A novel compound heterozygous NEB mutationin Korean patients with intellectual disability, epilepsy,and acongenital myopathy

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의학 석사학위 논문

지적장애와 뇌전증,선천성 근병증과

관련된 새로운 복합 이형접합성 NEB

돌연변이

아 주 대 학 교

대 학 원

의학과/

의학전공

이 종 빈

지적장애와 뇌전증,선천성 근병증과

관련된 새로운 복합 이형접합성 NEB

돌연변이

지도교수

임 신 영

이 논문을 의학 석사학위 논문으로 제출함.

2014년

8월

아 주 대 학 교

대 학 원

의학과/

의학전공

이 종 빈

이종빈의 의학 석사학위 논문을 인준함.

심사위원장

임

신

영

인

심 사 위 원

정

윤

석

인

심 사 위 원

정

선

용

인

아 주 대 학 교

대 학 원

2014년 6월 20일

국문요약

-지적장애와 뇌전증,선천성 근병증과 관련된

새로운 복합 이형접합성 NEB 돌연변이

목적:NEB 유전자는 2q23.3에 위치하며,249kb 크기로,183개의 엑손으로 구 성되어 세포 골격 기질인 네불린 단백질을 코딩하고 있다.네불린 유전자의 돌연 변이는 상염색체 열성 네말린 근병증 2형의 가장 흔한 원인이며,현재까지 약 81 개의 돌연변이가 보고되고 있다.네불린은 골격근 외에 뇌를 포함한 다양한 조직에서 발현되고 있으나 지적장애,뇌전증 등의 중추신경계 기능 이상을 보이 는 NEB 돌연변이는 아직까지 보고된 바가 없다.소아기 발병의 지적장애,뇌전 증 및 사지 마비를 보이는 새로운 NEB 돌연변이를 발견하여,이를 보고하고자 한다. 대상 및 방법:소아기에 발병한 지적장애,뇌전증 및 사지 마비를 보이는 15세 여아와 동일한 증상을 보이는 1명의 남자 형제,정상인 1명의 여자 형제와 2 명의 부모로 이루어진 한 가계 5명을 대상으로 하였다.염색체 이상,유전자 복 제 수 변이,후보 유전자와 미토콘드리아 유전자의 돌연변이를 확인하기 위해 전 통적인 유전학적 검사를 시행하였으나,이상 소견을 발견하지 못하여 차세대 염 기 서열 분석법인 엑솜 염기서열 분석을 시행하였다.엑솜 염기서열 분석을 통해 환자와 정상인 여자 형제,부모의 엑솜 염기서열을 서로 비교하여 원인이 되는 유전변이를 확인하였다.확인된 유전변이에 대해서는 생어 염기서열 분석을 통해 재확인하였고, Polymorphism Phenotyping v2 와 Sorting Intolerant from Tolerant방법을 통해 in-silico예측을 시행하였다.

결과:상염색체 열성 유전형에 일치하는 한 쌍의 원인 유전변이를 발견하였다.2 명의 환자는 네불린을 코딩하는 복합 이형접합성 NEB 돌연변이를 가지고 있었

으며,엑손 27의 c.2603T>C (p.L868P)과 엑손 143의 c.21340C>T (p.R7114W) 의 새로운 과오 돌연변이(missensemutation)였다.

결론:본 연구를 통해 그동안 보고되지 않은 지적 장애와 뇌전증,선천성 근병증 과 관련된 새로운 복합 이형접합 NEB 돌연변이를 발견하였으며,이후 유전형과 표현형의 상관관계에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

핵심어:congenital myopathy, epilepsy, intellectual disability, quadriplegia, whole exome sequencing, mutation, NEB gene, nebulin

차 례

국문요약 ···ⅰ 차례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅳ 표 차례 ···ⅴ Ⅰ.서론 ···1 Ⅱ.연구대상 및 방법 ···3 A.연구대상 ···3 B.연구방법 ···5 1.차세대 염기 서열 분석법을 이용한 엑솜 염기 서열 분석 ···5 2.생어 염기 서열 분석 ···11 Ⅲ.결과 ···12 A.임상양상 ···12 B.돌연변이 분석 ···15 Ⅳ.고찰 ···21 Ⅴ.결론 ···24 참고문헌 ···25 ABSTRACT ···28

그림 차례

Fig.1.Pedigreeofthestudiedfamily.···4 Fig.2.Radiographicfindingsoftheproband(II-3).···14 Fig.3.SangersequencingresultsofNEB mutations.···18 Fig.4.Comparison ofnebulin protein (NEB)sequencesamong thespecies

atthepositionofthehuman868leucineresidues.···19 Fig.5.Comparison ofnebulin protein (NEB)sequencesamong thespecies

표 차례

Table1.Summary ofthestatisticsforwholeexomesequencing (WES)in thestudiedfamily.···7 Table 2.Identification ofsingle nucleotidepolymorphism (SNP)by whole

exomesequencinginthestudiedfamily.···9 Table 3. Identification of insertion/deletion (InDel) by whole exome

sequencinginthestudiedfamily.···10 Table4.Clinicalfeaturesofthetwopatients.···12 Table 5.Candidate compound heterozygous mutations identified by whole

exomesequencinginthestudiedfamily.···16 Table6.CharacteristicsoftheidentifiedNEB mutationsinthisstudy.17

I

.서 론

네불린(NEB)단백질은 세포골격의 기질을 구성하며,다양한 동형 단백질을 가지는 500-900 kDa 의 거대한 섬유상 단백질이다.네불린은 골격근에서 근절 (sarcomere)의 액틴 근세섬유에 결합하여 액틴 섬유를 안정화시키고 최소 길이 를 결정하는 데,중요한 역할을 한다.네불린 유전자는 2q23.3에 위치하며,249 kb크기로,183개의 엑손으로 구성되어 있다.네불린 유전자의 돌연변이는 상염 색체 열성 네말린 근병증 2 형(NEM2,OMIN #256030)의 가장 흔한 원인이며, 현재까지 약 81 개의 돌연변이가 보고되고 있다. 네말린 근병증은 신생아 500,000명당 1명의 유병률을 보이는 선천성 근병증으로 일반적으로 네말린 근병 증을 가진 환자는 평균 이상의 IQ 를 보이는 것으로 알려져 있다(1,2).네불린은 골격근 이외에 뇌를 포함한 다양한 조직에서 발현되고 있으나,뇌전증이나 지적 장애와 같은 중추신경계 기능 이상을 보이는 네불린 돌연변이는 아직까지 보고 된 바 없다.지적장애와 뇌전증 같은 신경 발달성 질환에서는 복제 수 변이(copy numbervariants)는 흔하게 보고되어 왔고(3),많은 유전자들이 다양한 선천성 근육병의 원인으로 보고되고 있다(4).

소아기에 발병한 지적장애와 뇌전증,사지 마비를 보이는 환자의 가계를 대상 으로 하는 본 연구에서,이환된 자녀(affectedsibling)에서 원인이 되는 유전학적 이상을 밝혀내기 위해, 처음에는 염색체 이상을 확인하기 위한 G-band karyotyping, 복제 수 변이를 확인하기 위한 array comparative genomic hybridization분석법,취약 X-증후군의 FMR1유전자의 CGG expansion을 확인 하기 위한 southernblot분석법,미토콘드리아 DNA 의 돌연변이를 확인하기 위 한 염기 서열 분석법을 포함한 여러 전통적인 유전학적 검사를 시행하였다.하지 만 이러한 전통적인 돌연변이 분석에서 어떠한 이상도 발견할 수 없었다.

2

(whole exome sequencing)은 유전 질환의 원인이 되는 유전자를 찾는데 많은 도움을 주고 있다(5).뇌전증성 뇌병증을 가진 264 명의 환자와 부모에 대한 EPi4K 와 EPGP 컨소시엄의 연구는 이와 관련된 많은 새로운 유전자 돌연변이 를 밝혀냈다(6).심한 지적장애를 지닌 환자에 대한 진단적 엑솜 염기 서열 분석 에서도 많은 denovo돌연변이를 밝혀낼 수 있었다(7).본 연구는 소아기에 발병 한 지적 장애,뇌전증 및 사지 마비를 보이는 15세 여아와 유사한 증상을 보이 는 1명의 남자 형제,정상인 1명의 여자 형제와 2명의 부모로 이루어진 가계 를 대상으로 전체 엑손 염기 서열 분석을 통해 기존에 보고된 적이 없는 새로운 NEB 돌연변이를 원인 유전자로 추정하였다.이는 상염색체 열성 근육병의 원인 으로 주로 알려진 NEB 돌연변이가 지적장애나 뇌전증과 같은 신경 발달학적 표 현형에 관여할 수 있다는 최초의 보고이다.

I

I

.연구대상 및 방법

A.연구대상 소아기에 발생한 지적장애와 뇌전증,전신적인 근력의 약화의 복합적인 표현형 을 가진 2명의 환자와 정상인 가족으로 구성된 한 가계를 연구하였다(Fig 1).2 명의 환자(II-2 와 II-3)는 아주대학교병원 재활의학과를 방문하여 진단을 받았 다.정상인 부모(I-1과 I-2)와 여자 형제(II-1)는 돌연변이 분석을 위한 대조군으 로 본 연구에 참여하였다.사전 동의 후,5 명의 가족 구성원 모두에게서 말초 혈액을 채취하였고,표준화된 공정에 따라 유전체 DNA 를 분리하였다.본 연구 는 아주대학교 의료원의 임상연구 심의위원회의 승인을 얻었다.

4

Figure1.Pedigreeofthestudied family.Thepedigreeoftheparents(I-1 and I-2),the two affected siblings (II-2 and II-3),and the one unaffected sibling (II-1)whounderwentthequintet-basedwholeexomesequencing.The letter"P"indicatesaprobandofthisfamily.

B.연구방법

1.차세대 염기 서열 분석법을 이용한 전체 엑솜 염기 서열 분석

Illumina 사의 TruSeq DNA sample preparation 가이드(Illumina,Inc,San Diego,CA,USA)에 따라 증폭 전 DNA 라이브러리가 준비되었다.엑솜 영역의 분리와 증폭을 위해서는 Illumina 사의 TruSeq Exome Enrichmentprobes 와 streptavidin beads를 사용하였다.Ilumina사의 cBot이 증폭된 엑솜 라이브러 리의 클러스터를 만들기 위해 이용되었다.증폭된 엑솜 라이브러리 클러스터를 가진 flow cell은 HiSeq2000으로 옮겨져 각각의 캡처된 라이브러리에 대해 평 균 40배의 sequencingdepth로 초고속 염기 서열 분석법이 시행되었다. (A)증폭 전 DNA 라이브러리의 제작

증폭 전 DNA 라이브러리는 Illumina사의 TruSeqDNA samplepreparation kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)을 사용하여 제작되었다.유전체 DNA 가 분리되었으며,적절한 유전체 DNA 는 CovarisS2(Covaris,Woburn,MA, USA)를 사용하여 무작위로 조각내어졌다.대부분의 DNA 라이브러리는 200에 서 300bp였다.어뎁터(adaptor)를 조각의 양쪽 끝에 결찰하였고,어뎁터와 결찰 된 DNA 주형(template)은 AMPureXP beads(BeckmanCoulter,Inc.,Bera,CA, USA)를 사용하여 300에서 400bp의 크기를 가진 조각들로 분리하여 정제하였 다.

(B)엑솜의 증폭

전체 500 ng 의 각각의 라이브러리가 분리되었다.DNA 는 Illumina 사의 TruSeq Exome Enrichmentprobes (Illumina,Inc.)를 사용하여 혼성화 되었다. 혼성화 후 streptavidin beads를 사용하여 캡쳐하였다.캡쳐된 DNA 복합체는 3 단계에 걸쳐 세척한 후,탐색자(probe)에서 DNA 를 분리하였다.분리된 DNA 에

6

대해서는 앞의 과정을 반복하여,성공적으로 분리된 DNA 조각에 결찰되어 있는 연결자에 특이적인 시발체(primer)를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응을 통해 증폭 시켰다. 그리고 나서 AMPure XP beads 를 사용하여 분리한 후, Agilent Bioanalyzer2100을 사용하여 분석하였다.

(C)증폭된 엑솜 라이브러리의 클러스터 생성

증폭된 엑솜 라이브러리를 TruSeq PE Cluster Kitv3-cBot-HS (Illumina, Inc)를 사용하여 클러스터 생성을 위해 IlluminacBot의 flow cell에 실었다. 각 flow cell의 한 lane은 PhiX control을 위해 보전하였다.

(D)엑솜 염기서열 분석 증폭된 엑솜 라이브러리의 클러스터를 가진 flow cell 은 Illumina 사의 HiSeq2000으로 이동되었다. 각각의 캡쳐된 라이브러리에 대한 고속의 염기 서 열 분석이 평균 40배 이상의 sequencingdepth로 시행되었다. (E)염기서열의 정렬 엑솜 염기서열 분석으로부터 얻어진 새로운 염기서열 정보는 UCSC 의 표준 염기 서열인 HG19와 정렬하여 비교 분석하였다(Table1). (F)단일 염기 변이와 염기의 삽입결실 변이 단일 염기 변이와 염기의 삽입결실 변이가 GATK 를 사용하여 다음의 파라미 터로 동정되었다.(1)HARD_TO_VALIDATE:MQ0≥ 4and {[MQ0/(1.0× DP)]> 0.1},(2)Qualfilter= QUAL < 10,and (3)depth filter= DP < 5or DP < 200.

Statistics Subject

I-1 I-2 II-1 II-2 II-3

Totalnumberofreads 65,798,710 63,860,334 78,479,782 71,067,298 59,314,160 Totalnumberof

high-qualityfilteredreads 59,901,340 58,003,184 71,528,848 64,797,076 54,231,394 Totalnumberofreadsafter

filtering duplicatereads 54,389,323 52,995,346 64,078,272 57,960,687 47,845,816 Totalnumberofmappedreads 53,906,963 52,621,684 63,719,454 57,615,847 47,554,220 Percentageofmappedreads(%) 99.11 99.29 99.44 99.41 99.39 Medianreaddepthoftargetregion(X) 41.54 40.99 53.38 47.35 39.94 Coverageoftargetregionat4X (%) 76.95 76.81 78.16 77.86 76.48 Coverageoftargetregionat10X (%) 71.36 71.22 73.42 72.83 70.74 Coverageoftargetregionat20X (%) 63.16 63.12 67.08 65.57 62.44

Table 1.Summary ofthestatistics forwhole exome sequencing in the studiedfamily.

8 (G)단일 염기 변이와 염기의 삽입결실 변이의 주석 (1) 유전자 부위에 따른 주석:단일 염기 변이와 삽입결실 변이는 유전자간, 5'-비해석 부위(5'-UTR),인트론,코딩 염기서열,스플라이싱 지점,3′-비해석 부위(3'-UTR)와 같은 유전자 부위에 의해 주석이 달렸다.본 연구에서는 인터론 에 인접한 스플라이싱 지점에서 떨어진 거리를 이용하여 주석을 달았다.코딩 염 기서열의 단열 염기 변이(SNP)와 삽입결실 변이(Indel),프로모터(promotor),스 플라이싱 지점,3′- 비해석 부위(3'-UTR),5′- 비해석 부위(5'-UTR)와 인트 론 지역에서 가까운(±20)스플라이싱 지점을 분석하였다(Tables2and3). (2)기능적인 효과에 따른 주석:본 연구에서는 코딩 염기 서열의 단일 염기 변 이를 지닌 코돈의 돌연변이의 효과를 과오(missense),넌센스(nonsense),번역 초 과(read-through)돌연변이로 주석을 달아 분석하였다.또한 코딩 염기 서열의 단일 염기 변이(Indel)는 틀 이동(frame-shift)돌연변이인지를 함께 분석하였다. 발생 가능한 손상을 예측하기 위해 아미노산 수준에서 기능적인 효과를 Sorting Tolerantfrom Intolerant(SIFT)와 PolyPhen 2 를 사용하여 in silico 예측을 시행하였다.

(3)유전 모델에 따른 주석:본 연구에서는 다섯 명의 가계를 대상으로 엑솜 염 기서열 분석을 시행하였다.우성과 열성 유전 모델이 두 이환된 자녀와 정상의 대상을 비교하여 가설로 세워졌다.각각의 유전 모델에 대하여 후보 돌연변이가 다음에 따른 적절한 우선순위를 매기는 과정을 통해 동정되었다.지적 장애를 보이는 것으로 알려진 후보 유전변이는 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)의 자료와 비교하여 배제하였다.남은 단일 염기 변이와 삽입결실 변이 중 흔한 변이는 KoreaPersonalGenomeProject와 비교 분석하여 배제하였다.

Statistics Subject I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 Number of SNPs in non-genicregion 18,323 19,149 19,169 18,333 18,078 NumberofSNPsin genic region 71,867 80,935 71,177 74,266 72,976 Intron 36,225 41,260 35,649 37,521 36,773 Promoter 1,187 1,552 1,194 1,272 1,226 3'UTR 17,221 18,427 17,259 17,710 17,521 5'UTR 2,592 3,124 2,499 2,637 2,626 Splicesite 77 88 65 82 75 Synonymous 7,405 8,503 7,342 7,678 7,530 Missense 7,068 7,878 7,074 7,261 7,131 Nonsense 68 77 72 80 72 Readthrough 24 26 23 25 22 Total 90,190 100,084 90,346 92,599 91,054 Table 2. Identification of single nucleotide polymorphism (SNP) by wholeexomesequencing in thestudiedfamily.

10 Statistics Subject I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 Number of indels in non-genicregion 1,368 1,467 1,370 1,411 1,398 Numberofindelsin genic region 8,180 8,943 8,153 8,536 8,423 Intron 4,555 5,104 4,547 4,835 4,750 Promoter 111 135 111 131 116 3'UTR 3,063 3,195 3,041 3,098 3,079 5'UTR 209 254 198 219 213 Splicesite 28 36 33 31 35 Frameshift 114 114 118 125 123 Inframe 100 105 105 97 107 Total 9,548 10,410 9,523 9,947 9,821 Table 3. Identification of insertion/deletion (Indel) by whole exome sequencing in thestudiedfamily.

2.생어 염기서열 분석 말초혈액 표본에서 추출된 DNA 는 엑손 27 의 c.2603T>C(5ʹ -CTACCCTTGGGCATCGTAAC-3ʹ 과 5ʹ-GGCATGTGTGATGTCTTTGC-3ʹ) 과 엑손 143 의 c.21340C>T(5ʹ-GCCCCATCACAGTACCTGAC-3ʹ 과 5ʹ -TGGCCCTCTGGAGTGTTTAC-3ʹ)을 확인하기 위해 시발체(primer)를 이용한 중합 효소 연쇄 반응으로 증폭시켰다.중합 효소 연쇄 반응의 결과는 ABI 3500xL DNA Analyzer(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)로 분석하 였다.

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.결과

A.임상양상 환자는 15세 여아(II-3inFig.1)로 소아기에 발병한 지적장애,뇌전증과 전신 적인 근력 약화를 보이는 복합적인 표현형을 주소로 아주대학교병원 재활의학과 를 방문하였다.출생 당시 정상 질식 분만으로 출생하였으며,출생 체중은 3,500 그램 이었다.생 후 12개월까지의 발달 과정에서 특이한 점은 없었다.생 후 13 개월 무렵,비열성의 뇌전증 발작을 보였으며,이는 다양한 항전간제 치료에도 잘 조절되지 않았다.잘 조절되지 않는 뇌전증과 함께,진행성의 신경 운동학적 퇴행을 보여서 만 13세가 되어서는 의자차에 의지하게 되었고,의미 있는 단어 를 말하지 못하였다.환자는 생김새의 이상을 보이지는 않았으며,머리 둘레(53.0 cm,5~25% percentile)는 정상이었다.전신적인 근육의 약화를 보였고,도수 근력 검사에서 상지는 양측이 3등급을,하지는 양측이 1등급을 보였다(Table4).

환자는 척추 측만증과 함께 양측 고관절,슬관절,족관절,견관절,주관절,완관 절과 지간 관절을 포함한 여러 관절에서 구축을 보였다(Fig.2).강직이나 이상긴 장증,경직의 징후는 보이지 않았으며,근육 효소의 수치는 정상 범위였다.신경 정신과적 평가에서는 현저한 지적장애를 보였으며,전체적인 지능지수(IQ)는 30 미만이었고,언어성 지수와 동작성 지수도 30미만이었으며,사회성 지수는 16.1 이었다(Table4).환아는 일상생활동작의 수행에 있어 완전 의존 상태였으며,수 정바델지수는 0점이었다.뇌 자기공명영상은 정상 소견을 보였다(Fig.2).뇌파 검사에서는 부정형의 전신 발작파와 비연속성의 배경 리듬을 보였다.환자의 오 빠(II-2inFig.1)는 임상적으로 유사한 표현형을 보이고 있었다(Table4).생 후 6개월까지는 정상적인 발달을 하였으나,이후 신경 발달학적 퇴행을 보여 만 10 세에 의자차에 의존하게 되었다.환자의 부모와 언니에서는 어떠한 근병증이나 신경 발달학적 이상 소견도 관찰되지 않았다.이환된 두 자녀에 대해 염색체 이 상을 확인하기 위한 G-band karyotyping,복제 수 변이를 확인하기 위한 array comparative genomic hybridization 분석법,취약 X-증후군의 FMR1 유전자의 CGG expansion을 확인하기 위한 southern blot분석법,미토콘드리아 DNA 의 돌연변이를 확인하기 위한 염기 서열 분석법을 포함한 여러 전통적인 유전학적 검사를 시행하였지만,이 검사들에서는 어떠한 유전학적 이상도 발견할 수 없었 다.

14

Figure 2.Radiographic findings of the proband (II-3).The magnetic resonanceimagingstudyofthebrainshowsnormalfindingsinthetoppanel, wheresagittalT1-,axialT1- and T2-weighted imagesaregiven.Theplain X-ray study ofthespineand kneesrevealsscoliosisand flexion contracture ofbilateralkneesinthebottom panel.

B.돌연변이 분석 가계 구성원들에 대하여 엑솜 염기 서열 분석을 시행하였다.데이터 필터링 후 에 2명의 이환된 자녀와 1명의 정상 자녀,2명의 정상 부모의 엑솜 염기서열 을 비교 분석하였다.질병을 유발하지 않는 일반적인 변이는 배제하였고,상염색 체 우성 혹은 열성의 유전자 모델이나 유전체 각인 돌연변이에 따라 이환된 자 녀의 질병의 원인을 설명할 수 있는 엑손의 변이와 스플라이싱 변이를 추출하였 다.결과적으로 5개의 유전자(PRAMEF2,NEB,IBSP,PRKAG2와 MLH3) 에서 모두 7 쌍의 복합 이형접합성 변이가 상염색체 열성 유전자 모델의 후보 유전변이로 확인되었다(Table5).다음으로 후보 변이의 대립 유전자 빈도(allele frequency)를 확인하였고 1% 미만의 대립 유전자 빈도를 지닌 변이가 선택되었 다.오직 하나의 복합 이형접합성 NEB 돌연변이가 이환된 자녀들에게서 유일하 게 발견되었다.이환된 자녀들은 각각 엑손 27,c.2603T>C(p.L868P) 과 엑손 143, c.21340C>T (p.R7114W) 에서 새로운 NEB 과오 돌연변이(missense mutations)를 보였다.하지만 정상인 부모와 자녀에서는,오직 하나의 NEB 돌 연변이(c.2603T>C 혹은 c.21340C>T)만을 보였다(Table6andFig.1).생어 염 기 서열 분석법을 통해 가계 구성원에서 두 돌연변이를 다시 확인하였다(Fig.3). 이 두 돌연변이는 이전에 보고된 적이 없으므로,Polymorphism Phenotyping v2 (PolyPhen 2)와 Sorting Intolerantfrom Tolerant(SIFT)예측 방법을 이용하 여 아미노산 레벨에서의 기능적인 효과에 대해 in-silico 예측을 시행하였다. PolyPhen 2 결과에서는 두 돌연변이 모두 잠정적으로 해롭다고 예측되었고, SIFT 결과에서는 p.R7114W 돌연변이가 불내성으로 예측되었다.나아가 돌연변 이 부위의 아미노산 잔여물은 다른 종에서는 잘 보호되어 있었다(Fig.4,5).이 러한 결과들은 두 NEB 돌연변이가 단백질의 기능에 해로운 영향을 가지고 있을 수 있음을 의미한다(Table6).

16 Chr Pos Ref Alt Gene_Name rs-Number Exon Transcript

ID Functional Class Codon Change AminoAcid Change 1000GP_Aisan AlleleFrequency Polyphen 2 HIDV_pred SIFT result Chr1 Chr1 12919022 12921332 C T T C PRAMEF2 PRAMEF2 -rs17039307 2 4 NM_023014.1 NM_023014.1 MISSENSE MISSENSE aCg/aTg Tgc/Cgc T53M C375R 0.045 -P B I T Chr2 Chr2 152390806 152543967 G A A G NEB NEB rs186686151 rs143123053 143 27 NM_001271208.1 NM_001271208.1 MISSENSE MISSENSE Cgg/Tgg cTg/cCg R7114W L868P 0.003 0.010 D D I T Chr2 Chr2 152390806 152500449 G C A G NEB NEB rs186686151 rs13013209 143 57 NM_001271208.1 NM_001271208.1 MISSENSE MISSENSE Cgg/Tgg aaG/aaC R7114W K2613N 0.003 0.269 D D I I Chr2 Chr2 152390806 152476028 G C A G NEB NEB rs186686151 rs10172023 143 73 NM_001271208.1 NM_001271208.1 MISSENSE MISSENSE Cgg/Tgg tgG/tgC R7114W W3603C 0.003 0.253 D D I I Chr4 Chr4 88732692 88732746 G A A G IBSP IBSP rs1054627 rs13144371 7 7 NM_004967.3 NM_004967.3 MISSENSE MISSENSE gGa/gAa gAc/gGc G195E D213G 0.104 0.585 P B I T Chr7 Chr7 152478406 152483612 C C T T PRKAG2 PRKAG2 rs79474211 -3 2 NM_016203.3 NM_016203.3 MISSENSE MISSENSE Ggc/Agc Gcc/Acc G100S A44T 0.040 0.008 D P I T Chr14 Chr14 75513534 75513828 G G A A MLH3 MLH3 rs17102999 rs175080 2 2 NM_001040108.1 NM_001040108.1 MISSENSE MISSENSE aCa/aTa cCt/cTt T942I P844L 0.050 0.176 B B T T

Table5.Candidatecompound heterozygousmutationsidentified by wholeexomesequencing in thestudied family.

Characteristics Mutation 1 Mutation 2 Genomicposition g.152543967 g.152390806 Exon 27 143 DNA change c.2603T>C c.21340C>T Proteinchange p.L868P p.R7114W Allelefrequencyinthe

Asianpopulation* 0.010 0.003 PolyPhen2score 0.979 0.999

PolyPhen2result Probablydamaging Probablydamaging SIFT score 0.25 0.02

SIFT result Tolerant Intolerant

Table6.CharacteristicsoftheidentifiedNEB mutationsin thisstudy.

Abbreviations: SIFT, Sorting Intolerant From Tolerant; PolyPhen 2, Polymorphism Phenotyping v2.GenBank number:NG_009382.2 for genomic DNA,NM_001271208.1forcDNA,andNP_001258137.1forprotein.*Datafrom the1000GenomesProject.

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Figure 3. Sanger sequencing results of NEB mutations. Sanger sequencing results of the compound heterozygous mutations in the NEB gene,in c.2603T>C and c.21340C>T,in theparents (I-1 and I-2),and in a proband patient(II-3).Allchromatograms and sequences are the results of reverse-primersequencing.Thecorresponding sequencesareshownontopof eachchromatogram.

Figure 4.Comparison ofnebulin protein (NEB)sequences among the speciesattheposition ofthehuman 868leucineresidues.

20

Figure 5.Comparison ofnebulin protein (NEB)sequences among the speciesattheposition ofthehuman 7114Arginineresidues.

I

V.고 찰

NEB 유전자는 세포 골격 기질을 이루는 거대한 섬유질 모양의 단백질인 네 불린 단백질(600–900kDa)을 코딩하고 있다(8).네불린 단백질은 골격근에서 많 이 나타나며,대부분의 척추 동물에서 전체 근섬유 단백질의 3-4%를 차지한다. 네불린은 액틴을 함유한 미세근섬유(microfilament)에 붙어 근절(sarcomere)의 구 조와 근수축에 중요한 역할을 하며,가는 필라멘트(thin filament)를 안정화 시키 고 그 최소 길이를 결정한다(8).네불린 단백질의 돌연변이는 원위부 근병증,중 심-간체 근병증 뿐 아니라,네말린 근병증 2형(NEM2,OMIM #256030)과 같은 상염색체 열성의 선천성 근병증의 원인으로 보고되고 있다(4,9,10).NEB 돌연 변이에 의한 전형적인 네말린 근병증은 근위부 근육의 약화가 두드러짐을 특징 으로 하며(11),본 연구의 환자들에서 보였던 것처럼 심한 전신적인 근육의 약화 와 여러 관절의 구축이 동반되고,상염색체 열성의 유전학적 특징을 보인다.현 재까지 지적 장애나 간질과 같은 중추신경계의 기능 이상을 동반한 NEB 돌연변 이가 보고된 적은 없었다.비록 본 연구에서 NEB 돌연변이의 유전형과 표현형 간의 관계에 관하여 명확한 설명은 어려웠지만,다음의 몇 가지 이유로 NEB 돌 연변이를 본 연구의 원인 유전자로 결론 내렸다.첫째 본 연구의 환자들은 심한 전신 근력의 약화가 소아기 초기에 발병하였다.둘째,네불린 단백질은 골격근 뿐만 아니라 뇌에서도 발현된다.셋째,발달의 단계에 따라 특별한 네불린 단백 질의 동형 단백질이 존재한다.마지막으로,네불린 단백질은 액틴의 조절하여 골 격근 뿐 아니라 뇌에서도 중요한 역할을 한다. 복합 이형접합성 NEB 돌연변이를 지닌 두 자녀는 상지와 하지 모두에서 매우 낮은 도수근력검사 등급을 보이는 사지마비를 보였는데(Table4),이는 NEB 돌 연변이가 환자의 근육 약화의 원인임을 보여준다.네불린 단백질은 골격근에서 많이 나타나지만,동형 단백질이 다른 장기에서도 관찰되며,특히 뇌에서 관찰된

22 다(12).Donner등의 면역 조직학적 연구는 네불린 단백질이 뇌의 추체로 뉴런의 세포질과 피질하 내피 세포에서 발현됨을 보여주었다(12).이런 이유로 네불린 단백질은 골격근에서처럼 뇌에서도 뉴런의 액틴 필라멘트를 안정화시키거나 길 이를 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있을 것이다. NEB 유전자의 183 개의 엑손 중에서 엑손 63–66,82–105,143–144,와 166–177이 선택적 스플라이싱 (alternativesplicing)이 일어나는 핵심적인 위치이다(13).본 연구에서 환자들은 엑손 27과 143에서 과오 돌연변이(missensemutation)를 가지고 있었다.이전 에 보고된 바에 따르면 태아의 근육은 오직 엑손 143 의 선택적 스플라이싱 (alternativesplicing)만을 보인다(13).사람의 NEB 엑손 143에 상응하는 백서 의 NEB 엑손 127에 대한 연구에서,NEB 엑손 127의 전사가 늙은 백서보다 어린 백서에서 현저함을 보였다(14).이런 이유로 엑손 143의 돌연변이를 포함 한 네불린 단백질이 발달 초기의 유전학적 이상의 원인일 수 있다고 제안되었다. 액틴은 근육 세포,뉴런 등의 유핵 세포에서 물리적인 힘의 공급자로 여러 핵 심적인 역할에 관여 한다.뉴런의 수상돌기나 소극체의 비정상적인 형태학적 변 화가 지적장애와 연관 있다고 보고되고 있다.뉴런의 수상돌기와 소극체의 세포 골격 구조를 형성하는 데 있어서의 변화가 시냅스의 발달과 성숙 기능에 영향을 미치는 것처럼 보인다(15).그러므로 액틴 결합 단백질의 이상은 액틴이 관여된 세포 골격과 뉴론의 수상돌기의 기능에도 영향을 줄 수 있을 것이다.네불린과 디스트로핀처럼 액틴에 결합하여 조절하는 다양한 단백질이 보고되고 있다(16). 디스트로핀은 근육 섬유와 뇌와 신장,폐,고환과 같은 근육 외 장기에서 발견된 다.디스트로핀은 필수적인 고정 분자(anchoring molecule)로 액틴성 세포 골격 과 뉴런의 기능에 중요한 역할을 한다(17).디스트로핀 단백질을 코딩하고 있는 DMD 유전자에 발생하는 돌연변이는 치명적인, X-염색체 열성 유전의 Duchenne 근이영양증(DMD,OMIM #310200)을 유발한다(17).돌연변이에 의해 액틴을 조절하는 디스트로핀의 손실로 인해 Duchenne근이영양증이 발생한 일 부 아동에게서,인지 기능의 저하와 뇌전증이 보고되고 있다(18,19).따라서 본

연구의 환자에서 지적장애와 뇌전증 발생은 액틴을 조절하는 NEB 돌연변이로 인한 네불린 단백질의 이중 대립 형질 이상으로 비정상적인 액틴 세포 골격에 의해 시냅스의 흥분성과 가소성이 변하였기 때문으로 생각된다.

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V.결

론

소아기에 발병한 지적 장애,뇌전증 및 사지 마비를 보이는 환자의 가계에 대 한 엑솜 염기서열 분석을 통해 기존에 보고된 적이 없는 새로운 NEB 돌연변이 를 원인 유전자로 밝혀냈다.이는 상염색체 열성 근육병의 원인으로 주로 알려진 NEB 돌연변이가 지적장애나 뇌전증과 같은 신경 발달학적 표현형에 관여할 수 있다는 최초의 보고이다.향후 NEB 돌연변이로 인한 지적장애와 간질의 발생 기전을 밝히기 위한 추가적인 연구가 필요하다.

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28

-Abstract

-A novelcompoundhet

er

ozygousNEB mut

at

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Kor

ean pat

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swi

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el

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hy

Jong-BinLee

DepartmentofMedicalSciciences TheGrauduateSchool,AjouUniversity (SupervisedbyProfessorShin-YoungYim)

I examined a Korean family with complex phenotypes characterized by intellectual disability, epilepsy,and generalized muscle weakness of early childhood onset.I performed several conventional genetic tests to detect chromosomalaberrations,gene copy number variations,and candidate gene and mitochondrialgenemutations.Afterfinding no abnormality,Iconducted wholeexomesequencing (WES)in thisfamily.Afterfiltering theWES data, Icompared five exome sequences oftwo affected siblings,one unaffected sibling,and theunaffected parents,and Idetermined the allele frequency of theidentifiedvariantsinanAsianpopulation.Finally,Iselectedonecandidate variantpaircorresponding toan autosomalrecessivegeneticmodel.Thetwo affected siblingshad thesamecompound heterozygousmutation in theNEB geneencoding nebulin,which wascomposed oftwodifferentnovelmissense

mutations:c.2603T>C (p.L868P)in exon 27 and c.21340C>T (p.R7114W)in exon 143.AsNEB genemutationsareknown to causeautosomalrecessive myopathiesand thepatientshavegeneralized muscleweaknesstogetherwith neurodevelopmental phenotypes, I concluded that this novel compound heterozygoteNEB mutationmightbethedisease-causingmutationunderlying thepatients’clinicalphenotypes.

Keywords:congenitalmyopathy,epilepsy,intellectualdisability,quadriplegia,whole exomesequencing,mutation,NEB gene,nebulin