한 새로운 약품개발에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
사
사
본 연구는 교육과학기술부 지원 원자력연구개발사업 에 의하여 수행되었으며 이에 감사드립니다.참 고 문 헌
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Manuscript Received: December 10, 2009 Revision Accepted: December 21, 2009
