BD BD
BD BD InactiveInactiveInactiveInactive
BD BD BD BD SkinSkinSkinSkin
BD BD BD BD EyeEyeEyeEye
CCL19 CCL19 CCL19
CCL19 CCL21CCL21CCL21CCL21
Fig.
Fig. Fig.
Fig. 6. 6. 6. Immunohistochemistry 6. Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL19 CCL19 CCL19 CCL19 and and and and CCL21 CCL21 CCL21 CCL21 expression expression expression expression in in in in axillary axillary axillary axillary lymph
lymph lymph
lymph node. node. node. node. Axillary lymph nodes were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene then incubated with anti-CCL19 polyclonal antibody and anti-CCL21 polyclonal antibody. Original magnification X200. Scale bar 200
㎛.
E.
E.
E.
E. 피부증상을 피부증상을 피부증상을 피부증상을 보인 보인 보인 보인 피부조직에서의 피부조직에서의 피부조직에서의 피부조직에서의 CCL28CCL28CCL28CCL28과 과 과 과 CCR10CCR10CCR10CCR10의 의 의 의 발현발현발현발현
증상을 보인 피부조직에 대한 CCL28 면역조직화학염색을 실시한 결과 피지선과 각질층에서 CCL28이 발현 되었다. 그러나 각 증상별로 발현에 차이가 있는 것 으로 나타났다. CCL28은 무증상군의 피지선에서 강한 발현을 관찰할 수 있었 다. 하지만 피부증상군과 안증상군에서 궤양하단의 피지선의 경우 약한 강도로 발현된 CCL28이 관찰되었다(Fig. 7.). CCL28은 무증상군의 각질층을 포함하는 표피에서 넓게 관찰이 되었다, 하지만 피부증상군과 안증상군의 궤양부분과 그 주변 표피에서는 CCL28이 나타나지 않았다. CCL28의 수용체인 CCR10도 면역 조직화학염색에 의해 확인되었다. 피부증상군, 안증상군 그리고 무증상군의 조직 에서 그룹간 차이가 없이 피지선에서 발현하였고, 피부증상군과 안증상군에서는 무증상군과 비교하여 두꺼워진 피부상피에서 CCR10을 발현한 많은 수의 각질세 포들이 관찰되었다.(Fig. 8.).
A A A
A B B B B
C C C
C D D D D
Fig.
Fig. Fig.
Fig. 7. 7. 7. 7. Immunohistochemistry Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL28 CCL28 CCL28 expression CCL28 expression expression expression in in in in sebaceous sebaceous sebaceous gland. sebaceous gland. gland. gland.
Tissues were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice.
Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene, then incubated with CCL28 polyclonal antibody. A: the sebaceous gland of BD inactive group, B: the sebaceous gland of BD skin group, C: the sebaceous gland of BD eye group, D: negative control. ( is the localization of sebaceous gland) Original magnification X400 and 125 ㎛.
-32
-BD Inactive BD Inactive BD InactiveBD Inactive BD Skin
BD Skin BD Skin BD Skin BD Eye
BD Eye BD Eye BD Eye
CCL28CCL28CCL28CCL28CCR10CCR10CCR10CCR10
Fig.
Fig. Fig.
Fig. 8. 8. 8. Immunohistochemistry 8. Immunohistochemistry Immunohistochemistry of Immunohistochemistry of of of CCL28 CCL28 CCL28 and CCL28 and and and their their their their receptor receptor receptor receptor CCR10 CCR10 CCR10 CCR10 expression
expression expression
expression in in in in skin skin skin skin region. region. region. region. Specimens were isolated from BD inactive, BD skin and BD eye mice. Specimens were fixed in 10% formalin and paraffin embedded by conventional techniques. Sections were deparaffinized in xylene then incubated with CCL28 polyclonal, CCR10 polyclonal. Orignal manification of CCL28 and CCR10 was X200. Black scale bar: 300 ㎛.
F.
F.
F.
F. PBMCPBMCPBMCPBMC에서 에서 에서 CCR3에서 CCR3CCR3CCR3의 의 의 발현양상의 발현양상발현양상발현양상
CCL28의 또다른 receptor인 CCR3의 PBMC에서의 발현은 FACS analysis와 RT-PCR로 확인하였다.
FACS analysis결과, CCR3의 PBMC에서의 발현은 무증상군에서 6.82%±0.6576, 피부증상군에서 6.08%±0.1768, 안증상군에서는 11.08%±1.2587 로 가장 높게 나타났다(Fig. 9.). RT-PCR 결과 무증상군에 비 해 피부증상군의 발현이 저하되었고 무증상군에 비해 안증상군의 발현이 증가되었 다. 특히 안증상군의 CCR3 발현은 피부증상군에 비해 발현이 현저히 증가된 것으 로 나타났다(Fig. 10.).
0 2 4 6 8 10 12 14
CCR3 Expression
BD Inactive BD Skin BD Eye
Relative CCR3 expression
6.82%
6.08% 11.08%
*
**
* ** ** ** **
Fig.
Fig. Fig.
Fig. 9. 9. 9. FACS 9. FACS FACS analysis FACS analysis analysis analysis of of of PBMC of PBMC PBMC PBMC stained stained stained with stained with with with anti-CCR3 anti-CCR3 anti-CCR3 antibody.anti-CCR3 antibody.antibody.antibody. Expression was measured by flow cytometry on freshly isolated PBMC. Cells were stained with FITC-labeled monoclonal anti-CCR3 antibody. The thick line is stained with anti-CCR3 antibody, while the thin line is control. p-value; * p=0.0512, ** p=0.0308 (n=15).
BD inactive BD skin BD eye calibrated angstrom unit (AU)-background (BG) by imagegauge4.0(Fuji Photo Film Co., Kanagawa, Japan) from RT-PCR gel result using gel doc(Bio-red laboratories, Hercules, CA). The ratio is comparative percent comparing β-actin expression(n=3).
ββ
ββ-Actin-Actin-Actin-Actin
Ⅳ
생각한다.
CCR7은 naive T 세포에 발현되어 T 세포의 순환과 2차 면역기관으로의 귀환에 아주 중요한 역할을 하고 있으며, central memory T cell의 표지로써 작용을 하며 반면에 effector memory T cell일 경우에는 CCR7의 발현이 현저하게 떨어지고 있는 것으로 나타났다( Masopust 등, 2001; Reinhardt 등, 2001). 또한 CCR7이 림프절로 이동하는 T cell 또는 수상세포들에서 발현하여, CCL19와 CCL21과의 상호 작용에 의해 이동하며, 일단 림프절에서 활성화된 T cell은 CCR7의 발현이 없 어지며 활성화되거나 분화되어 혈관을 통해 염증부위로 이동하게 된다(Annunziato 등, 2001; Muller 등, 1999; Rossi와 Zlotnik, 1999). 본 실험에서, CCR7 발현은 피부증상군에서 무증상군보다 낮게 발현을 하였고, 안증상군은 무증상군과 비슷하 게 발현 하였다. 이것은 피부증상군에서는 MHC class에 의해 항원을 발현한 항원 지시세포들이 림프절로 이동하여 naive한 T cell들을 활성화 시키고 분화시킴에 따 른 CCR7의 발현 저하로 생각한다. 그러나 안증상군에서는 CCR7의 발현이 무증상 군보다는 낮았지만 피부증상군에 비해 높은 발현을 보였다. 림프절 조직에서 CCR7 의 발현양을 관찰하면 PBMC의 경향과 비슷하게 피부증상군에서 낮은 발현을 나타 냈고 안증상군은 무증상군과 비교했을 때 비슷한 발현양을 보였다. 이에 CCR7의 리간드들인 CCL19와 CCL21의 발현 양상을 림프절 조직에서 비교해 보았을때, CCL19의 발현양상이 각 그룹에 상이하게 나타난 것으로 관찰되었다. CCL19의 발 현은 피부증상군에서 무증상군과 안증상군보다 낮은 발현을 보였다. CCL21은 각 그룹에 비교 하였을때 상이한 차이는 발견하지 못하였다. 이에 피부증상군의 CCR7 의 발현양의 차이가 CCL19와 연관되어 있다고 추측할 수 있다. 특이한 점은 CCL19는 주로 medullary sinus 지역에 발현이 되어지고 있으며, CCL21은
들이 림프절 안에서 이동과 깊은 관련이 있을 것으로 생각된다.
CCL28은 최근에 발견된 chemokine으로써 mucosae-associated epithelial chemokine이라고도 불리워지며 CCR10과 CCR3의 리간드로 밝혀졌다(Reinhardt 등, 2001; Wang 등, 2000). CCL28의 전사는 다양한 조직에서 발현이 되고 있다.
특히 점막성 상피세포, 유선 그리고 침샘 등에서 발현이 되어 점막 면역에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌고(Pan 등, 2000; Wang 등, 2000), 특히 항-미생물의 활성을 띄고 몇몇의 박테리아와 미생물에 대해 직접적으로 제거 할 수 있는 능력이 있다고 보고되었다(Hieshima 등, 2003). 최근에 밝혀진 것으로는 CCL28과 CCL25가 작 용을 하여 장의 면역에 관련된 림프구들의 이동과, 플라즈마 세포 및 IgA Ab을 분 비하는 세포들의 mucosal addressin cell adhesion molcule-1과 intercellular adhesion molecule-1에 작용하는 4 integrin-dependent adhesion을 증가시켜 장의 extravasation에도 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다(Hieshima 등, 2004;
Kunkel 등, 2003). 이번 실험에서, CCL28이 피부증상군의 PBMC에서 높게 발현 되며 피부조직의 피지선과 표피층에서 발현되는 것이 관찰되었다. CCL28이 PBMC 에서 발현되고 피지선과 표피층에서 관찰된 보고는 이것이 처음이다. PBMC에서의 CCL28 발현이 어떠한 역할을 하는지는 아직까지 밝혀지지 않고 있으며, PBMC에 서 나온 CCL28이 각종 염증세포들의 활성에 관여하거나 혈관내피세포에 어떠한 영 향을 주어 염증관련 세포들이 혈관의 extravasation에 도움을 줄 것이라고 생각된 다. 피부조직에서의 CCL28을 관찰한 결과, 피부궤양부위의 피지선에서의 발현은 무증상군의 피지선와 비교해 볼 때 현저하게 낮은 발현을 관찰하였다. 이는 피부증 상군과 안증상군과는 상관없이 염증지역에서 같은 현상이 일어났으며, 또한 각질층 에서 비슷한 현상이 일어났다. 즉 정상인 경우 CCL28은 피지선에 존재해 있다가, 피지의 분비와 함께 피부표면으로 분출되어 피부표면상피에서 항-미생물의 활성을
가져 면역작용을 담당하는데 중요한 역할을 한다고 생각된다. 그러나 피부증상군과 안증상군에서 피부조직의 CCL28 발현은 궤양부위에서 낮게 발현되었으며 표피조 직에서 관찰되지 않은 점으로 미루어 보아, CCL28의 발현의 저하가 궤양부위의 피 부표면상피조직 면역시스템과 어떤 연관이 있을것으로 추측할 수 있다.
CCL28의 수용체인 CCR10은 무증상군에 비해 피부증상군과 안증상군의 피부염 증부위의 표피층에서 높은 발현이 나타났다. CCL28의 또 다른 수용체인 CCR3의 발현을 PBMC에서 확인한 결과, 안증상군에서 높은 발현이 일어났다. 보통 CCR3는 호산성백혈구, 호염기성백혈구, 비만세포, Th2 type의 T cell, 혈소판, 기관지 상피 세포에서 발현되며 CCL11, CCL24, CCL26, 그리고 CCL28의 수용체로 알려져 있 다(Garcia-Zepeda 등, 1996). 단 마우스 Th2 type의 T cell에서 CCR3은 발현 하지 않는다(Grimaldi JC 등, 1999). 많은 베체트병 연구에서 주로 Th1 type의 질병으로 잘 알려져 있으며 T cell들이 병의 호전 및 악화에 큰 역할을 하고 있 는 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과 눈증상의 PBMC에서 CCR3의 발현에 호 산성백혈구, 호염기성백혈구나 비만세포들이 작용하리라 추측된다.
Ⅴ
Ⅴ Ⅴ
Ⅴ. . . . 결 결 결 결 론 론 론 론
베체트병 마우스 모델을 이용하여 피부점막증상, 안증상의 다른 발병 기전을 이해하기 위하여 cDNA microarray를 통하여 CCL28, CCR5, CCR7의 발현차 이를 확인하였다. 그 중 CCR7, CCL28과 그와 관련된 ligand 및 수용체들을 PBMC, 염증조직 및 lymph node에서 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
CCR5는 피부증상군과 안증상군의 PBMC에서 비슷하게 발현하였고, 무증 상군보다는 높은 발현을 보였다. 따라서 CCR5는 베체트병의 증상 표지자 이 기는 하나 피부증상과 안증상을 구별하는데는 유용하지 않았다.
CCR7을 PBMC에서 무증상군과 안증상군보다 피부증상군에서 발현이 낮아 진다. 림프절에서도 피부증상군에서 낮게 발현되었다. 그 리간드인 CCL19 은 피부증상군에서 낮게 발현하였다. 따라서 피부증상군과 안증상군의 병인 의 차이를 CCR7 발현으로 설명할 수 있다.
CCL28이 피부조직의 피지선과 PBMC에서 발현하였다. PBMC에서 CCL28의 발현은 단지 피부증상군에서만 관찰되며 안증상군과 특이한 차이 를 보였다. CCL28의 수용체인 CCR10은 피부 염증부위에서 피부증상군과 안증상군에서 높은 발현을 하였다.
안증상군에서 PBMC에서의 CCL28의 또다른 수용체인 CCR3의 발현은 피
안증상군에서 PBMC에서의 CCL28의 또다른 수용체인 CCR3의 발현은 피