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cDNA microarray Analysis Identifies Symptom-Associated Chemokine Genes in Behcet's Disease Mouse Model

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-- --국문요약국문요약국문요약-국문요약--

-베체트병

베체트병

베체트병

베체트병 마우스

마우스

마우스

마우스 모델에서

모델에서

모델에서

모델에서 cDNA

cDNA

cDNA

cDNA microarray

microarray를

microarray

microarray

를 이용한

이용한

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이용한

증상에

증상에

증상에

관련된

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관련된 Chemokine

Chemokine

Chemokine gene

Chemokine

gene

gene

gene에

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관한

관한

관한 연구

연구

연구

연구

베체트병은 만성 염증질환으로 재발성 구강궤양, 외음부궤양, 피부 및 안증상 등이 특징인 질병이다. 베체트병은 여러 증상들이 동시에 발병하거나 초기 피부 점막증상이 호전과 악화를 거듭하다 관절증상, 안증상, 신경계증상까지 발전할 수 있다. 특히 안증상은 대표적인 베체트병 주증상으로 실명이라는 심각한 후유 증을 초래할 수 있다. 이러한 심각한 안증상의 발현을 예측할 수 있는 방법으로, 본 연구에서는 피부점막증상과 안증상의 병변에서 나타나는 차이를 관찰하고자 하였다.

본 연구에서는 herpes simplex virus을 이용하여 만든 베체트병 마우스 모 델을 이용하였다. Japanese criteria 방법에 따라 주증상 1개와 부증상 1개를 가진 마우스를 베체트병 마우스로 분류하였고, 이 중 피부점막증상만을 보이는 군, 안증상을 보이는군, 무증상군을 대상으로 하였다. 각 증상군의 말초혈액 단핵 구(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 cDNA microarray을 실 시하여 무증상군-피부증상군 그룹과 피부증상군-안증상군 그룹에 대한 7천 400개의 유전자의 발현 양을 조사하였다. 그 중 염증관련 의미 있는 유전자들은 역전사-중합효소 증폭반응으로 다시 확인한 후 면역조직화학법과 Western Blot 및 FACS analysis을 통하여 의미 있는 단백질의 발현정도를 확인하였다.

(6)

안증상군 사이에서는 CCL28은 피부증상군에서 높게, CCR7은 안증상군에서 높 게 나타났다. CCR5은 피부증상군과 안증상군 거의 동일한 수준이였다. CCR5, CCR7, CCL28의 역전사 중합효소 증폭반응 결과 CCL28은 피부증상 군에서만 높게 나타났고, CCR5의 발현도 피부증상군과 안증상군 동일하게 발현 하지만 무증상군보다는 높게 발현되었고, CCR7의 발현은 무증상군에 비해 피부 증상군에서 낮게 발현되었고 안증상군은 무증상군과 비슷하게 발현이 되었다. 림프절에서 CCR7의 발현은 피부증상군에서 무증상군과 안증상군에 비해 낮 게 관찰되었고 안증상군은 무증상군과 비슷한 발현을 보였다. CCL19는 림프절 의 medullary sinus에 대부분 발현하였고 피부증상군에서 가장 낮게 발현을 하 였다. CCL21은 보통 림프절의 germinal center 부분이나 혈관에서 관찰되었지 만 각 증상들 간에 별다른 차이는 보이지 않았다. 피부조직에서 CCL28의 발현은 모든 군에서 특이적으로 피지선부분과 각질층 에 존재하는 것이 발견되었다. 특이하게 피부증상의 염증부위 주변의 피지선과 피부상피층에서의 CCL28은 정상보다 현저하게 낮게 관찰되었다. CCL28의 수 용체인 CCL10은 무증상군보다 염증증상이 있는 피부조직에서 높은 발현을 가졌 다. PBMC에서 CCL28의 또 다른 수용체인 CCR3는 FACS와 RT-PCR의 결과 무증상군보다 안증상군에서 높았으며, 피부증상군은 안증상군에 비해 낮았다. 이상의 결과로, CCL28, CCR7과 CCR3은 안증상 발현에 중요한 역할을 하는 요인이 될 것으로 추측된다.

핵심되는 말: 베체트병, Chemokine, cDNA microarray, CCR5, CCR7, CCL28, CCR3, CCL21, CCL19.

(7)

차 례

국문 요약 ···ⅰ 차 례 ···ⅲ 그림 차례 ···ⅴ 표 차례 ···ⅶ I. 서론 ···1 II. 재료 및 방법 ···3 A. 베체트병 마우스 모델 ···3 B. 실험군 분류 ···3 C. RNA 분리 ···3 D. cDNA microarray ···4

F. Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) ···5 G. 림프절 분리, 단백질 추출 및 western blot ···6 H. 면역조직화학 염색 ···7 I. FACS analysis ···8 III. 결과 ···10 A. 마우스에서의 베체트병 증상 관찰 ···11 B. cDNA microarray 결과 ···13 C. PBMC에서 CCR5, CCR7, CCL28의 RT-PCR 결과 ···24 D. 림프절의 CCR7 발현과 그 리간드인

(8)

E. 피부증상을 보인 피부조직에서의 CCL28과 CCR10의 발현 ···30 F. PBMC에서 CCR3의 발현양상 ···34 IV. 고찰 ···37 V. 결론 ···41 참고 문헌 ···42 영문 초록 ···52

(9)

그림

그림

그림

그림 차례

차례

차례

차례

Fig. 1. Behcet's disease mouse model ···12

Fig. 2-1. Group list of cDNA microarray chip ···14

Fig. 2-2. MA Plot is scatter plot shown signal intensity

and range of R/G ···15

Fig. 3. Gene hybridization of CCR5, CCR7, and CCL28 in BD skin, BD inactive and BD eye

by cDNA microarray ···23

Fig. 4. RT-PCR analysis of CCR5, CCR7 and CCL28 mRNA

in PBMC of each BD symptomatic group ···25

Fig. 5. Western blot analysis of CCR7 expression in axillary

and iliac lymph node ···27

Fig. 6. Immunohistochemistry of CCL19 and CCL21

(10)

in sebaceous gland ···31

Fig. 8. Immunohistochemistry of CCL28 and their receptor

CCR10 expression in skin region ···32

Fig. 9. FACS analysis of PBMC stained with

anti-CCR3 antibody ···35

Fig. 10. RT-PCR analysis of CCR3 mRNA relative expression

(11)

표 차례

차례

차례

차례

Table 1. RT-PCR primers and sequences ···9

Table 2. Summary of Behcet's Disease symptoms in mice ···11

Table 3. cDNA microarray results of peripheral blood mononuclear cells comparing BD skin with

BD inactive mice. ···16

Table 4. cDNA microarray results of peripheral blood mononuclear cells comparing BD skin with

(12)

Ⅰ.

.

. 서

.

서 론

베체트병(Behcet's disease, BD)은 구강궤양, 외음부 궤양, 포도막염 등의 세 가지 징후가 특징적인 만성 염증성 질환이다. 이 병은 점막 및 피부, 눈, 심장, 혈관, 신장, 위장 그리고 신경이 침범될 수 있는 임상적 특징을 가진 매우 다양하고 복합적 인 질환으로 인식되어 있으며(Shimizu 등, 1979), 호전과 악화의 재발성 질병 양상 을 갖는 것이 특징이다. BD는 초기 피부점막증상으로 발병하여 단계적인 변화를 거 쳐 안증상까지 발전하거나 동시에 다발적으로 여러 증상들이 발생하기도 한다. BD 증상들 중 안증상은 실명이라는 큰 후유증을 가져오기도 한다(방 등, 1998; 이, 2001) . BD의 병인으로 Herpes simplex virus에 의한 유발설, 연쇄 상구균에 의 한 감염설, 자가 면역설, 환경오염물질에 의한 발병설, 유전학적 관련설 등 여러 가 지 병인들이 밝혀졌지만 아직 정확한 원인은 밝혀지지 않았다(Hools, 1978; Hori 등, 1979; Kaneko 등, 1989; Lehner , 1967; Lehner 등, 1982). 그 중 Sezer(Sezer, 1953), Evans(Evans 등, 1957), Noyan(Noyan 등, 1969)등은 환자 체액에서 특정한 바이러스를 분리해냈고, BD 환자의 peripheral blood mononuclear cell(PBMC)에서 herpes simplex virus(HSV) type 1 fragment들 이 in situ DNA-RNA hybridization PCR 등의 방법에 의해 존재하는 것이 밝혀졌 다(Eglin 등, 1982). HSV를 귀이개에 접종하는 방법으로 사람과 거의 비슷한 증상 들을 유발하는 베체트병 동물 모델을 만드는데도 성공하였다(Sohn 등, 1998).

Chemokine은 G protein coupled receptor들을 통해서 leukocyte들의 활성 과 migration 조절에 의해 innate와 acquired immunity에 아주 중요한 역할을 담당한다(Yoshie 등, 2001). 인간의 경우 45개 이상의 chemokine들과 18개의 상관되는 receptor들이 발견되었다(Yoshie 등, 2001). 아미노터미날의 배열에

(13)

의해 chemokine들은 4가지의 subfamily들로 나누어진다; CXC chemokines, CC chemokines, C chemokines 와, CX3C chemokines(Yoshie 등, 2001). Chemokine들은 염증반응에 중추적인 역할을 담당한다(Baggiolini 등, 1997). Chemokine receptor들은 다양한 세포에 발현하여 chemokine들과 반응하여 세포 의 이동, 귀소, 그리고 세포의 활성화나 분화에 연관되어 면역계 전반에 작용한다 (Baggiolini, 1998; Loetscher 등, 2000). 하나의 receptor에 하나 이상의 chemokine들이 반응하여 작용을 하게 된다(Murphy 등, 2000; Zlotnik 등, 2000).

BD의 IL-8(CXCL8)은 neutrophil들과 lymphocyte들을 활성화 시키며 recruitment의 작용을 하는 chemokine중에 하나이고, BD의 심각한정도를 측정하 는 marker가 되기도 한다(Mukaida 등, 1992; Zouboulis 등, 2000). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 은 monocyte, macrophage와 lymphocyte 들을 활성화 시키고 chemoattractant 한 작용을 유도하여 면역작용을 유발한다(Mukaida 등, 1992). 사람의 포도막염 증상에서 IL-8, interferon-inducible protein-10 (IP-10), MCP-1들은 정상적인 T cell을 활 성화 시키며 활성화된 T cell은 RANTES과 macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1)을 분비한다(Verma 등, 1997).

본 연구에서는 베체트병의 피부점막증상만 있는 경우와 안증상을 동반한 경우 chemokine을 중심으로 한 유전자 발현의 차이를 확인하기 위하여, BD 마우스 모델 을 각각 피부점막증상, 안증상과 무증상군으로 나누어 cDNA microarray로 비교한 후, 이를 RT-PCR, FACS analysis, western blot, immunohistochemistry등의 방법으로 확인 하였다.

(14)

Ⅱ.

.

.

. 재료

재료

재료 및

재료

및 방법

방법

방법

방법

A. A. A. A. 베체트병 베체트병 베체트병 베체트병 마우스 마우스 마우스 마우스 모델모델모델모델

기존 보고에 따라(Hirata 등, 1993; Sohn 등, 1998) 4~5주령 된 ICR 마우스 (Korean Laboratory Animal Research Center) 수컷의 귓볼을 바늘로 긁어 상처 를 입힌 후 herpes simplex virus-1(HSV-1)(F strain) 1×10 pfu/mL을 투입 하였다. virus는 10일의 간격을 두고 두 번 접종을 하고 접종 후 16주 동안 마우스 들을 관찰하였다. 마우스들은 일정한 공간에서 20 ℃~22 ℃를 유지하며, 오전 8시 부터 12시간 동안 빛을 주며 관찰하고 먹이와 물을 자유로이 접근 할 수 있도록 하 였다. B. B. B. B. 실험군 실험군 실험군 실험군 분류분류분류분류 일본 베체트병 연구회의 개정된 진단 기준에 따라(Mizushima 등, 1988), 피 부증상과 안증상, 구강궤양, 외음부궤양 중 피부증상을 포함하여 안증상을 제외 한 1개 이상의 타증상이 나타난 증상들을 피부증상군, 안증상을 포함하고 1개이 상의 타증상이 나타난 증상들을 안증상군으로 선별하였고 무증상군은 HSV 접종 후 16주 동안 증상없이 건강한 마우스를 선별하였다. C. C. C.

C. RNA RNA RNA RNA 분리분리분리분리

피부증상군과 안증상군 그리고 무증상군의 마우스를 희생하여 peripheral blood mononuclear cells(PBMC)를 분리하여 RBC lysis buffer (150 mM NH4Cl, 1

mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2-7.4, 36 ℃)를 처리해 5분간 상온에서

(15)

PBMC를 PBS로 washing 하였다. Trizol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용해서 10분 동안 실온에서 cell을 용해시킨 후 chloroform을 Trizol 부피의 1/5 넣고 실온에서 5분 동안 방치 후 12,000 g에서 15분 동안 4 ℃로 원심분리 하였다. RNA가 있는 상층액을 분리 한 다음 상층액과 같은 양의 isopropanol을 첨가 한 후 10분 동안 실온에 방치한 뒤 4 ℃ 15분 동안 12,000 g에서 원심분리 하였다. 상층 액을 버린 후 pellet을 조심스럽게 wash buffer(75 % ethanol ester, 25 % 의 0.1 % DEPC)로 washing 후 4 ℃, 5분 동안 12,000 g로 원심분리 한다. 상층액을 버 린 후 20 ㎕ DEPC-water로 pellet을 녹인 후 분광 광도계에서 260:280의 OD 값 을 측정하였다.

D. D. D.

D. cDNA cDNA cDNA cDNA microarraymicroarraymicroarraymicroarray

cy3 또는 cy5(AmershamPharmacia, Uppsala, Sweden)로 coupling 되어있는 aminoallyl-dUTP와 같이 total RNA을 reverse-transcription을 시켜준 fluorescently-labeled cDNA를 준비하였다. Twinchip mouse-7.4 K (Digital Genomics cDNA microarray, Seoul, Korea)의 microarray chip을 사용해 fluorescently-labeled cDNA을 42 ℃ 16시간동안 hybridization 시킨 후 washing하였다. Microarray chip은 7,744개 이상의 구분되는 sequence를 포함하 고 있는 것을 사용하였다. Washing 과정이 끝난 후 DNA chip들을 ScanArray Lite (PerkinElmer Life Sciences, Billerica, MA)을 사용해 스캔을 실시하였고, 스캔된 image들은 GenePix software (Axon Instruments, Union City, CA)로 유전자 발현양상을 분석하였다. 로그값으로 바꾼 유전자 발현 값들은 LOWESS regression (Yang 등, 2002)을 사용해 표준화 하였다.

(16)

들이 계산되고 robust scatter-plot smoother LOWESS을 사용하여 유전자 발현 의 표준화를 수행하였다. Scatter plot 분석은 Microsoft Excel 2000 (Microsoft, Redmond, WA)을 사용하였다.

F. F. F.

F. Reverse Reverse Reverse Reverse transcription transcription transcription polymerase transcription polymerase polymerase polymerase chain chain chain chain reaction(RT-PCR)reaction(RT-PCR)reaction(RT-PCR)reaction(RT-PCR)

cDNA 합성 및 증폭반응에는 SuperscriptTM first-strand synthesis system for RT-PCR(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하였다. Total RNA 1 ㎍과 DNase Ⅰ amplification grade(Invitrogen, Carlsbad, CA), DNase Ⅰ reaction buffer(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 각각 1 ㎕ 씩 혼합한 다음 15분 간 실온에 두었다. 25 mM EDTA 1 ㎕ 첨가 후 60~65 ℃에서 10분간 반응시 켰고 ice에 즉시 꽂아 식혔다. Oligo(dT) 와 10 mM dNTP mix를 각각 1 ㎕씩 첨가해 다시 65℃에서 5분간 반응시켰고, 즉시 ice에 꽂아 반응을 멈추었다. 최 종 반응액에 10× RT buffer 2 ㎕, 25 mM MgCl2 4 ㎕, 0.1 M DTT 2 ㎕,

RnaseOUT™ recombinant inhibitor 1 ㎕를 혼합한 다음 42 ℃에서 2분간 incubate 시켰다. SuperScript™ Ⅱ RT 1 ㎕를 첨가한 다음 42 ℃에서 50분간 반응시켰다. 70℃에서 15분간 두면서 반응을 정지시키고, RNase H 1 ㎕를 37 ℃ 20분간 반응시켜서 cDNA로 합성되지 않은 RNA를 제거하였다. PCR SuperMix(22 mM Tris-HCl, 55 mM KCl, 1.65 mM MgCl2, 220 μM dGTP, 220 μM dATP, 220 μM dTTP, 220 μM dCTP 22 U recombinant Taq DNA polymerase/ml)(Invitrogen, Carlsbad, CA), 200 nM primer solution과 0.8 ㎕ template DNA solution을 혼합한 다음 원심분리하 여 minicycler(MJ research, Watertown, MA)에서 반응시켰다(94 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분, 30회 증폭). 6X loading dye(BPB)와 증폭된 DNA

(17)

solution 5 ㎕를 혼합한 후 2 % agarose gel에서 전기영동(100 V, 20분)하였 고, ethidium bromide로 염색한 다음 UV로 관찰하였다. 본 실험에서 사용한 oligonucleotide primer는 table 1과 같다.

G. G. G.

G. 림프절 림프절 림프절 림프절 분리분리분리분리, , , , 단백질 단백질 추출 단백질 단백질 추출 추출 및 추출 및 및 및 western western western blotwestern blotblotblot

BD mice를 희생하여 axillary 림프절 와 iliac 림프절을 얻어 PBS로 washing 한 후 300 ㎕의 cell extract buffer(20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.0% Triton X-100, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 % glycerol, 10 mM β -glycerophosphate, protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany)에 넣은 후 분쇄기로 림프절 조직을 분쇄하였다. 초음파파쇄기로 4 ℃에 서 3분간 시행한 후, 4 ℃에서 20분간 방치 한 후에 30분 동안 2000 rpm으로 원심 분리를 시행하여 상층액을 얻었다. 분리된 단백질이 포함된 용액과 2×sample buffer (β2-mercaptoethanol이 포함 안 됨) 10 ㎕를 섞어 100 ℃에서 5분간 가열 시켰다. 가열 후, 10 % SDS gel에서 80 V로 10분간, 100 ℃에서 1~1시 간 30분간 전기영동 한 뒤, PVDF membrane (Millipore, Bedford, MA)에 300 ㎃로 2시간 동안 전기 이동한 후 PVDF membrane을 blocking solution 에 2시간 동안 blocking 한 후 anti-mouse CCR7 goat antibody (Abcam, Cambridgeshire, UK)를 1:2,000으로 희석하여 2시간 동안 반응 시켰다. anti-goat-IgG-HRP로 다시 1시간 동안 반응시킨 다음, ECL (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghumshire, UK)을 사용하여 형광반응 시킨 다음 X-ray film에 감광하였다. anti mouse β-actin antibody(Oncogene, San Diego, CA)는 control로 사용하였다.

(18)

H. H. H.

H. 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 면역조직화학 염색염색염색염색

조직을 파라핀에 고정하여 block을 만든 후 5 ㎛ 두께로 잘라 특수 코팅된 슬라 이드(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에 붙인 뒤 실온에서 overnight incubation 하였다. 절편이 있는 유리 슬라이드를 70 ℃ hot chamber에서 20분간 incubate한 다음 xylene으로 탈파라핀화 시켰다. 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0)에서 10분간 microwave하여 epitope retrieval 과정을 거친 후 20분간 실온에서 서서히 식혀주었다. 실온에서 내인성 과산화효소의 활성을 저지하기 위해 3 % H2O2 에 15분간 반응시킨 다음 protein blocking agent (Thermo Shandon,

Pittsburgh, PA)로 실온에서 30분간 block 시켰다. Primary antibody는 0.1 % Tween 20 in PBS에서 희석하여 1 ㎍/㎖ 농도로 만들어 조직에 첨가하였고 4 ℃에 서 overnight 하였다. Primary antibody로는 anti-mouse CCR7 goat polyclonal antibody(Abcam, Cambridgeshire, UK), CCR10 goat polyclonal antibody(Abcam, Cambridgeshire, UK), CCL19 goat polyclonal antibody(R&Dsystem, Minneapolis, MN), CCL21 goat polyclonal antibody(R&Dsystem, Minneapolis, MN), CCL28 goat polyclonal antibody (R&Dsystem, Minneapolis, MN)들을 사용하였고 biotinylated anti-goat secondary antibody(Zymed laboratories Inc., San Francisco, CA)를 사용하여 실온에서 20분 반응 시킨 후 streptavidin peroxidase(Zymed laboratories Inc., San Francisco, CA)를 첨가해 실온에서 15분간 반응시켰다. AEC (Zymed laboratories Inc., San Francisco, CA)로 적정시간 정색반응 시킨 후 Mayer's hematoxyilin(Zymed laboratories Inc., San Francisco, CA)으로 대조 염색하였 다. Mounting을 실시하여 커버그라스를 덮은 후에 광학현미경으로 관찰하였다. Negative control은 primary antibody대신 nonspecific goat IgG antibody를 넣

(19)

어 음성소견을 확인하였다.

I. I. I.

I. FACS FACS FACS FACS analysisanalysisanalysisanalysis

전술한 바와 같이 말초혈액에서 PBMC를 얻은 후 1×106/wall이 되게 분주하 였다. FITC labeled anti-CCR3 antibody (R&D system, Minneapolis, MN)를 사용하여 30분 동안 4 ℃에서 반응시켰다. 세포를 750 rpm 으로 5분 동안 2번 원 심분리하여 PBS로 washing 하였다. 세포에 1 % paraformaldehyde 500 ㎕를 넣 고 flow cytometer로 값을 측정하였다.

(20)

Table Table Table

Table 1. 1. 1. 1. RT-PCR primers and sequences

SEQUENCE

CCR3 Sense : 5'-GAA TGG CAT TCA ACA CAG ATG-3' Antisense : 5'-GCT TCA TCT TTC AGT CCA TGG-3'

CCR5 Sense : 5'-TTT GCC TAC CTC TCC CTA GAG CTG-3' Antisense : 5'-ATG CCG ATT TTC CCA GGA CC-3

CCR7 Sense : 5'-ACA GCG GCC TCC AGA AGA ACA GCG G-3' Antisense : 5'-TGA CGT CAT AGG CAA TGT TGA GCT G-3

CCL28 Sense : 5‘-CAT ACT TCC CAT GGC CTC C-3' Antisense : 5'-GAG AGG CTT CGT GCC TGT G-3'

β-ACTINSense : 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3' Antisense : 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'

(21)

Ⅲ.

.

. 결

.

결 과

A. A. A. A. 마우스에서의 마우스에서의 마우스에서의 마우스에서의 베체트병 베체트병 베체트병 베체트병 증상 증상 증상 관찰증상 관찰관찰관찰 ICR 마우스를 16주 동안 관찰하여 구강궤양, 외음부 궤양, 안증상, 피부증상들 을 선별하였다(Sohn 등, 1998). 피부증상군은 총 11 마리로 구강 궤양과 피부증 상을 보인 4마리와 외음부 궤양과 피부증상을 보인 7마리로 구성되었고, 안증상 군은 구강 궤양과 안증상을 동반한 1마리, 외음부 궤양과 안증상을 동반한 2마 리와 피부증상과 안증상을 동반한 3마리로 구성 되었다(Table 2). 각각의 유발 된 양상은 Fig. 1.과 같다. 무증상군은 HSV를 처리한 후 16주 동안 아무런 증상이 표출되지 않은 마우스를 사용하였다.

(22)

Table Table Table

Table 2. 2. 2. Summary 2. Summary Summary Summary of of of Behcet's of Behcet's Disease Behcet's Behcet's Disease Disease Disease symptoms symptoms symptoms in symptoms in in mice.in mice.mice.mice.

BD skin mice that were induced totaled 11, which 4 and 7 mice had complicated oral ulcer or genital ulcer respectively. BD eye mice that were induced totaled 6, which 3, 1 and 2 had complicated skin ulcer, oral ulcer, or genital ulcer respectively. (N/A; not applicable)

Symptom Group Number Manifestations

No symptom 8 N/A

Skin symptom 11 oral+skin 4 genital+skin 7

Eye symptom 6

oral+ocular 1 genital+ocular 2 skin+ocular 3

(23)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 1. 1. 1. 1. Behcet's Behcet's Behcet's Behcet's disease disease disease disease mouse mouse mouse mouse model. model. model. model. a: oral symptom, b: skin symptom, c: genital symptom, d: eye symptom.

d

a

b

(24)

B. B. B.

B. cDNA cDNA cDNA microarray cDNA microarray microarray microarray 결과결과결과결과

microarray chip은 총 7,744개의 유전자중 signal transduction 그룹 7.43%, cell cycle 그룹 2.58%, inflammation 그룹 0.34%, cell growth and maintenance 그룹 13.48%, cell death 그룹 1.38%, response to stress 그룹 1.34%, transcription 그룹 7.1%, immune response 그룹 1.75%, apoptosis 그 룹 1.35%, 기타 그룹 63.21%로 구성되었다(Fig. 2-1.). 첫 번째 microarray에서 피부증상군을 cy3, 무증상군을 cy5, 두 번째 microarray에서는 피부증상군을 cy3 안증상군을 cy5로 표지하였고, 신호 강도와 mean값의 분포는 Fig. 2-2.로 나타내 었다. 7,744개의 유전자들 중 table 3 와 4에서 나타낸 것과 같이 ±1이상을 선별한 뒤 그 중 염증 관련 유전자들을 선택하였다. cDNA microarray에서의 결과값은 CCL28이 피부증상군에서 무증상군과 3배, 안증상군과도 3배정도의 높은 발현이 일어났다. CCR5는 피부증상군을 중심으로 무증상군보다 2배정도의 발현양이 많았 으며, 피부증상군과 안증상군을 비교해 보았을때 서로 비슷한 level로 발현을 하고 있는 것을 알 수 있었다. 그러나 CCR7은 피부증상군과 안증상군을 비교해 보았을 때 안증상군에서 1.5배 발현이 많았으며, 피부증상군과 무증상군을 비교하였을때 피부증상군에서 무증상군보다 2.3배 발현이 감소하였다(Fig. 3.).

(25)

Etc. 64% Immune Response 2% Transcription 7% Apoptosis 1% Response to Stress 1% Cell Death 1% Cell Cycle 3%

Cell Grow th and Maintenance 14% Inflammation 0.3% Signal Transduction 7% Fig. Fig. Fig.

(26)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 2-2. 2-2. 2-2. 2-2. Signal Signal Signal Signal intensity intensity and intensity intensity and and and mean mean mean mean range range was range range was was was shown shown shown by shown by by scatter by scatter scatter scatter plot. plot. plot. plot. M=log2(R/G), A= {log2(RG) }/2, R=Cy5 signal - background, G=Cy3 signal - background. The plot is the result of a scaled block normalization. the M=0 line is marked with blue line, and the orange line means LOWESS line. A: The cDNA of BD skin and BD inactive were hybridized cy3 and cy5; BD skin= cy3, BD inactive=cy5. B: The cDNA of BD skin and BD eye were hybridized cy3 and cy5; BD skin= cy3, BD

A AA

(27)

Table Table Table

Table 3.3.3.3. cDNA cDNA cDNA cDNA microarray microarray microarray microarray results results results results of of peripheral of of peripheral peripheral peripheral blood blood blood blood mononuclear mononuclear mononuclear cells mononuclear cells cells cells comparing

comparing comparing

comparing BD BD BD BD skin skin skin skin with with BD with with BD BD BD inactive inactive inactive inactive mice. mice. mice. The data was sorted upper +1 and mice. lower -1 from cDNA microarray whole data. The dot line was selected from those results.

Serial Serial Serial Serial Number Number Number

Number MeanMeanMeanMean AAAA Gene SymbolGene Gene Gene SymbolSymbolSymbol Cluster Cluster Cluster Cluster IDIDIDID

Genbank Genbank Genbank Genbank Accession Accession Accession Accession Number Number Number Number 674 -1.072 8.827 Dstn Mm.28919 AI325494 690 -1.363 13.768 Gbp2 Mm.24038 AI326106 696 -1.055 9.994 Man1a Mm.117294 AA163718 710 -1.003 10.381 Prdx4 Mm.19127 AI326091 714 -1.018 11.767 Ap2a2 Mm.14555 AI324060 844 -1.774 7.418 Sdpr Mm.220962 AI413173 941 -1.297 7.394 Wbp5 Mm.512 AI414288 954 -1.215 7.291 Abt1 Mm.501 AI413142 955 -1.480 7.835 Sssca1 Mm.27657 AI413145 1050 -1.022 8.797 2310065K24Rik Mm.29348 AI429811 1163 1.289 7.034 Trex2 Mm.23312 AI427513 1170 1.550 7.917 BB219290 Mm.1850 AI426259 1190 1.050 8.938 Aibzip-pending Mm.23341 AI427739 1201 1.434 8.876 Tcte3 Mm.4116 AI427864 1220 1.072 8.036 4930545H06Rik Mm.23505 AI429069 1255 1.097 10.804 2400008B06Rik Mm.29148 AI426482 1283 1.355 8.867 AW261723 Mm.27038 AI427938 1335 -1.036 7.466 Prosc Mm.240854 AI448065 1346 -1.483 8.309 Sah Mm.9821 AI426961 1500 1.157 8.166 1700012L04Rik Mm.20221 AI448402 1695 1.267 8.587 0610012F22Rik Mm.32328 AI450580 1742 -1.070 7.603 H2-Aa Mm.175310 AI447993 1851 1.029 7.347 2310016N05Rik Mm.200383 AI448819 1911 1.076 7.561 Solt Mm.334 AI450766 2080 1.495 7.973 Ccr7 Mm.293 AI15853 2312 1.018 9.051 Mmp2 Mm.29564 AI464548 2419 -1.172 12.632 Anxa1 Mm.14860 AI893591 2891 -1.018 10.412 Ccr5 Mm.1430 AI85151

(28)

Cy3=BD skin, Cy5=BD inactive으로 표지하였고, Mean값은 LOWESS Serial Serial Serial Serial Number Number Number

Number MeanMeanMeanMean AAAA Gene SymbolGene Gene Gene SymbolSymbolSymbol Cluster Cluster Cluster Cluster IDIDIDID

Genbank Genbank Genbank Genbank Accession Accession Accession Accession Number Number Number Number 2977 1.151 8.152 Swam2-pending Mm.6433 AA589457 3270 -1.013 8.239 Igtp Mm.858 AW228181 3271 -1.056 11.221 Gbp3 Mm.1909 AW228655 3273 -1.191 8.248 Adprt1 Mm.197727 AW228690 3401 -1.233 12.521 Slc7a10 Mm.35567 AI837439 3583 -1.090 7.704 Nr2f2 Mm.16519 AI837596 3595 -1.065 7.373 Pus1 Mm.23653 AI839083 3751 1.049 8.399 Col3a1 Mm.147387 AI842703 4369 1.100 9.540 A930040G15Rik Mm.31367 AI852189 4371 1.026 8.095 2210016L21Rik Mm.455 AI852223 4550 -1.189 10.184 Atf5 Mm.1566 AI851042 4753 -1.052 7.415 0610009D07Rik Mm.29712 AI604949 4842 -1.104 7.721 5730502D15Rik Mm.26214 AI481706 4844 -1.090 8.458 BC006874 Mm.27186 AI481748 4945 1.103 7.462 E430025L02Rik Mm.33498 AI505719 4996 1.963 7.620 2310040G17Rik Mm.70462 AI506584 5227 1.233 7.417 AI195023 Mm.25557 AI266975 5235 -1.018 8.380 2410006N06Rik Mm.22985 AI527208 5283 -1.329 7.691 Atp6v0a4 Mm.173377 AW260259 5284 1.130 7.240 Uxs1 Mm.12790 AW260323 5470 -1.454 8.291 Psma5 Mm.2287 AI838676 5511 1.167 6.663 Ppfibp1 Mm.103382 AI841805 5512 -1.077 7.776 Lce-pending Mm.26171 AI839004 5514 -1.065 7.672 0610042A05Rik Mm.24365 AI839496 5584 -1.136 7.785 D130023A07Rik Mm.102305 AI837717 702643377 -1.534 9.982 Ccl28 Mm.143745 AA762401 702644041 -1.442 12.409 Ltf Mm.7612 AA763033 702647461 -1.560 9.951 5031404N19 Mm.246424 AA874245 702649308 -2.258 12.057 Saa3 Mm.14277 AA881525 702651448 -1.357 7.558 Rbm5 Mm.46706 AA674506 702655142 1.009 7.928 Chrnd Mm.2811 AA691939 702656220 -1.026 9.103 Gng10 Mm.41780 AI158565 702661172 -1.520 7.117 3830408P04Rik Mm.181536 AA590700 702661284 -1.363 13.441 Gbp2 Mm.24038 AI180927

(29)

(f=0.2)를 이용하여 표준화한 결과로 log2(Cy5/Cy3)로 계산 되었다. A 는

{log2(RXG)}/2의 식으로 계산되었며, 점들이 갖는 신호강도의 정도를 나타내는 값이다. Gene symbol은 클론에 해당하는 유전자 이름이다. Cluster ID는 클론에 해당하는 NCBI UniGene ID이다. Genbank Accession Number는 클론에 해당하 는 NCBI GenBank accession number이다.

(30)

Table Table Table

Table 4. 4. 4. 4. cDNA cDNA cDNA cDNA microarray microarray microarray microarray results results results results of of peripheral of of peripheral peripheral peripheral blood blood blood blood mononuclear mononuclear mononuclear cells mononuclear cells cells cells comparing

comparing comparing

comparing BD BD BD BD skin skin skin skin with with BD with with BD BD BD eye eye eye eye mice. mice. mice. mice. The data was sorted upper +1 and lower -1 from cDNA microarray whole data. The dot line was selected from those results.

Serial Serial Serial Serial Number Number Number

Number MeanMeanMeanMean AAAA Gene SymbolGene Gene Gene SymbolSymbolSymbol Cluster Cluster IDCluster Cluster IDIDID

Genbank Genbank Genbank Genbank Accession Accession Accession Accession Number NumberNumber Number 56 1.225 9.621 Ubtf Mm.2845 AI385694 67 -1.249 9.925 Dlx5 Mm.4873 AI385752 68 -1.836 13.841 Hbb-bh1 Mm.196718 AI385765 69 -1.780 9.305 Hoxb6 Mm.215 AI385768 70 -1.814 8.970 Idb4 Mm.28223 AI323287 79 -1.813 7.529 Fosl2 Mm.23704 AI323310 96 1.290 9.373 Ier3 Mm.25613 AI323680 107 1.023 11.157 Sui1-rs1 Mm.13886 AI323719 174 -1.001 11.651 Ifi47 Mm.24769 AA163154 265 1.414 6.979 Crygc Mm.30374 AI323924 414 1.021 8.118 Casq1 Mm.12829 AI326263 435 1.750 6.951 Arl6 Mm.7760 AI326814 452 -1.431 7.359 8430404F20Rik Mm.181833 AI326889 479 1.250 7.551 D13Wsu50e Mm.2895 AI326894 484 -1.074 8.170 Gtf3a Mm.29105 AI325454 527 1.131 9.150 5830400A04Rik Mm.20323 AI325912 607 1.405 7.034 Dab1 Mm.18527 AI894126 641 -1.023 8.297 Rps6ka4 Mm.20914 AI327004 690 -1.111 14.517 Gbp2 Mm.24038 AI326106 780 1.041 7.284 Slc4a8 Mm.34957 AI415109 782 1.214 7.413 3110041P15Rik Mm.27149 AI414982 802 1.102 7.241 Pkia Mm.3193 AI415001 803 1.433 7.328 Fbxo17 Mm.88535 AI415003 822 1.177 7.565 1810027I20Rik Mm.38806 AI415308 1036 -1.144 7.882 Fga Mm.88793 AI429662 1088 1.160 7.629 Hmgn1 Mm.2756 AI426113 1505 -1.378 12.781 Prnd Mm.180750 AI428337 1507 -1.181 10.135 AI429460 Mm.77133 AI429460 1623 -1.126 11.320 Stat1 Mm.8249 AI449540

(31)

Serial Serial Serial Serial Number Number Number

Number MeanMeanMeanMean AAAA Gene SymbolGene Gene Gene SymbolSymbolSymbol Cluster Cluster IDCluster Cluster IDIDID

Genbank Genbank Genbank Genbank Accession Accession Accession Accession Number NumberNumber Number 1639 -1.119 8.398 9930021O16 Mm.29894 AI448438 1662 1.056 7.690 MGC7434 Mm.3584 AI452005 1688 1.226 7.376 MGC27648 Mm.28332 AI662264 1789 -1.103 8.444 Cd72 Mm.88200 AI449716 1951 1.038 9.920 Cd79b Mm.2987 AI449164 1998 -1.053 7.894 Plxnb3 Mm.212888 AI451018 2080 1.229 10.006 Ccr7 Mm.2932 AI450232 2308 -1.188 7.281 LOC213575 Mm.32785 AI464530 2349 1.069 11.483 BC034753 Mm.24268 AI661037 2355 1.330 9.374 Sh2d1a Mm.20880 AI661046 2363 1.018 11.261 Apg12l Mm.9852 AI662229 2430 -1.207 9.845 Cyp2d9 Mm.104363 AI326928 2494 2.140 6.915 Sod3 Mm.2407 AI464152 2579 1.188 7.174 Mrps24 Mm.7328 AI482512 3003 1.042 9.372 Sms Mm.18652 AI605277 3053 1.131 13.263 C1qa Mm.370 AI255395 3055 1.045 11.695 Apom Mm.2161 AI265704 3095 1.132 8.683 Srpk1 Mm.15252 AI648020 3119 -2.714 7.687 Serpina3k Mm.196242 AI931686 3130 1.432 7.727 D8Ertd91e Mm.5601 AI957146 3154 -1.077 7.796 Rnf25 Mm.86910 AW107698 3163 1.350 8.818 Dpp4 Mm.1151 AW261490 3201 1.725 7.751 Zrf2 Mm.2467 AW413517 3227 1.034 8.753 Tnfrsf18 Mm.3180 AW208767 3260 1.192 7.470 Hpn Mm.19182 AW215855 3271 -1.116 11.043 Gbp3 Mm.1909 AW228655 3287 1.177 14.670 Tgfb1i4 Mm.20927 AW259600 3301 1.198 13.296 Krt1-12 Mm.4201 AI835216 3345 1.027 15.134 Lamr1 Mm.4071 AI836492 3397 -1.039 9.963 Anxa3 Mm.7214 AI838487 3468 1.057 7.733 Col1a2 Mm.4482 AI841886 3833 1.293 7.424 Pex2 Mm.151332 AI846555 3986 1.565 10.547 Npy Mm.154796 AI848386 4115 -1.117 7.683 Hspa8 Mm.197551 AI848940 4132 1.157 7.121 Nagk Mm.29772 AI844239

(32)

Serial Serial Serial Serial Number Number Number

Number MeanMeanMeanMean AAAA Gene SymbolGene Gene Gene SymbolSymbolSymbol Cluster Cluster IDCluster Cluster IDIDID

Genbank Genbank Genbank Genbank Accession Accession Accession Accession Number NumberNumber Number 4165 1.214 13.757 Igh-6 Mm.28362 AI845127 4220 1.161 7.163 1300007B12Rik Mm.18230 AI850348 4259 1.003 13.833 Rpl12 Mm.70127 AI851649 4365 -1.076 8.921 Pbef-pending Mm.28830 AI852144 4371 1.920 7.188 2210016L21Rik Mm.455 AI852223 4570 -1.195 6.922 Txnrd1 Mm.44552 AI854159 4688 2.295 6.997 4432416O06Rik Mm.34682 AI462546 4694 1.027 11.845 Nkg7 Mm.34613 AI467023 4713 1.024 8.137 Imp4a-pending Mm.27546 AI467390 4805 1.265 7.292 AI317395 Mm.26536 AI482555 4823 1.178 7.793 1200011C15Rik Mm.23710 AI481433 4971 1.948 6.798 Robo4 Mm.27782 AI504730 5020 1.041 9.041 4930471K13Rik Mm.40802 AI503051 5226 1.117 14.751 St7l Mm.46739 AI266951 5227 1.184 7.602 AI195023 Mm.25557 AI266975 5232 1.414 8.431 C730032N17Rik Mm.24030 AI315661 5281 1.136 10.095 2310081H14Rik Mm.9550 AW260146 5283 1.691 8.273 Atp6v0a4 Mm.173377 AW260259 5346 1.201 7.858 5730463C12Rik Mm.27769 AW215464 5465 1.133 8.674 1810010A06Rik Mm.7884 AI838632 5467 1.372 8.193 1500016L11Rik Mm.28258 AI838663 5558 1.399 7.462 0610041L09Rik Mm.21501 AI837259 702639615 -1.136 7.321 2010004B12Rik Mm.35514 AA616180 702641544 -1.068 7.954 Chrna1 Mm.4583 AA596914 702642078 -1.000 7.022 3222401M22Rik Mm.40776 AI594442 702643377 -1.547 10.437 Ccl28 Mm.143745 AA762401 702644041 -1.789 13.040 Ltf Mm.7612 AA763033 702649398 1.110 8.240 Cd22 Mm.1708 AA880028 702651448 -1.187 7.854 Rbm5 Mm.46706 AA674506 702652040 -1.007 7.092 AI425994 Mm.27001 AI019803 702653961 -1.645 6.995 D7Ertd743e Mm.43212 AI594067 702655108 -1.033 7.466 Slit2 Mm.34584 AA691931 702655880 -1.976 7.598 Nfic Mm.5104 AI594339 702655985 -1.128 9.095 4930567K20Rik Mm.109314 AI036202 702657352 1.202 10.986 Daf1 Mm.101591 AI120685

(33)

Cy3=BD skin, Cy5= BD eye으로 표지하였고, Mean값은 LOWESS (f=0.2) 를 이용하여 표준화한 결과로 log2(Cy5/Cy3)로 계산 되었다. A 는

{log2(RXG)}/2의 식으로 계산되었며, 점들이 갖는 신호강도의 정도를 나타내는 값이다. Gene symbol은 클론에 해당하는 유전자 이름이다. Cluster ID는 클론에 해당하는 NCBI UniGene ID이다. Genbank Accession Number는 클론에 해당하 는 NCBI GenBank accession number이다. CCR5의 M 값은 -0.131 이며 A값은 10.972로 나타났다.

(34)

A B

Fig. Fig. Fig.

Fig. 3. 3. 3. 3. Gene Gene Gene Gene hybridization hybridization hybridization hybridization of of of CCR5, of CCR5, CCR5, CCR5, CCR7 CCR7 and CCR7 CCR7 and and and CCL28 CCL28 CCL28 CCL28 in in BD in in BD BD skin, BD skin, skin, BD skin, BD BD BD inactive

inactive inactive

inactive and and and and BD BD BD eye BD eye by eye eye by by by cDNA cDNA cDNA microarray. cDNA microarray. microarray. BD mice were sacrificed for microarray. RNA isolation and cDNA microarray. A is BD skin compared with BD inactive mice. BD skin was stained with Cy3, and BD inactive with Cy5. B is BD skin compared with BD eye. BD skin was stained with Cy3, and BD eye with Cy5.

(35)

C. C. C.

C. PBMCPBMCPBMCPBMC에서 에서 에서 CCR5, 에서 CCR5, CCR5, CCR5, CCR7, CCR7, CCL28CCR7, CCR7, CCL28CCL28CCL28의 의 의 의 RT-PCR RT-PCR RT-PCR RT-PCR 결과결과결과결과

cDNA microarray의 결과에 의해 차이를 보인 몇몇 chemokine과 그 수용체에 대해 RT-PCR로 실험하였다. CCL28의 발현은 피부증상군에서 발현이 나타났지 만 무증상군과 안증상군에선 발견이 되지 않았다. CCR5는 피부증상군과 안증상군 의 발현은 거의 비슷하지만 무증상군보다 피부증상군과 안증상군에서 현저하게 높 게 발현된 것을 볼 수 있었다. CCR7의 발현은 무증상군에 비해 피부증상군에서 발 현이 거의 나타나지 않았고, 안증상군은 무증상군과 비교해서 발현이 줄어든 것으로 나타났다(Fig. 4.).

(36)

BD inactive BD skin BD eye

CCL28

CCR5

CCR7

β

-Actin

BD inactive BD skin BD eye BD inactive BD skin BD eye

CCL28

CCR5

CCR7

β

-Actin

Fig. Fig. Fig.

Fig. 4. 4. 4. RT-PCR 4. RT-PCR RT-PCR analysis RT-PCR analysis analysis analysis of of of of CCR5, CCR5, CCR5, CCR5, CCR7 CCR7 and CCR7 CCR7 and and and CCL28 CCL28 CCL28 CCL28 mRNA mRNA in mRNA mRNA in in PBMC in PBMC PBMC of PBMC of of of each

each each

each BD BD BD BD symptomatic symptomatic symptomatic symptomatic group. group. group. group. The primer was described in Table 1. β -actin is a positive control.

(37)

D. D. D.

D. 림프절의 림프절의 림프절의 림프절의 CCR7 CCR7 CCR7 CCR7 발현과 발현과 발현과 발현과 그 그 그 리간드인 그 리간드인 CCL19리간드인 리간드인 CCL19CCL19와 CCL19와 와 CCL21와 CCL21의 CCL21CCL21의 의 의 발현발현발현발현

CCR7은 림프구들이 림프절로 귀환에 중요한 역할을 하므로, 림프절의 CCR7 발현을 western blot으로 알아보았다.(Fig. 5.) CCR7의 발현은 axillary와 iliac node에서 비슷하였는데 피부증상군이 무증상군과 안증상군보다 낮은 발현양을 띄었다. 안증상군의 발현양은 무증상군과 비슷한 발현을 보였다. CCR7의 리간드들인 CCL19와 CCL21의 발현양상은 면역조직화학염색을 통 해 확인하였다(n=4).(Fig. 6.) CCL19와 CCL21의 발현양상은 림프절내의 위치 에 따라 각기 다르게 발현하였다. CCL19는 medullary sinus에서 주로 발현을 하였고, 혈관내에서도 발현이 확인되었다. CCL21은 주로 germinal center의 혈 관부분이나, high endothelial venules(HEV)에서 강하게 발현되었다. 특히 CCL19의 발현은 무증상군, 피부증상군, 그리고 안증상군에서 다르게 발현하였 다. 피부증상군에서의 CCL19의 발현은 무증상군이나 안증상군에 비해 낮게 나 타났다. 이에 비해 CCL21의 발현은 증상에 따른 차이를 발견하지 못하였다.

(38)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 5. 5. 5. Western 5. Western Western Western blot blot analysis blot blot analysis analysis of analysis of of of CCR7 CCR7 expression CCR7 CCR7 expression expression expression in in in in axillary axillary axillary and axillary and and iliac and iliac iliac iliac lymph

lymph lymph

lymph node.node.node.node. Both axillary and iliac lymph nodes were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. All lymph nodes were homogenized and sonicated with lysis buffer. Whole cell lysates were separated on SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane. Membrane was stained with anti-CCR7 goat polyclonal antibody. β -actin is control. β β β

β-actin-actin-actin-actin CCR7 CCR7 CCR7 CCR7

BD inactive BD Skin BD eye BD inactive BD Skin BD eye

(39)

BD BD BD

BD InactiveInactiveInactiveInactive

BD BD BD BD SkinSkinSkinSkin

BD BD BD BD EyeEyeEyeEye

CCL19 CCL19 CCL19

(40)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 6. 6. 6. Immunohistochemistry 6. Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL19 CCL19 CCL19 CCL19 and and CCL21 and and CCL21 CCL21 CCL21 expression expression expression expression in in in in axillary axillary axillary axillary lymph

lymph lymph

lymph node. node. node. node. Axillary lymph nodes were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene then incubated with anti-CCL19 polyclonal antibody and anti-CCL21 polyclonal antibody. Original magnification X200. Scale bar 200 ㎛.

(41)

E. E. E. E. 피부증상을 피부증상을 피부증상을 피부증상을 보인 보인 보인 보인 피부조직에서의 피부조직에서의 피부조직에서의 피부조직에서의 CCL28CCL28과 CCL28CCL28과 과 과 CCR10CCR10CCR10CCR10의 의 의 의 발현발현발현발현 증상을 보인 피부조직에 대한 CCL28 면역조직화학염색을 실시한 결과 피지선과 각질층에서 CCL28이 발현 되었다. 그러나 각 증상별로 발현에 차이가 있는 것 으로 나타났다. CCL28은 무증상군의 피지선에서 강한 발현을 관찰할 수 있었 다. 하지만 피부증상군과 안증상군에서 궤양하단의 피지선의 경우 약한 강도로 발현된 CCL28이 관찰되었다(Fig. 7.). CCL28은 무증상군의 각질층을 포함하는 표피에서 넓게 관찰이 되었다, 하지만 피부증상군과 안증상군의 궤양부분과 그 주변 표피에서는 CCL28이 나타나지 않았다. CCL28의 수용체인 CCR10도 면역 조직화학염색에 의해 확인되었다. 피부증상군, 안증상군 그리고 무증상군의 조직 에서 그룹간 차이가 없이 피지선에서 발현하였고, 피부증상군과 안증상군에서는 무증상군과 비교하여 두꺼워진 피부상피에서 CCR10을 발현한 많은 수의 각질세 포들이 관찰되었다.(Fig. 8.).

(42)

A

A

A

A

B

B

B

B

C

C

C

C

D

D

D

D

Fig. Fig. Fig.

Fig. 7. 7. 7. 7. Immunohistochemistry Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL28 CCL28 expression CCL28 CCL28 expression expression expression in in in in sebaceous sebaceous sebaceous gland. sebaceous gland. gland. gland. Tissues were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene, then incubated with CCL28 polyclonal antibody. A: the sebaceous gland of BD inactive group, B: the sebaceous gland of BD skin group, C: the sebaceous gland of BD eye group, D: negative control. ( is the localization of sebaceous gland) Original magnification X400 and 125 ㎛.

(43)

-3 2 -BD Inactive BD Inactive BD InactiveBD Inactive BD Skin BD Skin BD Skin BD Skin BD Eye BD Eye BD Eye BD Eye C C L 2 8 C C L 2 8 C C L 2 8 C C L 2 8 C C R 1 0 C C R 1 0 C C R 1 0 C C R 1 0

(44)

Fig. Fig. Fig.

Fig. 8. 8. 8. Immunohistochemistry 8. Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL28 CCL28 and CCL28 CCL28 and and and their their their their receptor receptor receptor receptor CCR10 CCR10 CCR10 CCR10 expression

expression expression

expression in in in in skin skin skin skin region. region. region. region. Specimens were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene then incubated with CCL28 polyclonal, CCR10 polyclonal. Orignal manification of CCL28 and CCR10 was X200. Black scale bar: 300 ㎛.

(45)

F. F. F.

F. PBMCPBMCPBMCPBMC에서 에서 에서 CCR3에서 CCR3CCR3CCR3의 의 의 발현양상의 발현양상발현양상발현양상

CCL28의 또다른 receptor인 CCR3의 PBMC에서의 발현은 FACS analysis와 RT-PCR로 확인하였다. FACS analysis결과, CCR3의 PBMC에서의 발현은 무증상군에서 6.82%±0.6576, 피부증상군에서 6.08%±0.1768, 안증상군에서는 11.08%±1.2587 로 가장 높게 나타났다(Fig. 9.). RT-PCR 결과 무증상군에 비 해 피부증상군의 발현이 저하되었고 무증상군에 비해 안증상군의 발현이 증가되었 다. 특히 안증상군의 CCR3 발현은 피부증상군에 비해 발현이 현저히 증가된 것으 로 나타났다(Fig. 10.).

(46)

0 2 4 6 8 10 12 14 CCR3 Expression

BD Inactive BD Skin BD Eye

R e la ti v e C C R 3 e x p re s s io n 6.82% 6.08% 11.08%

*

**

*

**

**

**

**

Fig. Fig. Fig.

Fig. 9. 9. 9. FACS 9. FACS FACS analysis FACS analysis analysis analysis of of of PBMC of PBMC stained PBMC PBMC stained stained with stained with with with anti-CCR3 anti-CCR3 anti-CCR3 antibody.anti-CCR3 antibody.antibody.antibody. Expression was measured by flow cytometry on freshly isolated PBMC. Cells were stained with FITC-labeled monoclonal anti-CCR3 antibody. The thick line is stained with anti-CCR3 antibody, while the thin line is control. p-value; * p=0.0512, ** p=0.0308 (n=15).

(47)

BD inactive BD skin BD eye BD inactive BD skin BD eye

CCR3 CCR3 CCR3 CCR3 Β Β Β Β-actin

A

A

A

A

B

B

B

B

0 20 40 60 80 100

BD inactive BD Skin BD Eye

R a ti o % Fig. Fig. Fig.

Fig. 10. 10. 10. 10. RT-PCR RT-PCR RT-PCR analysis RT-PCR analysis analysis analysis of of of CCR3 of CCR3 mRNA CCR3 CCR3 mRNA mRNA mRNA relative relative relative expression relative expression in expression expression in in in PBMC. PBMC. PBMC. PBMC. Expression was measured by RT-PCR on freshly isolated PBMC. Primer was described in Table 1. A: CCR3 mRNA expression. B: the graph was calibrated angstrom unit (AU)-background (BG) by imagegauge4.0(Fuji Photo Film Co., Kanagawa, Japan) from RT-PCR gel result using gel doc(Bio-red laboratories, Hercules, CA). The ratio is comparative percent comparing β-actin expression(n=3).

β β β

(48)

Ⅳ.

.

.

. 고

고 찰

BD의 특별한 진행은 초기 피부점막증상에서 시작하여 피부점막증상을 동반한 관절증상, 신경증상, 그리고 안증상으로 발전하거나, 때에 따라서 이러한 증상들이 동시다발적으로 발병하기도 한다. 특히 안증상은 실명이라는 심각한 후유증을 남기 게 된다. 본 연구에서는 피부점막증상, 안증상 등이 각기 달리 나타나는데 따른 병인 의 차이를 알아보고자 BD마우스를 모델로 하여 각각의 증상을 바탕으로 무증상군 과 피부증상군 그리고 안증상군의 유전자에 발현 차이를 cDNA microarray를 사용 하여 7,744개의 유전자 발현의 차이를 확인하였다. 그 결과 염증관련 유전자들 중 ±1배 이상의 발현차이를 보인 CCR5와 CCR7 그리고 CCL28들이 의미가 있었다. 최근 연구에 의하면 CCR5는 BD의 구강과 외음부 궤양 조직에서 발현이 강하게 나타났고, 두 그룹간의 변화는 현저히 다르지 않았다고 보고되었다(Onder 등, 2003). 본 연구에서는, 기존의 보고와는 달리 피부증상군과 안증상군을 대상으로 실시하여 CCR5 발현을 보았다. CCR5는 두 증상들간의 발현 차이는 크지 않았으나 두 증상군 모두 무증상군보다 높은 발현 차이를 보인 것으로 나타났다. CCR5는 만 성염증질환인 Crohn 병이나 rheumatic disease에 발현이 된다고 보고 되고 있다 (Herfarth 등, 2001; Mack 등, 1999). 즉 CCR5는 염증질환의 표지로써 사용되 고 있으며(Frassanito 등, 1999), 활성화된 T cell에 발현하여 CCL5와 CXCL10 과 상호작용함으로써 세포의 이동에 중요한 역할을 담당한다(Stanford와 Issekutz, 1999). 따라서 CCR5는 BD의 PBMC에 발현하여 그 리간드들의 화학 적 이동반응에 의해 염증관련 세포들이 염증지역 주변으로 모이거나, 2차 면역 기관 으로 귀환에 중요한 역할을 할 것이라고 추측할 수 있다. CCR5의 발현이 피부증상 과 안증상에 특이하게 다르지 않으므로 BD 증상의 표지자 역할 밖에는 없을 것으로

(49)

생각한다.

CCR7은 naive T 세포에 발현되어 T 세포의 순환과 2차 면역기관으로의 귀환에 아주 중요한 역할을 하고 있으며, central memory T cell의 표지로써 작용을 하며 반면에 effector memory T cell일 경우에는 CCR7의 발현이 현저하게 떨어지고 있는 것으로 나타났다( Masopust 등, 2001; Reinhardt 등, 2001). 또한 CCR7이 림프절로 이동하는 T cell 또는 수상세포들에서 발현하여, CCL19와 CCL21과의 상호 작용에 의해 이동하며, 일단 림프절에서 활성화된 T cell은 CCR7의 발현이 없 어지며 활성화되거나 분화되어 혈관을 통해 염증부위로 이동하게 된다(Annunziato 등, 2001; Muller 등, 1999; Rossi와 Zlotnik, 1999). 본 실험에서, CCR7 발현은 피부증상군에서 무증상군보다 낮게 발현을 하였고, 안증상군은 무증상군과 비슷하 게 발현 하였다. 이것은 피부증상군에서는 MHC class에 의해 항원을 발현한 항원 지시세포들이 림프절로 이동하여 naive한 T cell들을 활성화 시키고 분화시킴에 따 른 CCR7의 발현 저하로 생각한다. 그러나 안증상군에서는 CCR7의 발현이 무증상 군보다는 낮았지만 피부증상군에 비해 높은 발현을 보였다. 림프절 조직에서 CCR7 의 발현양을 관찰하면 PBMC의 경향과 비슷하게 피부증상군에서 낮은 발현을 나타 냈고 안증상군은 무증상군과 비교했을 때 비슷한 발현양을 보였다. 이에 CCR7의 리간드들인 CCL19와 CCL21의 발현 양상을 림프절 조직에서 비교해 보았을때, CCL19의 발현양상이 각 그룹에 상이하게 나타난 것으로 관찰되었다. CCL19의 발 현은 피부증상군에서 무증상군과 안증상군보다 낮은 발현을 보였다. CCL21은 각 그룹에 비교 하였을때 상이한 차이는 발견하지 못하였다. 이에 피부증상군의 CCR7 의 발현양의 차이가 CCL19와 연관되어 있다고 추측할 수 있다. 특이한 점은 CCL19는 주로 medullary sinus 지역에 발현이 되어지고 있으며, CCL21은

(50)

들이 림프절 안에서 이동과 깊은 관련이 있을 것으로 생각된다.

CCL28은 최근에 발견된 chemokine으로써 mucosae-associated epithelial chemokine이라고도 불리워지며 CCR10과 CCR3의 리간드로 밝혀졌다(Reinhardt 등, 2001; Wang 등, 2000). CCL28의 전사는 다양한 조직에서 발현이 되고 있다. 특히 점막성 상피세포, 유선 그리고 침샘 등에서 발현이 되어 점막 면역에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌고(Pan 등, 2000; Wang 등, 2000), 특히 항-미생물의 활성을 띄고 몇몇의 박테리아와 미생물에 대해 직접적으로 제거 할 수 있는 능력이 있다고 보고되었다(Hieshima 등, 2003). 최근에 밝혀진 것으로는 CCL28과 CCL25가 작 용을 하여 장의 면역에 관련된 림프구들의 이동과, 플라즈마 세포 및 IgA Ab을 분 비하는 세포들의 mucosal addressin cell adhesion molcule-1과 intercellular adhesion molecule-1에 작용하는 4 integrin-dependent adhesion을 증가시켜 장의 extravasation에도 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다(Hieshima 등, 2004; Kunkel 등, 2003). 이번 실험에서, CCL28이 피부증상군의 PBMC에서 높게 발현 되며 피부조직의 피지선과 표피층에서 발현되는 것이 관찰되었다. CCL28이 PBMC 에서 발현되고 피지선과 표피층에서 관찰된 보고는 이것이 처음이다. PBMC에서의 CCL28 발현이 어떠한 역할을 하는지는 아직까지 밝혀지지 않고 있으며, PBMC에 서 나온 CCL28이 각종 염증세포들의 활성에 관여하거나 혈관내피세포에 어떠한 영 향을 주어 염증관련 세포들이 혈관의 extravasation에 도움을 줄 것이라고 생각된 다. 피부조직에서의 CCL28을 관찰한 결과, 피부궤양부위의 피지선에서의 발현은 무증상군의 피지선와 비교해 볼 때 현저하게 낮은 발현을 관찰하였다. 이는 피부증 상군과 안증상군과는 상관없이 염증지역에서 같은 현상이 일어났으며, 또한 각질층 에서 비슷한 현상이 일어났다. 즉 정상인 경우 CCL28은 피지선에 존재해 있다가, 피지의 분비와 함께 피부표면으로 분출되어 피부표면상피에서 항-미생물의 활성을

(51)

가져 면역작용을 담당하는데 중요한 역할을 한다고 생각된다. 그러나 피부증상군과 안증상군에서 피부조직의 CCL28 발현은 궤양부위에서 낮게 발현되었으며 표피조 직에서 관찰되지 않은 점으로 미루어 보아, CCL28의 발현의 저하가 궤양부위의 피 부표면상피조직 면역시스템과 어떤 연관이 있을것으로 추측할 수 있다. CCL28의 수용체인 CCR10은 무증상군에 비해 피부증상군과 안증상군의 피부염 증부위의 표피층에서 높은 발현이 나타났다. CCL28의 또 다른 수용체인 CCR3의 발현을 PBMC에서 확인한 결과, 안증상군에서 높은 발현이 일어났다. 보통 CCR3는 호산성백혈구, 호염기성백혈구, 비만세포, Th2 type의 T cell, 혈소판, 기관지 상피 세포에서 발현되며 CCL11, CCL24, CCL26, 그리고 CCL28의 수용체로 알려져 있 다(Garcia-Zepeda 등, 1996). 단 마우스 Th2 type의 T cell에서 CCR3은 발현 하지 않는다(Grimaldi JC 등, 1999). 많은 베체트병 연구에서 주로 Th1 type의 질병으로 잘 알려져 있으며 T cell들이 병의 호전 및 악화에 큰 역할을 하고 있 는 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과 눈증상의 PBMC에서 CCR3의 발현에 호 산성백혈구, 호염기성백혈구나 비만세포들이 작용하리라 추측된다.

(52)

Ⅴ.

.

.

. 결

결 론

베체트병 마우스 모델을 이용하여 피부점막증상, 안증상의 다른 발병 기전을 이해하기 위하여 cDNA microarray를 통하여 CCL28, CCR5, CCR7의 발현차 이를 확인하였다. 그 중 CCR7, CCL28과 그와 관련된 ligand 및 수용체들을 PBMC, 염증조직 및 lymph node에서 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.  CCR5는 피부증상군과 안증상군의 PBMC에서 비슷하게 발현하였고, 무증 상군보다는 높은 발현을 보였다. 따라서 CCR5는 베체트병의 증상 표지자 이 기는 하나 피부증상과 안증상을 구별하는데는 유용하지 않았다.  CCR7을 PBMC에서 무증상군과 안증상군보다 피부증상군에서 발현이 낮아 진다. 림프절에서도 피부증상군에서 낮게 발현되었다. 그 리간드인 CCL19 은 피부증상군에서 낮게 발현하였다. 따라서 피부증상군과 안증상군의 병인 의 차이를 CCR7 발현으로 설명할 수 있다.  CCL28이 피부조직의 피지선과 PBMC에서 발현하였다. PBMC에서 CCL28의 발현은 단지 피부증상군에서만 관찰되며 안증상군과 특이한 차이 를 보였다. CCL28의 수용체인 CCR10은 피부 염증부위에서 피부증상군과 안증상군에서 높은 발현을 하였다.  안증상군에서 PBMC에서의 CCL28의 또다른 수용체인 CCR3의 발현은 피 부증상군에 비해 높게 발현하였다. 이는 피부증상군과 안증상군에서 화학적 유인 인자(chemoattract)가 다름을 시사해 주는 것이라 생각한다. 이상의 결과로 발현의 차이를 보이는 chemokine과 수용체의 발현을 조절하여 증상의 차이를 나타낼 수 있는지 확인하여야 할 것이다.

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참 고

고 문

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(63)

-ABSTRACT-cDNA

cDNA

cDNA

cDNA microarray

microarray

microarray Analysis

microarray

Analysis

Analysis

Analysis Identifies

Identifies

Identifies

Identifies Symptom-Associated

Symptom-Associated

Symptom-Associated

Symptom-Associated

Chemokine

Chemokine

Chemokine

Chemokine Genes

Genes

Genes in

Genes

in

in Behcet's

in

Behcet's Disease

Behcet's

Behcet's

Disease

Disease

Disease Mouse

Mouse

Mouse Model

Mouse

Model

Model

Model

Hyun Chul Lim

Department of Medical Sciences The Graduate School, Ajou University

(Supervised by Associate Professor Seonghyang Sohn)

Behcet's disease(BD), a chronic inflammatory disease, is characterized by intraocular inflammation, oral ulcers, genital ulcers, skin lesions and additional accompanying changes. A developing aspect of BD is reached until eye symptoms are present from early mucocutaneous symptoms via arthritic and neurological symptoms, or systemic symptoms are present at the same time. BD eye symptom in particular represents a systemic results from a serious sequela. To understand these serious changes of symptoms, this study tried to observe differences in gene expression that correlated to BD mucocutaneous symptoms turning into BD eye symptoms.

We used the BD mouse model infected with herpes simplex virus composed of typical BD mucocutaneous symptomatic mice without ocular

수치

Table Table Table
Fig. Fig. Fig.
Fig. 2-1.  2-1.  2-1.  2-1. Group  Group  Group list  Group  list  list  list of  of cDNA  of  of  cDNA  cDNA  cDNA microarray  microarray  microarray  microarray chip
Fig. Fig. Fig.
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참조

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