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- 국문요약 -
핵산
핵산
핵산
핵산 가수분해
가수분해
가수분해
가수분해 촉매
촉매
촉매
촉매 활성을
활성을
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바이러스
바이러스
바이러스 증식억제
증식억제
증식억제
증식억제 효과
효과
효과
효과
3D8 단일가닥 가변부위 (single chain variable fragment, scFv) 항-DNA 자가
항체는 루푸스 병을 갖는 MRL-lpr/lpr 자가면역 생쥐에서 분리된 재조합 항체로써, 기존에 보고된 다른 항-DNA 자가 항체들과는 상이하게 ss-DNA,
ds-DNA, ss-RNA, 그리고 ds-RNA 에도 핵산 서열에 관계없이 결합하여 가수분해하는
활성이 있다. 본 연구에서는 3D8 scFv 항체의 핵산 가수분해 (nucleic acid-hydrolysis) 촉매 활성에 근거하여 RNA 바이러스인 수포성 구내염 바이러스
(vesicular stomatitis virus, VSV)에 대한 항-바이러스 효과를 HeLa 세포에서 정성적
또는 정량적으로 분석하였다. 정제된 재조합 3D8 scFv 단백질을 전기충격 방법으로 내부로 직접 유입시킨 후 VSV (MOI=10)로 감염시켰을 때, VSV 의 세포병변 효과인 에팝토시스 저해가 현미경 상에서 관찰되었다. 또한 3D8 scFv 를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립하여 VSV (MOI=0.1)로 감염시켰을 때, 유세포 분석에서 음성 대조군과 비교하여 40%정도 VSV 의 G 단백질 합성 저해가, 플라크 형성 시험에서 1 x 103 정도의 바이러스 입자형성 저해가 관찰되었다. 확립한 세포주에서 발현되는 3D8 scFv 가 핵산가수분해 활성을 유지하며, VSV 감염에 의해 유도되는 IFN-β의 발현이 HeLa 세포와 유사한 수준으로 낮게 검출되었으므로 항-바이러스 효과가 3D8 scFv 의 핵산가수분해
활성에 의한 것이라 생각된다. 결론적으로 핵산 서열에 관계없이 핵산을 가수분해하는 3D8 scFv 가 HeLa 세포 내에서 항-바이러스 활성이 있음을 확인하였다. 핵심어 핵심어핵심어
핵심어 : : : 3D8 단일가닥 가변부위 항체(single chain variable fragment, scFv), 핵산 : 가수분해(nucleic acid-hydrolysis), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 항-바이러스 효과
차
차
차
차 례
례
례
례
국문요약 ··· ⅰ 차례 ··· ⅲ 그림차례 ··· ⅴ 표차례 ··· ⅶ . Ⅰ 서론 ··· 1 . Ⅱ 재료 및 방법 ··· 6 A. 세포 배양 및 바이러스 ··· 6 B. 3D8 scFv 항체 단백질의 정제 ··· 6 C. 3D8 scFv 항체의 세포내로 유입 ··· 7D. Confocal laser scanning microscopy ··· 8
E. 3D8 scFv 유전자 발현벡터 제조 ··· 9 F. 3D8 scFv 유전자 발현벡터의 포장 세포로의 형질전환 및 레트로 바이러스 감염 ··· 10 G. 형질전환된 세포주의 확립 ··· 11 H. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (Reverse transcription PCR) ··· 11 I. 유세포 분석 (Flow cytometry) ··· 12 J. 세포 생존률 분석 (MTT assay) ··· 13
K. 플라크 분석 (Plaque assay) ··· 13
L. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리에 기초한 세포내 발현 3D8 scFv 의 핵산가수분해 활성 분석 ··· 14
M. 세포독성 (cytotoxicity) 평가 ··· 15
N. 세포주기 분석 (cell cycle analysis) ··· 16
O. 세포 성장률 (growth rate) 측정 ··· 16 . Ⅲ 결과 ··· 19 A. 3D8 scFv 단백질이 유입된 세포에서 보이는 항-바이러스 효과 ··· 19 B. 3D8 scFv 유전자 발현벡터 확립 ··· 23 C. 3D8 scFv 를 발현하는 HeLa 세포주의 확립 ··· 25 D. 3D8 scFv 가 발현되는 UJ 4-2 세포에서 항-바이러스 효과 ··· 29 E. UJ 4-2 세포에서 발현되는 3D8 scFv 의 핵산가수분해 활성··· 34 F. UJ 4-2 세포에서 인터페론의 수준분석 ··· 36 G. 3D8 scFv 의 세포독성 ··· 38 . Ⅳ 고찰 ··· 42 . Ⅴ 결론 ··· 46 참고문헌 ··· 47 ABSTRACT ··· 50
그림
그림
그림
그림 차례
차례
차례
차례
Fig. 1. Resistance of the HeLa cells bearing 3D8 scFv
against VSV-induced cell death ··· 21
Fig. 2. Exclusive localization of 3D8 scFv and VSV in HeLa cells ··· 22
Fig. 3. Construction of pLXIN-3D8 scFv for 3D8 scFv expression
in mammalian cells ··· 24
Fig. 4. Resistance of stable cell lines expressing 3D8 scFv
against VSV-induced cell death ··· 26
Fig. 5. Establishment of stable cell lines expressing 3D8 scFv ··· 27
Fig. 6. Resistance of stable cell lines expressing 3D8 scFv
against VSV-induced cell death ··· 28
Fig. 7. Reduction of VSV-G protein level in 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 ··· 31
Fig. 9. Resistance of 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 to VSV-induced cell death ··· 33
Fig. 10. DNA-hydrolyzing activity of the expressing 3D8 scFv in UJ 4-2 ··· 35
Fig. 11. Comparison of induction of IFN-ß mRNA in UJ 4-2
and control HeLa cells upon VSV infection ··· 37
Fig. 12. Cytotoxicity in HeLa cells transiently transfected
with pEGFPN2-3D8 scFv or pEGFPN2 ··· 39
Fig. 13. Quantitative cytotoxicity of HeLa cells expressing 3D8 scFv ··· 40
표
표
표
표 차례
차례
차례
차례
I. 서
서
서 론
서
론
론
론
DNA 에 결합하는 항-DNA 자가 항체 (anti-DNA autoantibodies)는 DNA 에
결합하는 단백질의 독특한 부류이며 (Stollar, 1981), 이들은 ss-DNA (single-stranded
DNA), ds-DNA (double-stranded dsDNA), 또는 Z 형-DNA 에 선택적으로 결합하는
특이성을 보이는 것으로 보고되어 있다 (Jang 과 Stollar, 2003). 항-DNA 자가 항체의 역가는 자가면역질환인 전신성 홍반성 낭창 (SLE: systemic lupus
erythematosus) 환자 또는 사람 SLE 의 대표적 동물모델 중 하나인 MRL-lpr/lpr
마우스에서 높게 나타나는 것이 관찰되었고, 항-DNA 자가 항체에 관한 연구가 자가면역질환에서의 병인기전에 집중적으로 이루어져왔다 (Dubrovskaya 등,
2003).
1986 년도에 처음으로 항체 중에서 효소처럼 기질을 가수분해할 수 있는
촉매항체 (catalytic antibody 또는 abzyme)가 보고되었고 (Tramontano 등, 1986),
항-DNA 자가항체 중에서 일부가 핵산가수분해 활성을 갖는 촉매항체라는 사실이 1992 년에 처음으로 알려지면서 (Shuster 등, 1992.), 핵산 가수분해 촉매항체에
대한 분자 생화학적인 연구가 시작되었다 (Nevinsky 와 Buneva, 2002). 최근까지 항-DNA 촉매항체에 관한 연구는 대부분 자가면역질환 환자와 임산부의 혈청, 모유에서 분리한 다클론 항체 (polyclonal antibody)에 대한 보고 (Dubrovskaya 등,
2003)가 있으며, 단일클론 항체인 BV04-01 는 티민 염기가 많은 ss-DNA 또는 ds-DNA 에 결합하여 가수분해하는 능력이 있음이 보고되었다 (Herron 등, 1991).
본 연구의 대상인 3D8 scFv 항-DNA 자가 항체는 루푸스 병을 갖는
MRL-lpr/lpr 자가면역 생쥐에서 단일클론으로 분리된 재조합 항체로써, 기존에 보고된
다른 항-DNA 자가 항체들과는 상이하게 ss-DNA, DNA, ss-RNA 및
ds-RNA 에도 핵산 서열에 관계없이 결합하여 (Kwon 등, 2002) 가수분해하는 활성을
보여주었다 (Kim 등, 2006).
항-DNA 자가 항체는 아니지만 핵산에 결합하여 가수분해하는 단백질 제재로는 DNase 와 RNase 같은 효소가 있으며, 이러한 효소 중에서 대부분의
RNase 는 항-바이러스 활성에 관한 연구가 보고되었다. 예를 들면, RNase A superfamily 에 속하는 황소개구리 (Rana catesbeiana) 난모세포에서 분리한
Onconase (Notomista 등, 2000)와 소의 췌장에서 분리한 BS-RNase (Bovine Seminal RNase) (Lee 와 Raines, 2005)는 H9 leukemia 세포에서 HIV-1 (Human immunodeficiency virus-type1)의 증식을 90~99.9% 억제했다는 연구가 보고되었다 (Youle 등, 1994). 또한, RNase P (Kim 등, 2004) 는 HCMV (human cytomegalovirus)의 capsid 단백질을 구성하는 CSP (capsid scaffolding protein)와 assmblin 의 mRNA 를
분해하여 항-바이러스 활성을 나타내는 연구에 관하여 보고되었다.
세포에서는 바이러스에 감염되었을 때, 바이러스의 증식을 억제시키고자 항-바이러스 싸이토카인 (antiviral cytokine)인 인터페론 (interferon, IFN)의 발현에 의해 핵산가수분해 활성이 있는 endoribonuclease 인 RNase L 의 발현이 유도된다
(Stark 등, 1998; Zhou 등, 1993). RNase L 의 발현은 OAS (oligoadenylate synthetase)에
의해 유도되고, OAS 의 합성은 인터페론에 의해 유도되는 것이다. 더불어 바이러스의 복제과정에서 생성된 ds-RNA 에 의해 발현이 유도된 RNase L 의 구조가 변하여 활성화됨으로써 기질특이성 없이 세포에 존재하는 mRNA 와
바이러스 RNA 를 분해하여 항-바이러스 효과를 나타낸다 (Ganes 와 Gregory,
2007). 이처럼 RNase L 은 특정 바이러스에 국한되지 않지만, ds-RNA 를 생성하는
바이러스에 대해서 항-바이러스 활성이 제한된다. 인터페론에 의해 발현이 유도되는 또 다른 RNase 로 exonuclease superfamily 에 속하는 ISG20 이 보고되었다. RNA 바이러스인 VSV, EMCV (encephalomyocarditis virus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) (Espert 등, 2003) 및 HIV-1 (Espert 등, 2005)에 대하여 항-바이러스 활성을 나타내지만, DNA 항-바이러스인 아데노 항-바이러스 (adenovirus)에 대한 항-바이러스 활성이 나타나지 않은 한계가 있다.
핵산 가수분해 촉매활성은 없지만 3D8 scFv 처럼 단일클론 항체로서 항-바이러스 활성에 관한 연구가 보고되었다. Nuc1 scFv 항체는 VSV (vesicular
stomatitis virus)에 대한 사람의 항-nucleocapsid 재조합 항체로써 in vitro 에서
VSV 의 전사를 억제한다 (Jean 등, 2005). 이처럼 단일클론항체는 특정
바이러스에서 강력한 항-바이러스 활성을 나타내지만, 바이러스 항원구조에 매우 의존적이므로 특정 바이러스 감염질환 치료에만 제한적으로 사용될 것이다
(Cardenas 등, 2005). 또한 RNA interference (RNAi) 원리에 기초한 약제 (RNAi-based drug)는 바이러스감염질환의 예방 및 치료에 사용하고자 하는 많은 시도로
숙주세포 수용체에 결합을 막기 위한 바이러스 표면항원이 표적이 되거나, 복제에 관련된 바이러스 특이 효소, 또는 보조인자들이 그 표적이 되었다. 즉 입, 호흡기를 통해 전염되는 인플루엔자 바이러스의 NP, PA, PB1 유전자가 표적인
siRNA (small interference RNA) 를 흡입함으로써 예방 및 치료 효과가 보고된 외에, HCV, HPV, HIV-1 의 증식억제 효과도 보고 되었다 (Radhankrishnan 등, 2004).
나타내지 못하는 문제를 안고 있다. 현재까지 항-바이러스제에 관한 연구는 바이러스에 따라 각각 흡착, 침입, 탈각, 핵산의 전사 또는 복제억제, 단백질합성 억제에 대해 높은 효능을 가진다. 그러나 이러한 약제들의 사용은 각종 기회감염률을 증가시키고 약제 저항성 바이러스주가 빠른 시간 내에 지속적으로 나타나는 부작용이 수반된다 (Magden 등, 2005). 본 연구에서는 염기서열에 대한 특이성 없이 ss-, ds-DNA/RNA 를 모두 가수분해하는 3D8 scFv 촉매항체의 항-바이러스 활성을 조사하고자 하였다. 이를 위하여 정제된 재조합 3D8 scFv 단백질을 전기충격 방법으로 표적세포 내부로 유입시키거나, 레트로 바이러스 벡터 시스템 (retroviral vector system)을 이용하여 동물세포에서 3D8 scFv 유전자를 도입시킴으로써 3D8 scFv 를 안정적으로 발현하는 세포주를 확립한 후, 바이러스 증식 억제효과를 분석하였다. 세포질 내부에 유입 또는 발현되는 세포에서 항-바이러스 효과를 분석하기 위해 RNA 바이러스인 VSV 를 사용하였다. VSV 는 negative-sense single stranded RNA (ss-RNA) 바이러스로서 Rhabdoviridae 의 subfamily 에 속하며 N (nucleocapsid), P (phosphoprotein), M (matrix), G (glycoprotrein), 및 L (RNA polymerase)의 다섯 개
유전자를 가지고 있다 (Courtney Wilkins 등; Hong 등, 2005). VSV 는 광범위한 포유동물 세포에 감염될 수 있어서 숙주세포 사용에 대한 제한이 적고, 감염된 세포에서 apoptosis 를 일으키는 세포병변 효과 (Cytopathic effect, CPE)를 나타냄으로써 항-바이러스 효과를 증명하는데 용이하다는 장점이 있다 (Isabel S
Novella, 2003).
핵산가수분해 활성을 갖는 촉매항체의 의학적, 생화학적, 생명 공학적 응용의 중요성에도 불구하고, 현재까지의 연구는 기질과의 결합 및 촉매 기작에
대한 연구에 국한 되었으며, 항-바이러스 활성평가 및 활성기전에 대한 연구는 지금까지 시도된 바가 없다. 본 연구에서는 3D8 scFv 항체의 염기서열에
관계없이 ss-, ds-DNA/RNA 을 가수분해하는 촉매활성에 근거하여 RNA
바이러스인 VSV 에 대한 항-바이러스 효과를 정성적 또는 정량적으로
.
Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ
Ⅱ 재료
재료
재료 및
재료
및
및
및 방법
방법
방법
방법
A. 세포세포 배양세포세포 배양배양배양 및및및 바이러스및 바이러스바이러스바이러스
표적 세포주인 HeLa (Human cervical carcinoma cell line)와 포장 세포주
(packaging cell line)인 RetroPack TM PT67 (S1114) 세포는 각각 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)와 Invitrogen (Grand Island, NY)으로부터
구입하였다. 세포를 배양하기 위하여 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM;
Invitrogen, Grand Island, NY) 배지에 10% (v/v) 우태아 혈청 (Fetal Calf Serum, FCS), 100 units/㎖의 penicillin, 그리고 및 100 ㎍/㎖의 streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가하여 사용하였으며 37°C, 5 % CO2 의 환경에서 배양하였다.
수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus, VSV)는 Vero (monkey
kidney cell line) 세포에 감염시켜 얻었다. 즉 10% (v/v) 우태아 혈청, 100 units/㎖의 penicillin, 및 100 ㎍/㎖의 streptomycin 를 첨가한 배지에서 Vero 세포를 24 시간
배양한 후, 세포배양액을 원심분리하여 바이러스가 포함된 상청액을 얻었다. 바이러스 역가는 플라크 분석 (plaque assay)을 통하여 측정하였다.
B. 3D8 scFv 항체항체항체 단백질의항체 단백질의단백질의단백질의 정제정제정제 정제
박테리아에서 protein A tag을 가진 3D8 scFv를 발현하는 pIg20-3D8 scFv를 E.
chloramphenicol이 포함된 500 ㎖ LB배지에 접종하고 O.D.600= ~0.8까지 배양하고
0.5 mM isopropyl 1-thio-ß-D-galactopyranoside (IPTG)를 첨가한 후, 20°C 에서 16
시간 동안 배양함으로써 3D8 scFv 발현을 유도하였다. 배양액을 원심분리한 후, 세포 파쇄물을 제거하기 위해 상청액을 여과하고 (0.45 ㎛), 1 ml/min 속도로
IgG-SepharoseTM affinity 컬럼 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (2-3 ml bed volume)에 통과시켰다. 컬럼을 300 ㎖ 인산완충용액 (Phosphate buffered saline; PBS, pH 7.2) 및 10 ㎖의 5 mM ammonium acetate 용액 (pH 5.2)으로 세척한 후, 0.1 M acetic acid (pH 3.4)로 단백질을 용출시켰다 (2 ㎖/fraction). Vivaspin 10 (molecular cut-off 10,000)에 용출된 단백질과 PBS를 넣고 반복적으로 원심분리를 수행함으로써,
용출된 단백질을 농축시키는 동시에, PBS로 완충용액을 교체하였다.
C. 3D8 scFv 항체의항체의항체의 세포내로항체의 세포내로세포내로세포내로 유입유입유입유입
3D8 scFv 항체 단백질을 세포 내부로 직접 전달하기 위하여 전기충격 방법 (electroporation)을 사용하였다. 1105 세포를 1.5 ㎖ 튜브에 옮긴 후, 원심분리하여 배지는 제거하고 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, 세포를 원심분리 하였다. 세포 침전물에 solution S buffer (Digital Bio Technology, 경기, 한국) 10 ㎕을
첨가하여 세포를 풀어주었고, 세포가 녹아있는 튜브에 제품에 제시된 순서에
따라 Alexa fluor 488 (Invitrogen, Grand Island, NY)이라는 형광물질로 표지한 3D8
scFv 항체 20 ㎍을 첨가하였다. Tube-EC (Digital Bio Technology, 경기, 한국)에 solution L buffer (Digital Bio Technology, 경기, 한국)을 3 ㎖ 첨가한 후, pipette station에 삽입하였다. 그 다음 1) Microporator pipette (Digital Bio Technology, 경기,
한국)를 이용하여 10 ㎕를 조심스럽게 따내었다. 2) pulse voltage=1000, pulse
width=35, pulse number=2 조건으로 전기를 가한 후, 준비해 놓은 배지에
넣어주었고 계속해서 1)~2)를 반복하였다.
D. Confocal laser scanning microscopy
3D8 scFv가 발현 또는 유입된 5104 세포를 멸균된 cover glass를 넣은 24
well plate 의 well에서 24시간 동안 배양하였다. 그 다음날 VSV를 0.1 또는 1 MOI (multiplicity of infection)로 감염시킨 다음 37°C, 5% CO2의 환경에서 배양하였고,
1시간 후에 새로운 배지로 교환해 주었다. 다시 각각 다른 시간으로 배양한 후,
배지를 제거하였고 4 , 2% BSA℃ (Bovine Serum Albumin) / PBS로 blocking하였다.
4℃의 fixation/permeabilization solution (Becton Dickinson, San Jose, CA) 을 400 ㎕
첨가하여 20분 동안 4℃에서 고정시킨 후, 다시 4 , 2% BSA ℃ / PBS로 2번 세척하였다. 3D8 scFv 항체를 검출하기 위해 rabbit-3D8 scFv 항체를 1:2,000으로
2% BSA / PBS로 희석해서 well에 500 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 1시간 동안
반응시켰고, 4°C, 2 % BSA / PBS로 3번 세척한 후, anti-rabbit-TRITC 항체 (Sigma, St.
Louis, MO)를 1:1,000으로 2% BSA / PBS로 희석해서 well에 500 ㎕ 첨가하여 4℃에서 40분 동안 반응시켰고, 다시 4℃, 2% BSA in PBS로 3번 세척하였다.
바이러스를 검출하기 위해서 anti-VSV-FITC 항체 (abcam, Cambridge, UK )를
1:1,000으로 2 % BSA / PBS로 희석해서 well에 500 ㎕ 첨가하여 4℃에서 40분
동안 반응시켰고, 다시 4°C, 2 % BSA / PBS로 3번 세척하였다. 미리 준비한 slide
세포를 배양한 후 형광 염색한 cover glass를 그 위로 덮고, 매니큐어로 cover
glass주변을 고정시켜서 최종적으로 scanning confocal fluorescence microscope (LSM510, Carl Zeis, Thornwood, NY)로 세포를 관찰하였다.
E. 3D8 scFv 유전자유전자유전자 발현벡터유전자 발현벡터발현벡터발현벡터 제조제조제조제조
레트로바이러스 매개 유전자 전달 및 발현 벡터인 pLXIN 는 Invitrogen
(Grand Island, NY) 으로부터 구입하였고, 진핵세포에서 5’ LTR promotor/enhancer 에
의해 원하는 유전자의 발현 및 선별을 위한 네오마이신 (G418) 저항성 유전자가 발현된다. 3D8 scFv 유전자를 pLXIN 에 XhoI 과 BamHI 제한효소 인식부위로
삽입하기 위해 프라이머 (primer)를 제작하고 박테리아에서 3D8 scFv 를
발현하는 pIg20-3D8 scFv 를 주형으로 하여 PCR 을 수행하였다. 그 후 PCR 산물과
pLXIN 벡터를 XhoI 과 BamHI 제한효소로 37°C 에서 반응시킨 후 3D8 scFv 유전자의 약 750bp 크기와 pLXIN 의 약 6.1 Kb 크기를 젤 전기영동으로
분리하여 준비하였다. 각각 같은 XhoI 과 BamHI 제한효소 인식부위로 준비된
3D8 scFv 유전자, pLXIN 벡터, T4 DNA ligase (NEB, Beverly, MA)를 혼합하여 14°C 에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 반응혼합물을 E. coli DH5α 에 열충격 (heat shoct)으로 형질전환 (transformation)시킨 후 ampicillin 이 100 ㎍/㎖의 농도로
함유되어있는 LB 평판배지에 배양하였다. 자란 단일 클론을 ampicillin 이
100 ㎍/㎖의 농도로 함유되어있는 LB 액체배지에서 배양한 후 DNA miniprep kit (Intron, 경기, 한국)를 사용하여 plasmid DNA 를 순수 분리하였다. 이를 XhoI 과
3D8 scFv 유전자가 pLXIN 벡터에 삽입되었는지의 여부를 확인하였고, 염기서열 분석으로 재확인하였다. 분석결과, 3D8 scFv 유전자가 변이되지 않고 pLXIN 벡터에 정확히 삽입되었는지 최종적으로 확인하고 pLXIN-3D8 scFv 라고 명명하였다. F. 3D8scFv 유전자유전자유전자유전자 발현벡터발현벡터발현벡터발현벡터의의의 포장의 포장포장포장 세포로의세포로의 형질전환세포로의세포로의 형질전환형질전환형질전환 및및및및 레트로레트로 바이러스레트로레트로 바이러스바이러스바이러스 감염감염감염감염 구축된 pLXIN-3D8scFv를 lipofectamine TM
(Invitrogen, Grand Island, NY)을
이용하여 재조합 레트로 바이러스 포장 세포주인 PT67 세포에 먼저 형질전환
(Transfection)하였다. PT67 세포 2105 개를 6 well plate 의 well에서 약 24시간
동안 키운 후 혈청이 함유되진 않은 TOM TM
(transfection optimized medium; Welgene, 서울, 한국)으로 세척하였다. DNA 2 ㎍과 5 ㎕의 lipofectamine TM 및 200
㎕의 TOM TM 을 잘 섞어서 만든 혼합액을 15 분 동안 상온에서 반응시킨 후 TOM TM 800 ㎕를 더 첨가하여 세포가 준비된 well에 붓고 혼합액이 세포에 고르게 닿도록 흔들어준 후 8시간 동안 37 , 5℃ % CO2의 환경에서 배양하였다. 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 첨가하여 약 24시간 동안 배양한 후 플라스미드 (plasmid)를 갖고 있지 않은 세포들은 800 ㎍/㎖의 G418 (Duchefa,
Haarlem, The Netherlands)이 함유된 배지에서 배양하면 죽기 시작한다. G418dl
함유된 배지로 세포를 2일 간격으로 갈아주면서 약 3주정도 배양하게 되면
살아남은 세포가 클론을 형성하기 시작하여 well에 세포들이 자랐을 때 약 2~3일
동안 더 배양하여 바이러스 상층액을 얻었고, 0.45 ㎛ 여과지를 이용하여 세포
(transduction)하기 위해 HeLa 세포 1105 개를 60 mm 배양접시에서 약 24시간
동안 배양한 후 10 ㎍/㎖이 되도록 polyblene (hexadimethrine bromide; Sigma, San
Jose, CA)을 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지에 첨가하여 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 위에서 준비된 재조합 레트로 바이러스 상층액 5
㎖을 첨가 한 후 24시간 동안 37 , 5%℃ CO2에서 배양한 후, 이 과정을 1회 더 반복하여 G418 선별을 수행하였다.
G. 형질전환된형질전환된 세포주의형질전환된형질전환된 세포주의세포주의세포주의 확립확립확립 확립
레트로 바이러스에 의한 형질전환 후 약 3 주 동안 G418 선별에 의한 형질도입 세포의 콜로니들이 형성되면 trypsin-EDTA 용액 (Invitrogen, Grand Island,
NY)을 이용하여 각각의 콜로니들을 단일세포로 분리하였다. 세포들은 96 well plate 에서 0.5 cells/well 이 되도록 제한희석법 (limiting dilution)을 수행하여 단일
세포주를 확립하였다. H. 역전사역전사역전사 중합역전사 중합중합 효소중합 효소 연쇄효소효소 연쇄연쇄 반응연쇄 반응반응반응 (Reverse transcription PCR; RT-PCR) 제한희석법으로 얻은 단일 세포주들로부터 easy-BLUE TM (Intron, 경기, 한국)를 사용하여 total RNA 를 분리하였다. 60 mm 배양접시에 가득 자란 세포 (1106 cell)에서 배지를 제거하고 easy-BLUE TM 용액을 1 ㎖ 넣어서 전체 세포 파쇄액을 1.5 ㎖ 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름 (chloroform)을 200 ㎕ 넣고 잘 흔들어서 섞은 후 4℃에서 13,000 rpm 으로 15 분 동안 원심분리하였다.
무색의 상층액을 다른 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 동량의 isopropanol 을 넣어서 잘 섞은 후 4℃에 15 분 동안 방치해두었다가 4℃에서 13,000 rpm 으로 15 분 동안 원심분리하였다. 흰색의 침전물을 70% alcohol 로 세척하여 말린 후 0.1% DEPC 가 함유된 증류수에 녹였다. 각 세포주들이 3D8 scFv mRNA 를 발현하는지 확인하여 위하여 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 총 세포 RNA (total cellular RNA) 2 ㎍과 1 ㎍ 의 oligo dT18 표식자 및 증류수를 혼합하여 70℃에서 5 분 동안 반응시킨 후 RT premix (Bioneer, 대전, 한국)에
혼합하여 총 50 ㎕의 RT 반응액을 만든 후 42℃에서 1 시간 동안 반응시켰다.
이를 94℃에서 5 분간 역전사 효소를 불활성화한 후 얻어진 cDNA 를 PCR 의 주형으로 사용하였다. PCR 반응액은 cDNA, 5X PCR premix (Elpis, 대전, 한국),
reverse 표식자인 5’ pQCXIN (AgeI) 그리고 forward 표식자인 3’3D8 (XhoI) 를
혼합하여 총 15 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 먼저 94℃에서 7 분간 변성시킨 후 94℃에서 1 분간 변성, 54℃에서 1 분간 표식자와의 결합, 72℃에서 1 분간 DNA 신장반응을 시키는 과정을 35 cycles 수행한 후 72℃에서 7 분간 유지하였다. 얻어진 PCR 산물은 1% agarose gel 에 전기영동하여 확인하였다. I. 유세포유세포유세포유세포 분석분석분석 (Flow cytometry) 분석 3105 세포를 FACS 튜브에 옮긴 후, 원심분리하여 배지는 제거하고 FACS 완충용액 (0.1% BSA / PBS)으로 세척하였다. 고정완충용액 (4% paraformaldehyde + FACS 완충용액)으로 37°C 에서 10 분간 세포를 고정 (fixation)하였고, 고정이 끝난 세포는 다시 FACS 완충용액으로 세척하여 permeabilization 완충용액 (1%
BSA + 0.1% saponin + 0.1% sodium azide in PBS)으로 얼음에서 1 시간 동안 세포막
투과화 (permeabilization)하였다. 투과화 된 세포는 Rabbit-3D8 scFv 항체를
1:500 으로 permeabilization 완충용액으로 희석해서 얼음에서 1 시간 동안 반응시켰고, permeabilization 완충용액으로 3 번 세척하였다. 그 후 anti-rabbit-FITC 항체 (Pierce, Rockford, IL)를 1:500 으로 permeabilization 완충용액으로 희석해서 얼음에서 1 시간 동안 반응시켰고, 다시 permeabilization 완충용액으로 5 번 세척하였다. 최종적으로 fluorescence activated cell sorter (FACS; Becton Dickinson, San
Jose, CA)로 분석하였다. J. 세포세포세포세포 생존율생존율생존율생존율 분석분석분석분석 (MTT assay) 전날 96 well plate 에 1104 HeLa 세포를 배양한 후 VSV 를 0.1 과 1 MOI 로 감염시킨 다음 37°C, 5% CO2의 환경에서 1 시간 동안 배양하였다. 새로운 배지로 교환하여 각기 다른 시간 동안 다시 배양하였다. 그 다음 5 ㎎/㎖ MTT
(3-8[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide; Sigma, St. Louis, MO)를 각 well 에 20 ㎕씩 첨가하여 37°C, 5% CO2 의 환경에서 4 시간 동안 배양하였다.
MTT 에 의해 생성된 포마잔 (fomazan)은 200 ㎕의 DMSO 로 녹였고, 세포 생존율 (cell viability)은 microplate reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 595 nm 에서
흡광도를 측정하여 산출하였다.
전날 6 well plate 에 5105
개의 Vero 세포를 배양한 후 10 배씩 계단 희석한 VSV 를 감염시킨 다음 37°C, 5% CO2의 환경에서 1 시간 동안 배양하였다.
1% agarose 에 2complete DMEM 을 동량 넣어 혼합한 뒤 각 well 에 2 ㎖씩 넣고 agarose 가 굳을 때까지 기다린 후, agarose 가 굳으면 37°C, 5% CO2의 환경에서 다시 배양하였다. 하루 경과 후 각 well 에서 agarose 를 제거하여 세포 염색액 1 ㎖을 넣고 10 분간 반응시켰다. 염색액을 제거한 후, 증류수로 세포 표면을 가볍게 세척하여 플라크가 20 에서 50 개 정도 생긴 희석군을 선별하여 역가를 산출하였다.
L. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 원리에원리에원리에원리에 기초한기초한기초한기초한 세포내세포내세포내 발현세포내 발현발현 발현 3D8 scFv의의의의 핵산가수분해핵산가수분해핵산가수분해 활성핵산가수분해 활성활성활성 분석분석분석 분석
전날 96 well black plate 에 1104
세포를 배양한 후 혈청이 함유되진 않은
TOM TM 으로 세척하였고, TOM TM 으로 30 분간 배양하였다. 그 다음에 5’
말단에는 형광 (FAM)으로 표지하고 3’ 말단에는 blackhole quencher (BHQ)가 없는
DNA 기질 (5’ FAM - CGA TGA GTG CCA TGG ATA TAC - 3’) 또는 5’ 말단에는
형광으로 표지하고, 3’ 말단에는 quencher 로 표지한 DNA 기질 (5’ FAM - CGA
TGA GTG CCA TGG ATA TAC - BHQ 3’) 500nM (Bioneer, 대전, 한국)을 5 ㎕의 lipofectamine TM 및 200 ㎕의 TOM TM 과 잘 섞었다. 혼합액을 15 분 동안
상온에서 반응시킨 후 TOM TM
800 ㎕를 더 첨가하여 세포가 준비된 well 에 100 ㎕씩 붓고 혼합액이 세포에 고르게 닿도록 흔들어 주었다. 세포 내에서
Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 로 530 nm 에서 형광 정도를 측정하여
산출하였다.
M. 세포독성세포독성 (cytotoxicity) 평가세포독성세포독성 평가평가평가
3D8 scFv와 녹색 형광물질 (green fluorescence protein, GFP)이 결합하여
발현하는 플라스미드인 pEGFPN2-3D8 scFv 와 녹색 형광물질만을 발현하는
플라스미드인 pEGFPN2를 HeLa세포에 일시적인 형질 도입을 하였다. 5104
HeLa 세포를 멸균된 cover glass를 넣은 24 well plate 의 well에서 24시간 동안
배양한 후 혈청이 함유되진 않은 TOM TM
(transfection optimized medium; Welgene,
서울, 한국)으로 세척하였다. DNA 1 ㎍과 2.5 ㎕의 lipofectamine TM 및 100 ㎕의 TOM TM 을 잘 섞어서 만든 혼합액을 15 분 동안 상온에서 반응시킨 후 TOM TM 400 ㎕를 더 첨가하여 세포가 준비된 well에 붓고 혼합액이 세포에 고르게 닿도록 흔들었고, 8 시간 동안 37 , 5℃ % CO2의 환경에서 배양하였다. 그 후 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 첨가하여 24 시간, 48 시간 그리고 72 시간 동안 배양하였다. PBS로 3번 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정하여 미리 준비한 slide glass 위에 mounting solution-DAPI (Invitrogen, Grand Island, NY)를 3 ㎕를 첨가하여 세포를 배양한 후 고정한 cover glass를 그 위로 덮고, 매니큐어로 cover glass 주변을 고정시켜서 최종적으로 scanning confocal fluorescence microscope로 관찰하였다. 6 well plate에서 pEGFPN2와 pEGFP-3D8 scFv의 0.5, 1, 및 2 ug을 세포 내로 일시적인 형질 도입을 하고 24시간 배양하였다. 그 후, PBS로 두 번 세척하고 세포를 200 ㎕의 PBS에
suspension 한 다음 PI (propidium iodide (5 ㎍/㎖))을 1 ㎕첨가 해준 뒤 실온에서 10분간 반응시켜 유세포 분석기로 분석하였다. 96 well plate에서 pEGFPN2와 pEGFP-3D8 scFv의 0.5, 1, 및 2 ug으로 일시적인 형질 도입을 하고 24 시간
배양하였다. 그 다음 배양액에 MTT 용액을 넣고 4시간 동안 반응 후, 배양액을 제거하고 DMSO로 suspension 한 다음 595 nm에서 OD값을 측정하였다.
N. 세포주기세포주기세포주기세포주기 분석분석분석 (cell cycle analysis) 분석
Cycletest (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용해서 제품에 제시된 순서에
따라 DNA를 염색하여 세포주기를 분석하였다. 10% 우태아 혈청이 첨가된
DMEM 배양액에 5×105 세포를 부유 시킨 후 PBS로 세척하였다. 그 후, 250 ㎕의 solution A (trypsin 완충용액)를 첨가하여 10분 동안 상온에서 반응시켰고, 그 다음 200 ㎕의 solution B (trypsin 활성 억제제와 RNase 완충용액)를 첨가하여 10분
동안 상온에서 반응시켰다. 마지막으로 200 ㎕의 Solution C (PI; propidium iodide 염색 용액)를 첨가하여 10분 동안 4°C에서 반응시켰다. 염색된 시료는
fluorescence activated cell sorter로 DNA의 양을 측정하여 세포주기를 분석하였다.
O. 세포세포세포세포 성장률성장률성장률성장률 (growth rate) 측정측정측정측정
96 well plate 에서 5103 세포를 1 일부터 4 일까지 배양한 후 5 ㎎/㎖ MTT 를
MTT 에 의해 생성된 포마잔 (fomazan)은 200 ㎕의 DMSO 로 녹였고, 세포 생존율 (cell viability)은 microplate reader 로 595 nm 에서 흡광도를 측정하여 산출하였다.
Table 1. Primers for PCRs
Primer Nucleotide sequence Reverse 5’ TCTCGAGATGGAGGTCCAGCTGCAG 3’ 5’ pLXIN (XhoI)
Forward 5’ TGGATCCTTATTA AAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTC 3’ pLXIN (BamHI) TTTTATTTCCAGCTTGGTCCC 3’
Reverse 5’ TACCGGTATGGAGGTCCAGCTGCAGC 3’ 5’ pQCXIN (AgeI)
Forward 5’ CCGCTCGAGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC 3’ 3’ 3D8 (XhoI)
IFN-ß reverse 5’ CCTGTGGCAATTGAATGGGAGGC 3’ IFN-ß forward 5’ CCAGGCACAGTGACTGTCCTCCTT 3’
ß-actin reverse 5’ GTCCTCTCCCAAGTCCACAC 3’ ß-actin forward 5’ GGGAGACCAAAAGCCTTCAT 3’ Italic letters indicate sequence that is recognized by restriction enzyme.
Stop codon C myc tag Start codon
.
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅲ 결과
결과
결과
결과
A. 3D8 scFv 단백질이단백질이단백질이 유입된단백질이 유입된유입된 세포에서유입된 세포에서세포에서세포에서 보이는보이는 항보이는보이는 항항-바이러스항바이러스바이러스 효과바이러스 효과효과효과 세포질에서 복제가 일어나는 RNA 바이러스인 VSV 에 대한 항-바이러스 효과를 확인하기 위해서 3D8 scFv 단백질을 박테리아에서 정제하였다 (Fig. 1A). 3D8 scFv 를 표적 세포인 HeLa 세포 내부로 직접 유입시키기 위하여 전기충격 방법을 이용하였고, 이 방법을 통해 세포의 내부로 3D8 scFv 가 유입되었는지 확인하기 위해 항체에 형광물질 (Alexa fluor 488)을 표지하여 사용하였다. 세포 내부로 유입된 3D8 scFv 는 표지한 형광물질에 의해 형광현미경 (fluorescencemicroscope)으로 확인하였고, 세포병변 효과 (cytopathic effect, CPE)로서
에팝토시스 (apoptosis)를 일으키는 VSV 를 감염시켜 3D8 scFv 가 유입된 세포에서의 항-바이러스 효과를 확인하였다 (Fig. 1B). 그 결과 3D8 scFv 가 유입되지 않은 대조군에서는 VSV 를 감염시키지 않은 대조군과 비교하여
VSV 에 의한 세포병변효과 (cytopathic effect; CPE)인 에팝토시스가 일어난 반면에
형광물질로 표지된 3D8 scFv 의 유입을 확인한 세포군에서는 VSV 를 감염시키지 않은 대조군과 거의 유사한 세포 형태를 유지하고 있었다. 또한 3D8 scFv 는 적색형광으로, VSV 는 녹색형광으로 염색하여 세포 내부에서의 각각의 위치를
confocal microscope 를 통해 관찰한 결과, 3D8 scFv 가 유입된 세포에서는
확인하였다 (Fig. 2). 결론적으로 3D8 scFv 가 유입된 세포에서는 3D8 scFv 에 의해 항-바이러스 효과가 나타남을 확인하였다.
3D8scFv -/ VSV – 3D8scFv + / VSV – 3D8scFv – / VSV + 3D8scFv + / VSV + 3D8scFv -/ VSV – 3D8scFv + / VSV – 3D8scFv – / VSV + 3D8scFv + / VSV + KDa 50 40 30 20
Fig. 1. Resistance of the HeLa cells bearing 3D8 scFv against VSV-induced cell death. (A) Reducing SDS-PAGE analysis of the purified 3D8 scFv (34 KDa). (B) The HeLa cells were electroporated with the Alexa flour 488-labeled 3D8 scFv (20 ug) per 1 x 105 cells and incubated for 24 h. The HeLa cells delivered with 3D8 scFv or control HeLa cells were infected with VSV (MOI = 10) for 24 h and the 3D8 scFv was detected with green fluorescence under fluorescent microscope. (3D8 scFv - : No 3D8 scFv delivery, 3D8 scFv + : 3D8 scFv delivery, VSV - : No VSV infection, VSV + : VSV infection)
Phase contrast microscope Fluorescent microscope
A.
B.
M 3D8 scFv3D8 scFv-delivered cells HeLa
Fig. 2. Exclusive localization of 3D8 scFv and VSV in HeLa cells. The HeLa cells were electroporated with 20 ug of 3D8 scFv in 1 x 105 cells and infected with VSV (MOI = 10). After infection for 6 h, the cells were fixed and permeabilized. And then 3D8 scFv was stained with rabbit anti-3D8 scFv and goat TRITC-conjugated anti-rabbit. VSV G protein was stained with goat FITC-conjougated anti-VSV G-tag. Finally the stained 3D8 scFv and VSV in HeLa cells were observed by confocal microscope.
B. 3D8 scFv 유전자유전자유전자유전자를를를 발현하는를 발현하는발현하는 벡터의발현하는 벡터의벡터의 확립벡터의 확립확립확립 일시적인 형질전환에 의한 단백질 발현 또는 전기충격에 의한 세포 내로의 3D8 scFv 단백질 유입으로 인위적인 항-바이러스 효과가 나타날 수 있는 가능성을 배제하기 위하여, 3D8 scFv 를 발현하는 세포주를 확립하였다. 이를 위해 레트로 바이러스 유래 프로모터를 갖는 동물세포 발현벡터인 pLXIN 을 사용하였고, pIg20-3D8 scFv 를 주형으로 이용하였다. PCR 로 증폭한 3D8 scFv 유전자를 XhoI 과 BamHI 제한효소 인식부위에 삽입하였고, 3D8 scFv 유전자가 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위하여 XhoI 과 BamHI 제한효소로 잘라 1 %
agarose gel 에 전기영동 하였다 (Fig. 3). 그 결과 약 6 Kb 의 벡터 크기의 가닥과
약 750 bp 의 3D8 scFv 유전자 산물을 관찰함으로써 클론닝이 되었음을 확인하였다. 3D8 scFv 유전자가 변이되지 않고 pLXIN 벡터에 삽입되었음을 염기서열 분석 결과를 통해 확인하였다 (data not shown).
A. B.
pLXIN
Xho I Xba I Bgl Ⅱ BamH I
myc VL VH linker (6.1kb) 3D8scFv (750bp) pLXIN
Xho I Xba I Bgl Ⅱ BamH I
myc VL VH linker (6.1kb) 3D8scFv (750bp) pLX IN-3 D8 scFv M pL XIN -3D 8 sc Fv M
Fig. 3. Construction of vector for 3D8 scFv expression in mammalian cells. (A) Schematic representation of pLXIN-3D8scFv. (B) Analysis of plasmid by agarose gel electrophoresis. After plasmid was treated with restriction enzymes of XhoI and BamHI for 1hr at 37℃, sample was analyzed with agarose gel electrophoresis followed by staining with ethidium bromide (M: Size Marker).
6.1 Kb
C. 3D8 scFv 를를를 발현하는를 발현하는발현하는발현하는 HeLa 세포주의세포주의세포주의세포주의 확립확립확립확립 3D8 scFv 항체를 지속적으로 발현할 수 있는 HeLa 세포주를 확립하기 위해 구축된 pLXIN-3D8 scFv 을 가진 재조합 레트로 바이러스를 HeLa 세포에 감염시켜 형질전환하였다. 형질전환 후, G418 로 선별하여 약 50 개의 단일 클론들을 얻었고, VSV 를 감염시킨 HeLa 세포와 비교하여 세포병변 효과가 저해되어 항-바이러스 활성을 나타내는 세 개의 단일 클론들 (UJ 4-2, UJ 5-18, UJ5-26)을 광학 현미경을 통해 확인하여 선별하였다 (Fig. 4). 항-바이러스 효과를 나타내는 각각의 클론들이 세포 내에서 3D8 scFv 의 항체를 발현하는 세포주로 확립되었는지 확인하기 위해 세포의 RNA 를 분리하여, 3D8 scFv mRNA 유전자를 검출하기 위한 RT-PCR 을 수행하였다. 양성 대조군으로는 pLXIN-3D8 scFv 플라스미드 DNA 를 사용하였고, 음성 대조군으로는 pLXIN-3D8 scFv 를
형질전환하지 않은 HeLa 세포의 RNA 로부터 합성한 cDNA 를 사용하였다.
RT-PCR 결과, 세 개의 클론에서 정도는 다르지만 양성 대조군에서 증폭된 3D8 scFv 유전자와 같은 750 bp 크기의 밴드가 증폭되었고, 반면 음성 대조군으로 사용했던 형질전환하지 않은 세포에서는 밴드가 관찰되지 않았다 (Fig. 5). 따라서 3D8 scFv 의 유전자를 가진 세포주가 확립되었음을 확인하였고, 최종적으로 선별된 세 개의 클론 (UJ 4-2, UJ 5-18, UJ5-26)에 바이러스를 감염시킨 후 세포 생존율 분석 (MTT assay)을 통하여 항-바이러스 효과가 가장 크게 나타나는 UJ 4-2 클론을 선택하여 이후의 실험에 사용하였다 (Fig. 6).
Fig. 4. Resistance of stable cell lines expressing 3D8 scFv against VSV-induced cell death. Control HeLa and stable lines expressing 3D8 scFv were infected with VSV (MOI = 1) and incubated for 24 h. Resistance of stable line expressing 3D8 scFv against VSV-induced apoptosis was observed by optical microscope.
ß-actin
Fig. 5. Establishment of stable cell lines expressing 3D8 scFv. HeLa cells were transducted with recombinant retrovirus having pLXIN-3D8 scFv gene. After G418 selection, colonies were obtained and their RNA were isolated from HeLa and stable lines. PCR was performed to selectively amplify 3D8 scFv gene using a primer set of 5’pQCXIN and 3’3D8 and PCR products were electrophoresed on 1% agaorse gel. Lane 1: Size Marker (M), Lane 2: pLXIN-3D8scFv; Positive control (+), Lane3: HeLa; Negative control (-), Lane 4: UJ 4-2, Lane 5: UJ 5-18, Lane 6: UJ 5-26.
3D8 scFv
0 20 40 60 80 100 HeLa UJ 4-2 UJ 5-18 UJ 5-26 MTT assay (M.O.I=1) 12h 24h 36h Time [h] C e ll v ia b il it y ( % ) 0 20 40 60 80 100 HeLa UJ 4-2 UJ 5-18 UJ 5-26 MTT assay (M.O.I=0.1) 12h 24h 36h Time [h] C e ll v ia b ili ty ( % )
Fig. 6. Resistance of stable cell lines expressing 3D8 scFv against VSV-induced cell death. HeLa control cells and stable cell lines expressing 3D8 scFv were infected with VSV (MOI = 0.1 or 1). After incubation for 12 h, 24 h, and 36 h, 20 ㎕ of the MTT reagent was added and incubated for 4 h. Absorbance at 595 nm was measured with microplate reader and cell viability was calculated.
D. 3D8 scFv 가가가 발현가 발현발현발현되되되는되는 UJ 4-2 세포주에서는는 세포주에서세포주에서세포주에서 항항항항-바이러스바이러스바이러스바이러스 효과효과효과 효과
항-바이러스 효과를 정성, 정량적으로 분석하기 위해 confocal microscopy, 유세포 분석 (flow cytometry), 플라크 형성 분석 (plaque forming assay) 및 세포 생존율 분석 (MTT assay)을 수행하였다. Confocal microscope 를 이용하여 항-바이러스 활성을 시각화하기 위해 VSV 는 0.1 MOI (multiplicity of infection)로 감염시킨 후 15 시간 동안 배양한 다음 면역형광 염색법으로 VSV 의 G 단백질을 녹색형광으로 검출하였다. 그 결과 HeLa 세포에 비교하여 UJ 4-2 세포에서 VSV 의 단백질 발현이 저해되었다 (Fig. 7A). 또한 유세포 분석으로 VSV 의 G 단백질 발현이 저해되었는지를 FITC 가 표지된 anti-VSV G protein 항체를 이용하여 검출하였을 때, HeLa 음성대조세포와 비교하여 UJ 4-2 세포에서 상대적으로 40% 정도 낮게 검출되었다 (Fig. 7B). 3D8 scFv 의 발현에 의한 VSV 입자형성 저해를 알아보고자 VSV 를 감염시켜 시간 별로 얻은 배양액 내 바이러스 농도를 측정하는 plaque forming assay 를 수행하였다
(Fig. 8). 그 결과 15 시간 동안 배양하여 얻은 배양액에서 HeLa 음성대조세포에
비하여 UJ 4-2 세포에서 약,1,000 배정도 낮은 PFU (plaque forming unit) 값을 얻었고, 이로써 UJ 4-2 세포에서 VSV 의 복제 또는 방출이 감소하였음을 확인하였다 (Fig. 8). 3D8 scFv 발현이 VSV 에 의한 세포병변효과에 미치는 영향을 분석하고자 MTT assay 를 실시하였다. 0.1 또는 1 의 MOI 로 감염시켜 24, 36, 48 그리고 72 시간 동안 배양하여 세포 생존율 (cell viability)을 흡광도를 측정하여 산출하였다 (Fig. 9). MOI 가 0.1 일 때 결과는 24 시간에서 세포가 VSV 에 의한 세포 사멸이 거의 일어나지 않았기 때문에 항-바이러스 효과를
확인하기 어려웠으나 시간이 지남에 따라 VSV 에 의한 세포 사멸이 진행되면서 UJ 4-2 세포에서 50% 정도 높은 세포 생존율을 나타내었다. MOI 가 1 일 때 결과는 MOI 가 0.1 일 때보다 전반적으로 세포 생존율이 낮았지만 36 시간에서 HeLa 세포와 비교하여 UJ 4-2 세포에서 50% 정도 세포 생존율을 보였다. 이러한 결과들로부터 3D8 scFv 를 발현하는 UJ 4-2 세포주에서 항-바이러스 효과가 있음이 확인되었다.
HeLa UJ 4-2
58.9 % 14.2 %
HeLa UJ 4-2
Green : VSV Blue : nuclei
Fig. 7. Reduction of VSV-G protein level in 3D8 expressing UJ 4-2. 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 cells and HeLa control cells were infected with VSV (MOI = 0.1). After incubation for 15 h, the cells were fixed and permeabilized and then VSV was stained with goat FITC-conjugated anti-VSV G-tag. Finally VSV-G protein level in cells was analyzed with confocal microscopy (A) and flow cytometry (B).
A.
Fig. 8. Reduction of VSV particles in 3D8 scFv-expressing UJ 4-2. 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 cells and HeLa cells were infected with VSV (MOI = 0.1). After incubation for 5 h, 10 h, 15 h and 20 h, virus was harvested and titrated by plaque assay.
Time [h] 0 5 10 15 20 P F U /m l 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7 1e+8 1e+9 1e+10 1e+11 1e+12 1e+13 1e+14 1e+15 1e+16 HeLa UJ 4-2
Ajou 0 20 40 60 80 100 He La He La-UJ 4-2 C e ll v ia b il it y ( % ) Ajou 0 20 40 60 80 100 HeLa HeLa-UJ 4-2 C e ll v ia b il it y ( % )
Fig. 9. Resistance of 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 to VSV-induced cell death. 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 and HeLa cells were infected with VSV (MOI = 0.1 or 1). After incubation for 24 h, 36 h, 48 h and 72 h, 20 ㎕ of the MTT reagent (5 ㎎/㎖) was added and incubated for 4 h. Absorbance was measured with microplate reader at 595 nm and cell viability was calculated.
24 h 36 h 48 h 72 h
24 h 36 h 48 h 72 h
MTT assay
(MOI=0.1)E. UJ 4-2 세포세포세포세포에서에서에서에서 발현발현발현발현되되는되되는는는 3D8 scFv 의의의의 핵산가수분해핵산가수분해핵산가수분해핵산가수분해 활성활성활성 활성
확립된 3D8 발현 세포주 (UJ 4-2) 내에서 발현하는 3D8 scFv 의 핵산에 대한 가수분해 활성을 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 원리에 근거한 방법으로 수행하였다. 5’ 말단에 형광 (FAM)이, 3’ 말단에는 blackhole
quencher (BHQ)가 표지된 21 bp 길이의 DNA 기질을 사용하였으며, 5’ 말단에
FAM 으로만 표지된 21 bp 길이의 DNA 기질을 도입효율 (Transfection
efficiency)을 확인하기 위하여 사용하였다. 각 DNA 기질을 lipofectamine TM 으로 HeLa 세포 및 UJ 4-2 세포에 형질도입 (transfection) 한 후, 1 시간 및 2 시간째
형광을 측정하였다. FRET 의 원리에 의하면, 3D8 scFv 를 발현하지 않는
HeLa 세포에서는 DNA 기질이 분해되지 않아 quencher 에 의해 형광이
억제되는 반면, UJ 4-2 세포주에서는 DNA 기질이 분해되어 quencher 가 FAM 과 분리되어 형광을 나타내게 된다 (Fig. 10A). 핵산가수분해 활성에 의해 DNA 기질이 분해되어 형광을 나타내는 정도는 fluorometric imaging plate reader 로 측정하여 RFU (relative fluorescence unit) 값으로 산출하였다. 그 결과 Fig.
10B 에서처럼, HeLa 세포에 비해 UJ 4-2 세포에서 3 배정도 높은 RFU 값이
측정되었다. 따라서 UJ 4-2 세포내에서 발현하는 3D8 scFv 가 핵산에 대한 가수분해활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
F Q
HeLa
Oligonucleotide F Q 3D8 scFvUJ 4-2
F: 6-carboxyfluorescein Q: Blackhole quencher 0 100 200 300 400 500 600 700 1 2 HeLa + F HeLa + FQ UJ 4-2 + FQ Time [h] R F UFig. 10. DNA-hydrolyzing activity in UJ 4-2 cells expressing 3D8 scFv (A) Schematic representation of FRET-based nucleic-acid hydrolyzing assay. (B) 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 cells and HeLa control cells were transfected with 5’ FAM-labeled DNA (F) or 5’ FAM and 3’ quencher-labeled DNA (FQ) of 500 nM. After 1 h and 2 h at 37℃ fluorescence , intensity was measured with fluorometric imaging plate reader at 530 nm.
A.
F. UJ 4-2 세포에서세포에서세포에서세포에서 인터페론인터페론인터페론인터페론 수준분석수준분석수준분석수준분석
VSV 의 복제 또는 방출의 억제가 3D8 scFv 의 유입 또는 발현에 의한
바이러스 메커니즘에 관여하는 분자의 활성화에 의한 것인지 확인하기 위해 항-바이러스 메커니즘에 관여하는 대표적인 분자인 인터페론 베타 (interferon-β,
IFN-β) mRNA 의 발현양상을 분석하였다. HeLa 세포와 UJ 4-2 세포에 MOI 0.1 의 VSV 로 감염시킨 다음 각각 다른 시간 동안 배양하여 RT-PCR 을 통한 인터페론 베타 mRNA 의 발현을 분석하였다. 그 결과, 바이러스 감염에 의한 인터페론의 발현의 유도는 12 시간부터 시작되었으며 HeLa 세포와 UJ 4-2 세포에서 인터페론을 발현하는 정도는 비슷하거나 오히려 더 낮은 발현이 유도되었다 (Fig. 11). 따라서 3D8 scFv 의 유입 또는 발현하는 세포주에서의 항-바이러스 효과가 항-바이러스 메커니즘에 관여하는 분자가 활성화되어 나타나는 효과가 아님을 확인하였다.
Fig. 11. Comparison of induction of IFN-ß mRNA in UJ 4-2 and control HeLa cells upon VSV infection. 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 and control HeLa cells were infected with VSV (MOI = 0.1) for the indicated time. Reverse transcription PCR (RT-PCR) was performed to detect the induced mRNA of IFN-ß. C, negative control; No VSV infection.
•
ß-actin (200bp)C 4h 8h 12h 16h 20h 24h C 4h 8h 12h 16h 20h 24h
HeLa UJ 4-2
G. 3D8 scFv 의의의 세포독성의 세포독성세포독성세포독성
3D8 scFv 의 세포내 발현이 세포의 성장 및 독성에 미치는 영향을 confocal microscopy, 유세포 분석 (Flow cytometry), 생존율 분석 (MTT assay)을 통하여 HeLa 세포와 비교하여 확인하였다. 세포 내에서 3D8 scFv 와 GFP (green fluorescence protein)가 결합된 형태로 발현되도록 하는 플라스미드인 pEGFPN2-3D8 scFv 와 GFP 만을 발현하는 대조 플라스미드인 pEGFPN2 를 HeLa 세포에
일시적인 형질 도입을 하여 GFP 발현 정도를 확인하였다. 형질도입 72 시간 후,
3D8 scFv-GFP 를 발현하는 세포에서 GFP 만을 발현하는 세포와 대조적으로
세포사멸이 유도되었다 (Fig. 12). 세포사멸 정도를 정량화하기 위해 DNA 형광염료인 propidium iodide (PI)를 사용하여 유세포 분석기로 분석하였을 때
pEGFPN2 로 트랜스팩션 했을 때와 비교하여 pEGFPN2-3D8 scFv 를 트랜스팩션
했을 때 세포사멸이 확실히 증가함, 또한 3D8 scFv 의 발현율이 높을수록 세포사멸이 증가함을 관찰할 수 있었다 (Fig. 13). 세포주기 분석 (cell cycle
analysis)을 위해 PI 를 사용하였으며 유세포 분석을 통해 DNA 양을 측정하여
세포 성장기 (G0/G1 phase), DNA 합성기 (S phase), 세포 분열기 (G2/M phase)를 구별하였다. 그 결과, HeLa 세포에 비교하여 UJ 4-2 세포에서 17% 정도가 세포 성장기에서 감소한 반면 8% 정도가 DNA 합성기에서 증가하였다 (Fig. 14A). 또한 생존율 분석 (MTT assay)을 수행하여 세포 성장률 (growth rate)을 정량화한 결과
HeLa 세포에 비교하여 UJ 4-2 세포의 성장률이 1.2 배 정도 낮게 나타났다 (Fig. 14B). 따라서 3D8 scFv 의 발현이 숙주세포에도 세포성장지연과 같은 어느 정도
Normal HeLa pEGFPN2 pEGFPN2-3D8scFv After transfection, 24 h 48 h 72 h
Fig. 12. Cytotoxicity in HeLa cells transiently transfected with pEGFPN2-3D8 scFv or pEGFPN2. HeLa cells transfected with plasmid vector expressing GFP alone (pEGFPN2) and 3D8 scFv-fused GFP (pEGFPN2-3D8 scFv). After incubation for indicated time, the cells were fixed and analyzed with confocal microcopy.
Ajou No transfection pEGFP 2 µµµµg GFP P I 0.5 µµµµg 1 µµµµg 2 µµµµg GFP P I GFP P I GFP P I GFP P I pEGFP-3D8 scFv 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1 2 MTT ssay R e la ti v e c e ll v ia b il it y pEGFP pEGFP-3D8scFv 0.5 µµµµg 1 µµµµg 2 µµµµg
Fig. 13. Quantitative cytotoxicity of HeLa cells expressing 3D8 scFv. HeLa cells transfected with a vector expressing GFP alone (pEGFPN2) and 3D8 scFv-fused GFP (pEGFPN2-3D8 scFv) of the indicated concentrations. (A) After incubation for 24 h, the cells analyzed with propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. (B) After incubation for 24 h, 20 ㎕ of the MTT reagent (5 ㎎/㎖) was added and incubated for 4 h. Absorbance at 595 nm was measured with microplate reader.
A.
0 62.3% 22.5% 12.8% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 (X 100) 0 P4 PI-A (x 1,000) HeLa 0 PI-A (x 1,000) 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 (X 100) UJ 4-2 1 0 45.7% 30.8% 16.6% P4 Ajou 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 3 4 HeLa UJ 4-2 R e la ti v e c e ll g ro w th
Fig. 14. Retardation of growth rate in UJ 4-2 cells. (A) Cell cylcles by PI (propidium iodide) staining were analyzed in 3D8 scFv-expressing UJ 4-2 cells and control HeLa cells. P2; G0/G1, P3; S, P4; G2/M. (B) UJ 4-2 and control HeLa cells were incubated for indicated time. 20 ㎕ of the MTT reagent (5 ㎎/㎖) was added and incubated for 4 h. Absorbance at 595 nm was measured with microplate reader.
Time (day)
A.
.
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ
Ⅳ
고찰
고찰
고찰
고찰
본 연구에서는 3D8 scFv 항체가 염기서열에 관계없이 ss-, ds-DNA/RNA 을 가수분해하는 촉매활성에 근거하여 RNA 바이러스인 VSV 에 대한 항-바이러스 효과를 확인하였고, 이를 정성적 또는 정량적으로 분석하였다. VSV 의 복제 또는 방출이 3D8 scFv 가 유입 또는 발현되는 세포에서 저해되는 항-바이러스 활성과 핵산 가수분해 촉매 활성이 관찰되었다. 따라서 첫째, 3D8 scFv 의 핵산에 대한 촉매 활성에 의해 VSV 의 게놈이 분해됨으로써 복제가 억제되었거나 둘째, 3D8 scFv 의 발현으로 항-바이러스 메커니즘에 관여하는 분자를 활성화시킴으로써 바이러스 복제를 억제하는 것으로 추론된다. 본 연구에서 확립된 세포주 (UJ 4-2)에서 발현하는 3D8 scFv 가 핵산에 대한 촉매 활성을 가지고 있음을 FRET 원리를 이용한 실험에서 확인하였다 (Fig. 10B). 또한, 3D8 scFv 단백질이 전달된 세포 또는 3D8 scFv 를 지속적으로 발현하는 세포주에서 VSV 증식에 대한 항-바이러스 효과가 나타남을 다양한 방법으로 확인하였다. 세포 내부로 3D8 scFv 단백질을 전달시킨 HeLa 세포에서 VSV 감염에 의한 세포병변 효과가 나타나지 않았고 (Fig. 1), 면역형광 염색법으로 VSV-G 단백질을 검출하였을 때 3D8 scFv 단백질이 전달된 세포 (Fig. 2) 또는 3D8 scFv 를 지속적으로 발현하는 HeLa 세포주 (Fig. 7A)에서 대조 HeLa 세포에비하여 VSV-G 단백질 수준이 현저히 낮게 검출되었다. 플라크형성 시험에서도
UJ 4-2 세포주가 대조 HeLa 세포에 비하여 약 1,000 배정도 낮은 PFU/ml 값을
항-바이러스 활성이 보고된 exonuclease superfamily 에 속하는 ISG20 이 VSV 에 대하여 1 x 103정도의 낮은 PFU 값을 나타내었다 (Espert 등, 2003). 또한 ISG20 은 ss-RNA 만을 특이적으로 인식하기 때문에 EMCV, 인플루엔자 바이러스 (Espert 등, 2003) 및 HIV-1 (Espert 등, 2005)에 대하여 항-바이러스 활성을
나타내지만, DNA 바이러스인 아데노 바이러스 (adenovirus)에 대한 항-바이러스 활성이 나타나지 않은 한계가 있다. 반면, 3D8 scFv 은 기질 특이성 없이 ss-, ds-DNA/RNA 을 가수분해하는 촉매활성으로 ss-RNA 바이러스인 VSV 외에 더욱 다양한 게놈 바이러스에 대한 강력한 항-바이러스 효과를 기대할 수 있을 것이다. 그러나 3D8 scFv 가 갖는 기질 특이성 없이 핵산을 가수분해하는 촉매 활성으로 인하여 왜 표적세포의 사멸 없이 바이러스 게놈에만 영향을 끼쳐서 항-바이러스 효과를 나타내는지에 대한 의문이 제시되었다. 이러한 의문을 해결하기 위해 일시적인 형질 도입으로 3D8 scFv 를 발현시켜 나타날 수 있는 세포독성을 confocal microscopy 및 유세포 분석을 이용한 세포주기 및 세포성장속도를 관찰하였다. 그 결과 HeLa 세포와 비교해서 UJ 4-2 세포에서의 세포성장속도 지연이 관찰되었다 (Fig. 12-14) 이는 3D8 scFv 의 핵산가수분해 활성에 의한 숙주세포 핵산의 손상에 의한 것으로 생각된다. 세포주기 분석 결과
(Fig. 14A), HeLa 세포에 비교하여 UJ 4-2 세포에서 DNA 합성기 지연이
일어났는데, 이는 RNA 에 손상을 받았을 때 유도되는 현상으로 알려져 있다
(Bellacosa 와 Moss, 2003).
3D8 scFv 의 유입 또는 발현하는 세포에서 세포사멸이 유도되지 않았던
