Goat anti-mouse antibody 1:5000 Santa cruz Biotechnology, INC, U.S.A

7. Ras activation assay

Endogenous level 또는 IFITM1을 과발현한 NF1 세포 내의 활성화된 Ras 형태 인 GTP-Ras의 수준을 알아보기 위해 Ras activation assay kit(Upstate Biotech, NY)의 실험 방법을 이용하여 확인하였다. Ras activation assay는 Ras의 activation 형태인 GTP-Ras가 증가하면 Raf-1가 membrane으로 보충(recruiting)되어 GTP-Ras에 결합 된다는 성질을 이용, 여기에 anti-Raf-1 antibody를 반응시켜 활성화된 Ras의 발현 량을 확인하는 방법이다. 실험방법은 cell lysate로 부터 Ras-GTP를 분리하기 위하 여 affinity precipitation을 이용하였고. Cell lysate는 Raf-1 RBD fusion 단백질을 결합 한 agarose와 함께 incubation 하였다. Agarose bead는 원심분리하여 모은 후 lysis buffer로 washing 하였다. 최종적으로 sample buffer를 첨가하여 95℃에서 5분간 가 열 후 western blot analysis를 시행하였다.

8. Cell death assay

3가지 종류(normal skin, benign, malignant tissue)의 조직에서 배양한 세포의 apoptosis sensitivity를 측정하기 위하여 세포사를 유도하는 Actinomycin D(Lab Empire S.C., Poland) 50ng/㎖ 농도로 30시간 각각 처리 후 cleaved caspase 3를 통해 확인하였다.

9. Transfection

NF1 환자의 악성 세포에 비해 발현이 감소된 IFITM1을 악성표현형세포에 over-expression 시키기 위해 microporator를 사용하여 transfection (Microporator-mini™, Digital biotechnology, U.S.A.) 하였다.

16

-10. Confocal microscopy

IFITM1의 세포 내 위치(cellular localization) 및 mitochondria 형태를 관찰하기 위하여, pEYFP-N1과 cloning한 IFITM1을 NF1 malignant cell에 transfection하여 Poly-D-lysin(Sigma Aldrich, U.S.A.) 코팅한 cover slip에 Cell(4X10⁶)을 깐 후, 12-24시간 over-expression 시켰다. 공초점 현미경으로 관찰하기 위해, PBS로 배양액(culture media)을 완전히 제거, 37℃ CO² incubator에서 20uM DAPI(Molecular Probes™, U.S.A.)를 30분간 처리하여 핵을 염색한 후, 250nM MitoTracker(Molecular Probes™, U.S.A.)를 첨가한 후 20분간 처리 Mitochondria를 염색하여, PBS로 10분씩 3회 세 척하였다. 이후 4% paraformaldehyde(PBS에 용해)를 37℃에서 15분간 처리하여 세 포고정(fixation)을 하였고, 0.1M Glycin(PBS에 용해) 실온(Room Temperature)에서 3 분씩 3회, 0.1% Triton X-100(PBS에 용해) 실온에서 10분씩 3회 처리하여 permeabilization 한 후, PBS로 10분간 세척 후 Vectashield(Vector Laboratories Co., U.S.A) 또는 50% glycerol로 mounting하여 샘플을 완성하였다. 이 후 공초점 현미 경(Zeiss LSM510 confocal laser scanning microscope; CLSM, Germany)(Hotta et al.,2005) 을 사용하여 40x, 650x oil lens 조건으로 관찰하였다.

III. 결과 결과 결과 결과

A. 일차 일차 일차 일차배양세포에서의 배양세포에서의 배양세포에서의 IFITM1 의 배양세포에서의 의 의 의 발현양상 발현양상 발현양상 발현양상

선행연구에서, NF1 환자의 수술 조직에서 분리한 정상, 양성종양, 악성종양 조직을 이용한 differentially expressed gene(DEG) screening 방법을 통하여, 양성 및 악성 종양에서 발현량이 현저하게 감소된(down-regulation) IFITM1 유전자를 발굴 및 동정하였다(Fig. 7A). IFITM1 의 발현량을 세포 level 에서 비교하기 위하여, 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 일차 세포(fibroblast)를 배양하였다. 각각의 primary fibroblast 에서 추출한 total RNA 를 RT(reverse transcriptase)로 합성한 cDNA 를 주형으로 IFITM1 특이적 primer 를 사용하여, IFITM1 유전자를 PCR 로 증폭한 후 total RNA 발현량을 분석한 결과 정상세포에 비해 양성세포와 악성세포에서 발현량이 감소하였다(Fig. 7B). 이것을 단백질 수준에서 확인하고자 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 배양한 primary fibroblast 세포에서 단백질을 추출하여 IFITM1 특이적 항체를 사용하여 Western blot analysis 를 통해 단백질의 발현량을 확인하였다(Fig. 7C). RT-PCR 과 Western blot analysis 의 결과 정상세포에 비해 양성세포와 악성세포에서 IFITM1 의 발현량이 현저히 감소하였으며, 이 결과는 DEG screening analysis 의 결과와 일치하였다.

18

Fig. 7. Expression pattern of the identified IFITM1 genes on the NF1 . (A) DEG

*P<0.005, one-factor ANOVA). (B) RT-PCR analysis of IFITM1 in three types of NF1 cells with the quantitative results. RT-PCR was performed using the cDNA with the specific primers for IFITM1 (N=3, *P<0.005, one-factor ANOVA). (C) Western blot analysis of