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Functional study of the IFITM1 gene related to tumor progression of NF1

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이학

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신경섬유종증

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iv - 국문요약 -

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규명

신경섬유종증 제 1 형(Neurofibromatosis Type 1, NF1)은 말초신경을 따라 다기관에 다발적으로 종양을 형성하는 상염색체 우성 유전 질환으로서 3,000-3,500 명 중 1 명 꼴로 발생하는 비교적 높은 발병률을 가지고 있는 질환이다. NF1 은 NF1 유전자의 돌연변이에 의해 발병하며, 이 중 5-10%는 malignant peripheral nerve sheath tumors(MPNSTs)로 악성화되어 사망에 이르게 되는 경우가 많다. 현재까지 NF1 의 치료법으로는 방사선 요법, 외과적 수술 절제 등의 대증요법만이 유일한 치료법이나, 다기관에 다발적으로 발생하는 경우에는 적용 할 수 없다. 지금까지 종양형성과 악성화 기전을 밝히는 많은 연구가 진행되어 NF1 의 종양형성과 악성화 관여하는 몇몇 유전자가 보고되고 있으나, 아직 정확한 기전은 밝혀져 있지 않고 있다. 본 연구에서는, 선행연구에서 NF1의 종양형성과 악성화에 관여하는 유력한 유전자로 발굴·동정된 IFITM1(interferon induced transmembrane protein 1)의 NF1의 종양형성과 악성화에 관여하는 분자 기전 규명을 연구의 목표로 하였다. IFITM1은 9-27 또는 Leu13으로도 알려져 있으며, 인터페론(interferon)에 의해 발현이 유도되어 인터페론의 anti-proliferation을 조절하는데 중요한 역할을 하며 G1 phase 에서 cell growth를 arrest 한다고 보고 되었다. 또한 다양한 암에서 IFITM1의 발현량이 감소되며, immune response와 관련이 있다고 보고되어 있다.

(5)

우선, 선행연구의 결과를 세포 level에서 확인하기 위하여, 신경섬유종증 제1형 환자의 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 primary fibroblast 세포를 배양하였다. 배양된 primary 세포에서 IFITM1의 발현량을 RT-PCR과 Western blot

해석 방법으로 비교·분석한 결과, 정상세포에 비해 양성종양세포와

악성종양세포에서 IFITM1의 발현량이 현저히 감소되어 있음을 확인하였다. 다음으로, 악성세포에서 IFITM1이 RAS/MAPK 신호전달에 어떻게 관여하고 있는지 알기 위해 IFITM1을 악성세포에 과발현(overexpression) 시킨 후, Western

blot 해석으로 RAS/MAPK 신호전달 관련 단백질들의 발현양상을 분석하였다. 그

결과, GTP-RAS, total RAS, ERK, ERK의 발현량이 현저히 감소하였다. 또한 p-STAT3의 발현량도 감소 되었으나, 그 inhibitor 인 SOCS3의 발현량은 증가하였다.

IFITM1이 RAS/MAPK 신호전달 경로에 직접적인 관련이 있는지 확인하기 위해

p-ERK inhibitor인 PD98059를 악성종양세포에 처리한 결과, IFITM1의 발현량이 감소되었다. 한편, IFITM1의 과발현이 악성종양세포의 apoptosis(세포자멸사) 감수성에 변화를 일으키는지 확인한 결과, actinomycin D의 처리에 대한 악성종양세포의 apoptosis 감수성은 IFITM1이 과발현된 세포에서 현저히 상승하였다. 이러한 결과는 IFITM1이 RAS/MAPK 신호전달과 apoptosis 신호전달에 깊이 관련하는 기전으로 NF1의 종양발생 및 악성화에 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.

IFITM1의 세포 내 분포(cellular localization)를 공초점 현미경(confocal microscope)으로 확인한 결과 endoplasmic reticulum(ER)에 발현하고 있음을 확인하였다. 이 실험에서, IFITM1의 과발현 에 의해 미토콘드리아의 형태가

변화된다는 사실이 우연히 밝혀졌다. pEYFP-N1-IFITM1 construct를

(6)

vi 것을 관찰하였다. IFITM1이 미토콘드리아 융합(fusion)을 유도하는지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아가 매우 단편화(fragmentation)되어 있는 악성종양세포에 IFITM1을 과발현 시켜 미토콘드리아의 형태를 자세히 관찰하였다. 그 결과, IFITM1이 과발현된 악성종양세포에서는 정상세포에서와 같이 길어진 형태(elongation)의 미토콘드리아를 관찰하였다. IFITM1이 미토콘드리아의 융합(fusion) 및 분열(fission)에 직접적으로 관여하는지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 형태조절 단백질(mitochondrial shaping protein)의 발현량을 분석하였다. 악성종양세포에 IFITM1을 과발현 시킨 후, 미토콘드리아의 융합에 관여하는 MFN1, MFN2, OPA1 단백질과 미토콘드리아 분열에 관여하는 DRP1,

OPA1 단백질의 발현양상을 확인한 결과, 미토콘드리아의 분열에 관여하는 두

단백질인 DRP1과 FIS1의 발현이 현저히 감소되었음이 밝혀졌다.

결론적으로, 본 연구의 결과는 IFITM1 이 NF1 유래의 primary fibroblast 세포의

RAS/MAPK 및 apoptosis 신호전달과 미토콘드리아 형태조절에 깊이 관여하고 있음을 시사한다. 이러한 결과는 신경섬유종증 제 1 형의 종양발생 및 악성화 분자기전 규명에 크게 기여할 것으로 기대된다. 핵심어: 신경섬유종증 제 1 형, 종양형성, 악성화, IFITM1, RAS/MAPK 신호전달, 세포자멸사, 미토콘드리아 형태, 미토콘드리아 융합/절단

(7)

차 례

국문요약 ··· i 차례 ··· iv 그림차례 ··· v 표차례 ··· vi . Ⅰ 서론 ··· 1 . Ⅱ 재료 및 방법 ··· 9 1. Tissue sample ··· 9 2. Primary fibroblast 배양 ··· 10 3. 유전자 과발현을 위한 IFITM1 construct 구축 ··· 10

4. Total RNA 추출 및 cDNA 합성 ··· 12

5. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) ··· 12

6. Western blot analysis ··· 13

7. Ras activation assay ··· 15

8. Cell death assay ··· 15

9. Transfection ··· 15

10. Confocal microscopy ··· 16

. Ⅲ 결과 ··· 17

A. 일차배양세포에서의 IFITM1 의 발현양상 ··· 17

(8)

viii

C. IFITM1 과발현에 의한 RAS/MAPK 신호전달 경로의 단백질 발현양상

변화 ··· 21

D. ERK inhibitor의 처리에 의한 IFITM1 의 발현량 변화 ··· 24

E. IFITM1 과발현에 의한 apoptosis 감수성 변화 ··· 25

F. Interferon(IFN)의 처리에 의한 IFITM1 의 발현량 증가 ··· 27

G. IFITM1의 세포 내 분포(cellular localization) ··· 28

H. IFITM1 과발현에 의한 미토콘드리아 형태 변화 ··· 28 I. IFITM1 과발현에 의한 미토콘드리아 형태조절 단백질의 발현량 변화 ··· 32 . Ⅳ 고찰 ··· 34 . Ⅴ 결론 ··· 38 참고문헌 ··· 40 ABSTRACT ··· 47

(9)

그림

그림

그림

그림 차례

차례

차례

차례

Fig. 1. The various phenotypes of neurofibromatosis type 1. ··· 4

Fig. 2. Ras pathway and the function of neurofibromin. ··· 4

Fig. 3. A diagram of malignant degeneration pathway of NF1. ··· 6

Fig. 4. Transcription of IFITM1 is responsive to IFN-γ, as well as IFN-αβ. ··· 8

Fig. 5. NF1 tissue and cell type. ··· 9

Fig. 6. The sequence of the primers used for amplification of human IFITM1 ··· 11

Fig. 7. Expression pattern of the identified IFITM1 genes on the NF1. ··· 18

Fig. 8. Overexpression of IFITM1 in NF1 malignant cells. ··· 20

Fig. 9. Expression of RAS/MAPK signaling related proteins in NF1 malignant cells by overexpression of IFITM1. ··· 22

Fig. 10. Western blot analysis of p-STAT3 and SOCS3 in malignant cells by overexpression of IFITM1. ··· 23

Fig. 11. Effect of ERK1 inhibitor, PD98059, in NF1 cells. ··· 24

Fig. 12. Apoptosis susceptibility analysis of malignant cells by IFITM1 overexpression. ··· 26

Fig. 13. IFITM1 expression induction by treatment of IFN-α and IFN-γ. ··· 27

Fig. 14. Cellular localization of IFITM1 in the malignant cells. ··· 29

Fig. 15. Effect of IFITM1 overexpression on mitochondrial morphology. ··· 30

Fig. 16. Expression patterns of mitochondria shaping proteins in the malignant cells overexpression of IFITM1. ··· 33

(10)

x

표 차례

차례

차례

차례

Table 1. List of significantly differentially expressed genes (DEGs) in the NF1 tumor

tissues. ··· 7

Table 2. Primer pairs used to amplify gene sequences. ··· 13

(11)

I. 서론

서론

서론

서론

신경섬유종증 제 1 형(Neurofibromatosis Type 1, NF1)은 말초신경을 따라 다기관에 다발적으로 종양을 형성하는 상염색체 우성 유전질환으로서

3,000-3,500 명 중 1 명 꼴로 발생하는 비교적 높은 발병률을 가지고 있는 질환으로

환자의 약 30-50%는 유전이 아닌 자연발생적인 돌연변이(Huson 등, 1988; Ferner, 2007), 약 10%는 malignant peripheral nerve sheath tumors(MPNSTs)로 변형(Evans 등, 2002; Rasmussen 등, 2001; Zoller 등, 1997)되며, ‘신경섬유종증’(Cichowsk 와 Jacks, 2001; Gutmann, 2001) 또는 ‘Von Recklinghausens disease’라고 불리어 진다. 주된 증상은 신경이 있는 곳을 따라 발생하는 신경섬유종(neurofibroma)과 밀크 커피색 반점(café-au-lait spots), 홍채결절(Lish nodules), 시신경교종(iptic pathway glioma), 총상신경섬유종(plexiform neurofibroma) 등이 있다(Fig. 1)(Yohay, 2006; Bader JL, 1986).

NF1의 원인은 염색체 17q 11.2 에 위치하는 57 개의 exon 으로 구성된 350kb 의 genomic DNA, 11-13kb 정도의 mRNA 를 발현하는 NF1 유전자의 돌연변이로 인해 발병한다. NF1 은 약 320kDa 의 세포질에 존재하는 아미노산 1125-1537 부위에 Ras 신호를 negatively 하게 조절하는 GTPase-activating protein(GAP)-related

domain(GRD) 영역을 가지고 있는 neurofibromin 단백질을 암호화 하고

있다(Karen 와 Ryler, 2001; Wallace 등, 1990). Neurofibromin 단백질은 Ras 의 활성화된 형태인 Ras-GTP 을 불활성화 형태인 Ras-GDP 로 전환함으로써 Ras 의 활성을 조절한다(Karen 와 Typer, 2001). 종양유전자(oncogene) Ras 에 의해 coding 되는 Ras 단백질은 신경능선세포와 내피세포 모두에서 발현되며, 이러한

(12)

2

-signal 은 여러 경로의 downstream pathway 로 전달되어 세포의 증식, 분화, 사멸 등에 관여한다(Diworth 등, 2006). 그러나 NF1 유전자에 mutation 이 발생할 경우, neurofibromin 의 부족에 의한 Ras 의 활성을 조절하는 기능 손실로 인해 RAS 단백질이 과잉활성화되어 NF1 이 발병한다(Fig. 2). 현재까지 NF1 에 대한 근본적인 치료법이 없으며, 방사선 요법, 외과적 수술 절제 등의 대증요법만이 알려져 있지만, 근본적인 치료가 되지 않아 재발의 위험성 높다. 또한 이러한 대증요법도 다기관에 다발적으로 발생하는 경우에는 적용할 수 없다. 지금까지 NF1 의 종양형성과 악성화에 관여하는 몇몇 유전자가 보고되고 있으나, 아직 정확한 기전은 밝혀져 있지 않고 있다(Fig. 3)(Wiest 등, 2003; Holtkamp 등, 2004; Jeong 등 2008). 한편, NF1 에 대한 국내에서 진행되고 있는 연구는 환자의 DNA 로부터 NF1 유전자의 돌연변이 부위와 염기배열을 밝히는 것이 주를 이루고 있는 반면에 악성화 기전 규명 및 치료법 개발을 궁극적인 목표로 하는 연구는 거의 진행되고 있는 않은 실정이다. 선행연구에서, NF1 환자의 수술 조직에서 분리한 정상, 양성종양, 악성종양 조직을 이용하여, 정상조직과 종양조직에서 유전자의 발현량에 현저한 차이를 보이는 20 종의 유전자를 발굴 및 동정하였으며, 그 중에서 양성 및 악성 종양에서 발현량이 현저하게 감소된 IFITM1(interferon induced transmembrane

protein 1) 유전자를 NF1 의 종양형성과 악성화에 관여하는 가장 유력한 유전자로

선정하였다(Table 1). IFITM1 은 염색체 11p 15.5 에 위치하는 2 개의 exon 으로 구성된 3.956kb 의 genomic DNA, 125 개의 아미노산으로 구성된 17kDa 의 단백질을 cording 하는 세포표면 단백질의 한 종류이다. Interferon(IFN)-α, IFN-γ, IFN-β 그리고 X-ray 에 의해 전사되는 IFN-inducible transmembrane protein family 중의 하나로서, 9-27 또는 Leu13 으로 잘 알려져 있다(Friedman 등 1984; Kelly

(13)

등 1985). IFITM1 과 관련하여 보고된 신호전달 경로로는 IFN-γ 가 receptor 와 결합할 경우, Janus-activated kinases(JAK)과 관련된 receptor 인 JAK1 과 JAK2 를 phosphorylation(Stark 등, 1998)하고, 이것이 signal transducers and activators of transcription 1(STAT1)을 인산화(phosphorylation) 시킨 후, homo-dimmer 를 형성한다. Homo-dimmer STAT1 은 핵 내로 이동하여, IFN-γ-responsive elements 의 transcription 을 활성화 시킴으로 인해(Darnell 등, 1994), IFITM1 유전자의 5’-flanking region 내의 interferon-stimulated response element(ISRE)에서 IFITM1 을 발현(Reid 등, 1989)된다고 보고되어 있다(Fig. 4). IFITM1 의 기능으로는 IFN-γ 의 anti-proliferation 을 조절하는데 중요한 역할을 하며, G1 phase 에서 cell growth 를 arrest 한다고 보고되었다(G Yang 등, 2007). 또한 암(cancer)에서 IFITM1 의 발현량이 감소되며, immune response 와 관련이 있다고 보고되어 있다(G Yang 등, 2007; Tanaka 등, 2005; Abba 등, 2004; Huang 등, 2000).

본 연구에서는 NF1 의 종양조직에서 현저하게 발현량이 감소된 IFITM1 유전자가 NF1 의 종양형성과 악성화에 관여하는 분자 기전을 규명하기 위해, 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 배양한 primary 배양 세포를 이용하여 생화학적 및 세포생물학적 연구를 수행하였다. 본 연구를 통하여, NF1 의 종양형성 및 악성화 기전 규명과 더 나아가서 NF1 치료법 개발에 응용할 수 있는 기초 자료를 획득하는 것을 목표로 하였다.

(14)

4

(15)

Fig. 2. Ras pathway and the function of neurofibromin. (A) Structure of NF1 gene (B) Function of neurofibromin (C) Simplified version of the Ras pathway. GAPs (GAP, GTPase Activating Protein) such as neurofibromin inactivates Ras by catalyzing the hydrolysis of Ras-GTP to Ras-GDP. GEFs (GEF, Guanine nucleotide Exchange Factors) activate Ras by potentiating the exchange of GDP for GTP.

C.

RTK Receptor G protein RTK Receptor G protein RTK Receptor G protein RTK Receptor G protein activation activation

activation activation activation activation

activation activation activationactivationactivation activation Guanosin nucleotide Guanosin nucleotide Guanosin nucleotide Guanosin nucleotide Exchange Exchange Exchange Exchange factorsfactorsfactors factors

Receptor tyrosine kinase (RTK) Neuropeptide receptor GPCR Receptor tyrosine kinase (RTK) Neuropeptide receptor GPCR Receptor tyrosine kinase (RTK) Neuropeptide receptor GPCR Receptor tyrosine kinase (RTK) Neuropeptide receptor GPCR

Ras Ras Ras

Ras GTPGTPGTPGTP RasRas RasRas GDPGDPGDPGDP

ATP ATPATP

ATP cAMPcAMP cAMPcAMP

PKA PKA PKA PKA Gene expression Gene expression Gene expression Gene expression Rac Rac Rac Rac----1111 PI3 kinase PI3 kinase PI3 kinase

PI3 kinase RAFRAFRAFRAF----1111 Neurofibromin NeurofibrominNeurofibromin Neurofibromin cdc42 cdc42 cdc42

cdc42 RacRac-RacRac---1111 Akt/PKBAkt/PKB Akt/PKBAkt/PKB Rho A Rho ARho ARho A MEK 1/2MEK 1/2MEK 1/2MEK 1/2 MAPK/ERK1,2 MAPK/ERK1,2MAPK/ERK1,2 MAPK/ERK1,2 Gene expression Gene expression Gene expression Gene expression Differentiation of Differentiation of Differentiation of Differentiation of proliferation proliferation proliferation proliferation Cytoskeletal Cytoskeletal Cytoskeletal Cytoskeletal Remodeling Remodeling Remodeling Remodeling Cell survival Cell survival Cell survival Cell survival Cell migration Cell migration Cell migration Cell migration

(16)

6

-Fig. 3. A diagram of malignant degeneration pathway of NF1 (Dasgupta et al., 2003). NF1 loss in Schwann cell precursors during development cooperation with NF1+/- fibroblasts, perineural cells, and mast cells result in plexiform neurofibroma formation. The accumulation of other genetic change (e.g. p53, p16, or p27 loss) promotes transformation into MPNSTs. NF1 loss in Schwann cells in cooperation with NF1+/- cells results in dermal neurofibroma formation.

(17)

Table 1. List of significantly differentially expressed genes (DEGs) in the NF1 tumor tissues (Jeong et al., 2008).

Expression Pattern

DEG No.

Expression level GenBank Accession No. Gene Symbol Gene definition a b c Gradual Up-regulation in tumor

1 + ++ +++ NM_003746 DYNLL1 Dynein, light chain, LCS-type 1 12 - + ++ NM_003186 TAGLN Transgelin (SM22)

18 + ++ +++ NM_001845 COL4A1 Collagen, type IV, alpha 1 19 _ + ++ NM_000224 KRT18 Cytokeratin 18 Up-regulation in both tumors 6 + +++ +++ BC055559 Unknown - 15 - ++ ++ CA412187 Unknown - Up-regulation only in the malignant 8 - - ++ NM_003633 ENC1

Ectodermal-neural cortex (with BTB-like domain) (NRP/B) 9 - - ++ NM_018027 FRMD4A FERM domain containing 4A 13 ++ ++ +++ NM_000602 SERPINE1

Serpin peptidase inhibitor, clade E, member 1 (plasminogen activator inhibitor type 1, PAI-1) Up-regulation

only in the benign

5 + +++ + NM_001831 CLU Clusterin 20 - +++ ++ NM_019105 TNKB Tenascin XB Down- regulation in both tumor 2 +++ - - NM_003641 IFITM1

Interferon induced transmembrane protein 1 (9∙27)

4 ++ - - NM_003641 IFITM1

Interferon induced transmembrane Protein 1 (9∙27)

7 ++ + + BM_670838 Unknown - 14 ++ + + NM_001681 ATP2A2

ATPaswe, Ca2+ transporting , cardiac muscle, slow twitch 2 (SERCA2) 17 +++ ++ ++ NM_000050 ASS1 Argininosuccinate synthetase 1 Gradual down- regulation in tumor 5 +++ ++ + NM_001754 C1S Complememt component 1, s subcomponent 10 +++ ++ + NM_004753 DHR33 Dehydrogenase/reductase (SDR Family) member 3

11 +++ ++ + NM_002292 LAMB2 Laminin, beta 2 (laminin S) 16 ++ + - BC015434 Unknown -

(18)

8

-Fig. 4. Transcription of IFITM1 is responsive to IFN-γ, as well as IFN-αβ(Friedman et al., 1984; Kelly et al., 1985; Jan Vilcek et al., 2003). IFN-αβ (type I IFNs) and IFN-γ(type II IFN) bind to specific and distinct heterodimeric receptors. Binding of IFN-α or IFN-β to their receptor leads to the activation of two receptor-associated tyrosine kinases, Jak1 and Tyk2; this is followed by tyrosine phosphorylation of the STAT1 and STAT2 proteins. Phosphorylated STAT1 and STAT2 combine with IRF-9(IFN-regulatory factor 9) to form the trimeric ISGF-3 complex, which, upon translocation to the nucleus, binds to the cis element ISRE(IFN-stimulated response element), which is present in most IFN-α and IFN-β-responsive genes. In contrast, binding of IFN-γ to its receptor leads to tyrosine phosphorylation of the Jak1 and Jak2 tyrosine kinases, resulting in the phosphorylation of STAT1 but not STAT2. Phosphorylated STAT1 homodimerizes to form the GAF-AAF complex, which translocates to the nucleus and binds to the IFN-γ activation site(GAS) element present in most IFN-γ-inducible genes. Like IFN-γ, IFN-α and IFN-β signaling can also lead to the formation of the GAF-AAF complex and its binding to the GAS regulatory element. A ISREs in the 5’ flanking region of IFITM1 gene can confer both IFN-α and IFN-γ inducibility to IFITM1. The consensus GAS element and ISRE sequences are shown.

(19)

II. 재료

재료

재료

재료 및

및 방법

방법

방법

방법

1. Tissue sample

2004 년 12 월 아주대학교병원을 내원하여 신경섬유종 제 1 형으로 외과수술을 받은 24 세 남자 환자의 종양 적출물로부터 3 가지 종류의 조직을 획득하였으며, 각 조직은 포르말린 고정 후, 파라핀으로 포매하여 조직절편슬라이드를 제작, Hematoxylin 과 Eosin 염색하여 현미경(200x 에서 400x)으로 관찰하여, 정상, 양성, 악성조직임을 확인하였다(Fig. 5).

Fig. 5. NF1 tissue and cell type. (A) Gross photograph of the resected specimen from chest wall of the patient with NF1. : The regions of (1) normal skin, (2) neurofibromas and (3) neurofibrosarcomas are indicated. Light microscopy of the tissue sections. The slides of (B) normal skin tissue, (C) benign tumor tissue, (D) and malignant tumor tissue were stained with hematoxylin and eosin(H&E)(original magnification 200x to 400x).

1)

2)

3)

A.

(20)

10

-2. Primary fibroblast 배양

배양

배양

배양

환자의 정상(normal skin), 양성종양(benign tumor), 악성종양(malignant tumor) 조직으로부터 세포를 뽑아내는(explant) 방법을 이용하여 fibroblast 를 분리하여, 1% antibiotics(Gibco BRL, U.S.A.), 15% FBS(Hyclone Laboratories INC., U.S.A.)를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Hyclone Laboratories INC., U.S.A.)에 배양하였다.

3. 유전자

유전자

유전자

유전자 과발현을

과발현을

과발현을

과발현을 위한

위한

위한

위한 IFITM1 construct 구축

구축

구축

구축

선행연구에서 악성종양조직세포에서 발현량이 점차적으로 감소하는 IFITM1 세포내 과발현(overexpression)의 cloning 은 해당 유전자의 cDNA 에 사용하고자 하는 제한효소 부분을 포함한 primer 를 다음과 같이 제작하였다(Fig. 6).

pCDNA 3.1(-)(Invitrogen Co, U.S.A.), pEYFP-N1(Clontech Laboratories, INC, Japan)

vector 를 이용하여, NF1 에 돌연변이가 없는 cDNA 를 주형으로 하여 LA Taq polymerase(TAKARA, Japan)를 사용하여 95 20℃ 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 30 초를 30

cycle 반복하여 PCR 로 증폭하였다. 증폭된 산물은 1.5% agarose gel 에서

전기영동하여 EtBr 로 염색 후, transiluminator 로 확인하여 해당 유전자의 증폭된 부분을 잘라내고 gel extraction(Geneall biotechology, Korea)을 통해 DNA 를 추출한 후, 제한효소 XhoI 와 BamHI(Roche Diagnostics Corporation, Germany)을 사용하여 PCR 로 증폭된 IFITM1 과 vector 를 절단한 후, T4 ligase(Promega, U.S.A.)를 이용하여 16℃에서 12 시간 이상 Ligation 반응하였다. Ligation 산물은 E. coli DH5α strain competent cell 에 transformation 하고, 37℃에서 배양하였다. 배양 후 형성된 집락(colony)에 대하여 다음의 primer 를 이용하여 colony screening PCR 을 시행하였다.

(21)

Colony screening PCR 은 pCDNA3.1(-) vector 를 사용하여 cloning 한 IFITM1 은 3 step (98℃ 30초, 60 30℃ 초, 72 1℃ 분: 35Cycle 반복), pEYFP-N1 vector 를 사용하여 cloning한 IFITM1 은 2step(98℃ 10 초, 68℃ 1 분: 35cycle 반복)으로 각각 PCR 하여 증폭시킨 후, 확인하였다(Table 2). Colony screening PCR 을 통해 해당 유전자가 cloning 되었다고 확인이 된 집락(colony)는 antibiotics 를 포함한 LB broth 에 각각 증식 배양하여 plasmid mini kit(Anygen, U.S.A.)를 이용하여 plasmid DNA 를 추출한 뒤, cloning 에 사용한 두 제한효소로 절단하여 vector 와 insert 를 확인한 뒤 sequencing 하여 construct 를 구축하였다.

Fig. 6. The sequence of the primers used for amplification of human IFITM1. The two arrows indicate direction and position of the primers used for cloning of the IFITM1 constructs. Sequences of the priemers are: F, 5’-TTCTCGAGCTATGCACAAGGAGG AACATGAGGTGG-3’; R, 5’-CTGGATCCAGCAT TGCACAGTGGAGTGCA-3’.

(22)

12

-4. Total RNA 추출

추출

추출

추출 및

및 cDNA 합성

합성

합성

합성

Normal skin, benign, malignant tissue에서 배양한 세포에서 Trizol™ reagent(Invitrogen Co., U.S.A.)를 이용하여 RNA를 추출하고, 그 중 RNA 3㎍을 이용하여 DNase I(Invitrogen Co., U.S.A.) 3U을 처리하여 남아있는 gDNA를 제거한 후 cDNA를 합성하였고, 합성한 cDNA를 이용하여 PCR로 증폭하여 확인하였다. 사용한 primer는 RNA가 PCR의 주형이 될 수 없으며, intron 영역은 gDNA에만 존재하는 특성을 이용하여 제작하였다. PCR 결과 gDNA가 완전히 제거된 것으로 확인이 된 RNA를 TransScriptII Reverse Transcriptase PCR Kit(Qiagen, U.S.A.)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

5. RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

각 조직(normal skin, benign, malignant tissue)에서 배양한 세포에서 추출한 total

RNA에서 합성된 cDNA 합성 여부를 확인하기 위하여 GAPDH cDNA에서 두

개의 exon이 만나는 부분에 특이적인 primer set(Table. 2)를 제작하였고, cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이 primer를 이용하여 95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 30초에서 30 cycle 반복하여 PCR(MJ Research Co., U.S.A.)로 증폭된 산물을 1.2% agarose gel에 전기 영동하여 EtBr로 염색하여 transiluminator로 확인하였다.

(23)

Table 2. Primer pairs used to amplify gene sequences.

Gene Length (bp) Primer sequences (5’ → 3’, A. forward ; B. reverse)

pCDNA 3.1(-) 1.2kb

A GAT CAC CTC GGC ATG GAC GAG CTG TA B GTA TGG CTG ATT ATG ATC AGT TAT CTA GAT

GAPDH 420bp

A GCC TCA AGA TCA TCA GCA ATG CCT B AGA CCA CCT GGT GCT CAG TGT AG

IFITM1 300bp

A TTC TCG AGC TAT GCA CAA GGA GGA ACA TGA GGT GG B CTG GAT CCA GCA TTG CAC AGT GGA GTG CA

6. Western blot analysis

IFITM1의 과발현(overexpression)에 관한 단백질 발현량을 확인하기 위해, empty vector(control) 또는 IFITM1 을 transfection 한 세포를 50 ㎍/㎖ PMSF, Protease inhibitor cocktail 이 첨가된 RIPA buffer(Sigma Aldrich Co., U.S.A.)와 혼합하여 단백질을 추출한 뒤 여기서 얻어진 시료를 Lowry protein assay reagent kit(Bio-rad laboratories, U.S.A.) 방법으로 정량 분석하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis) loading buffer(5X)와 섞은 후, 95℃에서 10 분간 가열하였다. 이를 각각 20-80 ㎍씩 loading 한 후 8-15% SDS-PAGE gel 에 전기영동하여 분리하고, Polyvinylidene fluoride (PVDF, Immobilon-P membrane (0,45 ㎛), Millipore Corporation, U.S.A.)에 흡착 이동시켜, 다음과 같이 각각의 특이항체로 Western blot analysis 를 시행하여 분석하였다. 사용할 1 차 항체와 2 차 항체는 아래와 같은 조건에서 반응시킨 뒤(Table 3), WEST-ZOL Plus(Intron Biotechnology, Korea)를 처리하여 필름에 현상하였다.

(24)

14

-Table 3. Antibody information

Primary antibody Size

Dilution Conc.

Source Company rate buffer

IFITM1 17kDa 1:200 1% BSA Rabbit BOSTER, Wuhan, china

RasGAP 120kDa 1:200 1% Skim Rabbit Santa Cruz biotechnology, Inc., U.S.A.

GTP-Ras 20kDa 1:500 1% Skim Mouse Upstate Biotechnology, Lake Placid, N.Y.

Total-Ras 20kDa 1:500 1% Skim Rabbit Cell Signaling Technology, Inc., U.S.A.

ERK 43kDa 1:1000 1% BSA Rabbit Cell Signaling Technology, Inc., U.S.A.

Phosphor(Thr202 /Tyr204)-ERK

43kDa 1:500 1% BSA Rabbit Cell Signaling Technology, Inc., U.S.A.

Phosphor(Ser727)-STAT3

85kDa 1:800 1% BSA Rabbit Cell Signaling Technology, Inc., U.S.A.

SOCS3 30kDa 1:200 1% Skim Rabbit Santa Cruz biotechnology, Inc., U.S.A.

Cleaved Caspase-3 17kDa 1:1000 1% BSA Rabbit Cell Signaling Technology, Inc., U.S.A.

Mfn1 84-86kDa 1:500 1% BSA Rabbit BD Transduction biotechnology, Inc., USA

Mfn2 86-110kDa 1:500 1% BSA Rabbit BD Transduction biotechnology, Inc., USA

OPA1 80-100kDa 1:500 1% BSA Mouse BD Transduction biotechnology, Inc., USA

Drp1 88kDa 1:500 1% BSA Mouse BD Transduction biotechnology, Inc. USA

hFis1 17kDa 1:1000 1% BSA Rabbit Abcam, Chicago, IL., U.S.A.

Actin 43kDa 1:1000 1% BSA Rabbit Santa Cruz Biotechnology, Inc., U.S.A.

Secondary antibody

(conjugated peroxidase)

Dilution Conc.

Company rate buffer

Goat anti-rabbit antibody 1:5000 1% Skim milk

or 1% BSA

Santa cruz Biotechnology, INC, U.S.A.

(25)

7. Ras activation assay

Endogenous level 또는 IFITM1을 과발현한 NF1 세포 내의 활성화된 Ras 형태 인 GTP-Ras의 수준을 알아보기 위해 Ras activation assay kit(Upstate Biotech, NY)의 실험 방법을 이용하여 확인하였다. Ras activation assay는 Ras의 activation 형태인 GTP-Ras가 증가하면 Raf-1가 membrane으로 보충(recruiting)되어 GTP-Ras에 결합 된다는 성질을 이용, 여기에 anti-Raf-1 antibody를 반응시켜 활성화된 Ras의 발현 량을 확인하는 방법이다. 실험방법은 cell lysate로 부터 Ras-GTP를 분리하기 위하 여 affinity precipitation을 이용하였고. Cell lysate는 Raf-1 RBD fusion 단백질을 결합 한 agarose와 함께 incubation 하였다. Agarose bead는 원심분리하여 모은 후 lysis buffer로 washing 하였다. 최종적으로 sample buffer를 첨가하여 95℃에서 5분간 가 열 후 western blot analysis를 시행하였다.

8. Cell death assay

3가지 종류(normal skin, benign, malignant tissue)의 조직에서 배양한 세포의 apoptosis sensitivity를 측정하기 위하여 세포사를 유도하는 Actinomycin D(Lab Empire S.C., Poland) 50ng/㎖ 농도로 30시간 각각 처리 후 cleaved caspase 3를 통해 확인하였다.

9. Transfection

NF1 환자의 악성 세포에 비해 발현이 감소된 IFITM1을 악성표현형세포에

over-expression 시키기 위해 microporator를 사용하여 transfection (Microporator-mini™, Digital biotechnology, U.S.A.) 하였다.

(26)

16

-10. Confocal microscopy

IFITM1의 세포 내 위치(cellular localization) 및 mitochondria 형태를 관찰하기 위하여, pEYFP-N1과 cloning한 IFITM1을 NF1 malignant cell에 transfection하여 Poly-D-lysin(Sigma Aldrich, U.S.A.) 코팅한 cover slip에 Cell(4X106)을 깐 후, 12-24시간 over-expression 시켰다. 공초점 현미경으로 관찰하기 위해, PBS로 배양액(culture media)을 완전히 제거, 37℃ CO2 incubator에서 20uM DAPI(Molecular Probes™,

U.S.A.)를 30분간 처리하여 핵을 염색한 후, 250nM MitoTracker(Molecular Probes™, U.S.A.)를 첨가한 후 20분간 처리 Mitochondria를 염색하여, PBS로 10분씩 3회 세 척하였다. 이후 4% paraformaldehyde(PBS에 용해)를 37℃에서 15분간 처리하여 세 포고정(fixation)을 하였고, 0.1M Glycin(PBS에 용해) 실온(Room Temperature)에서 3 분씩 3회, 0.1% Triton X-100(PBS에 용해) 실온에서 10분씩 3회 처리하여 permeabilization 한 후, PBS로 10분간 세척 후 Vectashield(Vector Laboratories Co., U.S.A) 또는 50% glycerol로 mounting하여 샘플을 완성하였다. 이 후 공초점 현미 경(Zeiss LSM510 confocal laser scanning microscope; CLSM, Germany)(Hotta et al.,2005) 을 사용하여 40x, 650x oil lens 조건으로 관찰하였다.

(27)

III. 결과

결과

결과

결과

A. 일차

일차

일차

일차배양세포에서의

배양세포에서의

배양세포에서의 IFITM1 의

배양세포에서의

의 발현양상

발현양상

발현양상

발현양상

선행연구에서, NF1 환자의 수술 조직에서 분리한 정상, 양성종양, 악성종양 조직을 이용한 differentially expressed gene(DEG) screening 방법을 통하여, 양성 및 악성 종양에서 발현량이 현저하게 감소된(down-regulation) IFITM1 유전자를 발굴 및 동정하였다(Fig. 7A). IFITM1 의 발현량을 세포 level 에서 비교하기 위하여, 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 일차 세포(fibroblast)를 배양하였다. 각각의 primary fibroblast 에서 추출한 total RNA 를 RT(reverse transcriptase)로 합성한 cDNA 를 주형으로 IFITM1 특이적 primer 를 사용하여, IFITM1 유전자를 PCR 로 증폭한 후 total RNA 발현량을 분석한 결과 정상세포에 비해 양성세포와 악성세포에서 발현량이 감소하였다(Fig. 7B). 이것을 단백질 수준에서 확인하고자 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 배양한 primary fibroblast 세포에서 단백질을 추출하여 IFITM1 특이적 항체를 사용하여 Western blot analysis 를 통해 단백질의 발현량을 확인하였다(Fig. 7C). RT-PCR 과 Western blot analysis 의 결과 정상세포에 비해 양성세포와 악성세포에서 IFITM1 의 발현량이 현저히 감소하였으며, 이 결과는 DEG screening analysis 의 결과와 일치하였다.

(28)

18

Fig. 7. Expression pattern of the identified IFITM1 genes on the NF1 . (A) DEG screening analysis of IFITM1 in three types of NF1 cells with the quantitative results (N=3, *P<0.005, one-factor ANOVA). (B) RT-PCR analysis of IFITM1 in three types of NF1 cells with the quantitative results. RT-PCR was performed using the cDNA with the specific primers for IFITM1 (N=3, *P<0.005, one-factor ANOVA). (C) Western blot analysis of IFITM1 in three types of NF1 cells with the quantitative results. The 40㎍ of protein extracts from NF1 cells were loaded onto 12-15% SDS-PAGE gel and blotted onto PVDF. Western blotting was performed using the specific antibody indicated (N=3, **P<0.001, one-factor ANOVA). N, normal; B, benign; M, malignant.

A. DEG Screening analysis

B. RT-PCR N B M N B M C. Western blotting N B M ← 17kDa IFITM1 ← 43kDa Actin ← 300bp IFITM1 ← 420bp GAPDH ← ← ← ← DEG22 IFITM1

(29)

B. 악성세포에서

악성세포에서

악성세포에서

악성세포에서 down-regulation 된

된 IFITM1 의

의 과발현

과발현

과발현

과발현(overexpression)

IFITM1 이 NF1 의 종양형성과 악성화에 관여하는 기전을 규명하고자

악성세포에 IFITM1 을 과발현 시켰다. 먼저 HeLa cell 의 cDNA 를 주형으로

IFITM1 특이적인 primer 를 이용하여 IFITM1 유전자를 PCR 로 증폭한 후,

제한효소 XhoI 와 BamHI 을 사용하여 human IFITM1 을 pCDNA 3.1(-) vector 에 cloning 하였다(Fig. 8A). 이렇게 cloning 한 IFITM1 construct 와 vector(control)를 IFITM1 발현이 감소(down-regulation)된 NF1 악성세포에 transfection 시켜, 48 시간 배양 한 후 단백질을 추출하여 그 변화를 Western blotting 을 통해 확인하였다(Fig.

8A). 정량적으로 분석한 결과, IFITM1 construct 를 transfection 한

세포가 pCDNA3.1(-) vector(control)를 transfection 한 세포에 비해 IFITM1 발현량이 56.1% 증가하였고(Fig. 8B), 이러한 결과로 IFITM1 이 제대로 과발현(overexpressio

(30)

20

-Fig. 8. Overexpression of IFITM1 in NF1 malignant cells. (A) Overexpressions of IFITM1 construct and pCDNA 3.1(-) vector and Western blott analysis with the specific antibody, IFITM1. (B) The quantitative results of the band intensity are shown (N=3, *p<0.05, one-factor ANOVA). Control; empty vector transfected.

A.

Control IFITM1 ← ← ← ← 17kDa IFITM1 ← ← ← ← 43kDa Actin

B.

(31)

C. IFITM1 과발현에과발현에과발현에 의한과발현에 의한의한 RAS/MAPK 신호전달의한 신호전달신호전달신호전달 경로의경로의 단백질경로의경로의 단백질단백질단백질 발현양상발현양상발현양상 변화발현양상 변화변화 변화 정상, 양성종양, 악성종양 조직에서 배양한 primary fibroblast 의 endogenous

level 에서 RAS/MAPK 신호전달 경로 관련 단백질의 발현양상을 분석하고,

IFITM1 과발현에 의한 이들 단백질 발현양상 변화를 비교·분석하였다. 그 결과,

Endogenous level에서 total RAS 의 발현량은 비슷하였으나, RAS 단백질의 활성화 형태인 GTP-RAS 는 정상세포에 비해 악성종양세포에서 약간 증가되었다. 또한,

downstream signal 인 활성화형의 인산화된 p-ERK 단백질의 발현량은 정상표현형

세포에 비해 양성 및 악성종양세포에서 현저하게 증가되었다(Fig. 9A).

반면에, IFITM1 을 악성종양세포에 과발현 시켰을 때, control 에 비해 total GTP-RAS, total-GTP-RAS, ERK, p-ERK 의 RAS/MAPK 신호전달 경로 관련 단백질들의 발현량이 현저히 감소되었다(Fig. 9B). 하지만, NF1 과 유사하게 활성형

GTP-RAS 를 GDP-RAS 로 변환시키는 단백질인 RASGAP p120 의 발현량은 증가

하였다(Fig. 9B). 또한 IFITM1 을 악성종양세포에 과발현 시켰을 때, ERK 의 down-stream 에 있는 STAT3 와 inhibitor 인 SOCS3 의 발현량을 분석하였다. IFITM1 의 과발현에 의해 악성종양세포에서 증가된 형태를 나타내는 p-STAT3 는 발현량이 감소하였으며, 양성 및 악성 종양세포에서 발현량이 감소되었던 SOCS3 의 발현량이 IFITM1 의 과발현에 의해 증가되었다(Fig.10).

(32)

22

Fig. 9. Expression of RAS/MAPK signaling related proteins in NF1 malignant cells by overexpression of IFITM1. (A) Expression level of p-ERK protein was increased in the NF1 malignant cells. N, normal; B, benign; M, malignant. (B) Expression levels of Ras, ERK, p-ERK proteins were decreased in the IFITM1 over-expressed cells. (C) The quantitative results of the band intensity in the Western blotting are shown (N=3, *p<0.05, one-factor ANOVA). Control, transfected empty vector

A.

B.

Control IFITM1 N B M RASGAP T-RAS(GTP) T-RAS ACTIN ERK p-ERK

C.

(33)

Fig. 10. Western blot analysis of p-STAT3 and SOCS3 in malignant cells by overexpression of IFITM1. (A) By overexpression of IFITM1, expression level of p-STAT3, one of the downstream proteins of RAS/MAPK signaling pathway, was decreased, whereas expression level of SOCS3 protein, an inhibitor of STAT3, was increased. N, normal; B, benign; M, malignant. (B) The quantitative results of the band intensity in the Western blotting are shown (N=3, *p<0.05, one-factor ANOVA).

A.

N B M Control IFITM1 p-STAT3 SOCS3

B.

(34)

24

-D. ERK1 inhibitor 의

의 처리에

처리에

처리에

처리에 의한

의한 IFITM1 의

의한

의한

의 발현량

발현량

발현량

발현량 변화

변화

변화

변화

NF1 세포에서 IFITM1 이 RAS/MAPK 신호전달경로와 직접적인 관련이

있는지 확인하기 위해, 정상세포와 악성종양세포에 ERK 의 활성화 형태인 p-ERK1 의 inhibitor 인 PD98059 를 처리한 후 p-ERK 와 IFITM1 의 발현양상을 분석한 결과, ERK 의 저해에 의해 IFITM1 의 발현이 감소하였다(Fig. 11).

Fig. 11. Effect of ERK1 inhibitor, PD98059, in NF1 cells. (A) Western blot analysis of ERK, p-ERK and IFITM1 in the normal and malignant cells showed that expression level of IFITM1 was reduced after treatment of PD98059. (B) The quantitative results of the band intensity are shown by western blot analysis(N=3, *p<0.05, one-factor ANOVA).

A.

DMSO PD98059 DMSO PD98059

< NF1 – Normal > < NF1 – Malignant >

ERK p-ERK IFITM1 ACTIN

B.

PD98059 : 90㎛㎛ ㎛㎛ PD98059 : 80㎛ ㎛㎛ ㎛

(35)

E. IFITM1 과발현에

과발현에

과발현에 의한

과발현에

의한

의한

의한 apoptosis 감수성

감수성

감수성

감수성 변화

변화

변화

변화

정상세포, 양성종양세포, 악성종양세포에 대한 apoptosis(세포자멸사) 감수성을 알아보고, 악성종양세포에 IFITM1을 과발현시켰을 때 apoptosis 감수성의 변화를 분석하였다. 악성세포 내에 IFITM1의 과발현(overexpression)한 후 세포사멸 감수 성을 관찰하기 위하여 Actinomycin D를 20ng/㎖(Fig. 12) 농도로 24시간 처리하여 세포사멸을 유도시킨 후, endogenous level에서 cleaved caspase-3의 발현량을 확인한 결과 정상세포와 양성종양세포에 비해 악성종양세포에서 세포사멸(apoptosis) 감 수성이 증가했다(caspase 3 activity가 낮음). 반면에, IFITM1에 따른 세포사멸 감수 성의 경우 cytotoxicity assay를 통해 확인한 결과 IFITM1의 발현이 증가함에 따라 세포사멸에 대한 감수성이 감소하였음을 확인하였다.

(36)

26

-Fig. 12. Apoptosis susceptibility analysis of malignant cells by IFITM1 overexpression. The level of cleaved caspase 3 was detected by anti-caspase 3 antiboby in the normal, benign

and malignant cells after treatment actinomycin D. After treatment actinomycin D(20nM),

cell viability was calculated by MTT assay in the malignant cells transfected with vector or

IFITM1. Overexpression of IFITM1 stimulated apoptosis susceptibility of the malignant

cells. .

N B M

Cleaved Caspase3

(37)

F. Interferon(IFN)의의의의 처리에처리에처리에처리에 의한의한 IFITM1 의의한의한 의의의 발현량발현량발현량발현량 증가증가증가증가

NF1 cell 에서 interferon(IFN)에 의해 IFITM1 의 발현이 유도되는지를 알기 위해

IFN-α 와 IFN-γ 를 악성종양세포에 3 시간 처리한 후에 IFITM1 의 mRNA

level 에서의 발현양상을 확인하였다. 그 결과 IFN-α 와 IFN-γ 의 처리에 의해 IFITM1의 발현량이 증가하였다(Fig. 13).

Fig. 13. IFITM1 expression induction by treatment of IFN-α and IFN-γ. RT-PCR analysis showed that mRNA expression of IFITM1 was increased after treatment of IFN-α and IFN-γ in the malignant cells. ; C, control.

(38)

28

-G. IFITM1의 세포의의 세포세포세포 내내내내 분포분포분포(cellular localization) 분포

IFITM1의 세포 내 분포를 확인하기 위하여, 악성종양세포에 pEYFP-IFITM1

construct를 과발현 시킨 후 IFITM1이 endoplasmic reticulum(ER) 또는 미토콘드리 아에 분포하는지 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 IFITM1이 ER에 발현됨을 확인하였다(Fig. 14).

H. IFITM1 과발현에과발현에 의한과발현에과발현에 의한의한 미토콘드리아의한 미토콘드리아 형태미토콘드리아미토콘드리아 형태형태형태 변화변화변화변화

IFITM1의 세포 내 분포를 확인하기 위한 실험에서, 우연히 IFITM1의 과발현에

의해 미토콘드리아의 형태가 변화된다는 사실을 관찰하였다. pEYFP-N1-IFITM1

construct를 악성종양세포에 과발현 시켰을 때, 시간이 지남에 따라 미토콘드리아

가 길어진 것을 관찰하였다(Fig. 15A). 반면에 Control로 pEYFP-N1 vector를 과발현 하였을 때는 미토콘드리아의 변화가 없었다. 이러한 사실을 확인하기 위해, 우선 정상세포, 양성종양세포, 악성종양세포의 미토콘드리아 형태를 공초점 현미경으 로 관찰하였다. 그 결과, 정상세포에서 악성종양세포로 갈수록 미토콘드리아가 단편화(fragmentation)되어 있다는 것을 알 수 있었다(Fig. 15B). IFITM1이 미토콘드 리아 융합(fusion)을 유도하는지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아가 매우 단편화 되어 있는 악성종양세포에 IFITM1을 과발현 시켜 미토콘드리아의 형태를 자세히 관찰하였다. 그 결과, IFITM1이 과발현된 악성종양세포에서는 정상세포에서와 같 이 길어진 형태(elongation)의 미토콘드리아를 관찰하였다(Fig. 15B).

(39)

Fig. 14. Cellular localization of IFITM1 in the malignant cells. Confocal microscopic analysis of pEYFP-N1 vector and pEYFP-N1-IFITM1 constructs (green) in NF1 malignant cells stained with ER-tracker (red) (A) or mitotracker (red) (B) The pEYFP-N1-IFITM1 was observed in the ER.

(40)

30

-A.

I F I T M 1

12hr

16hr

(41)

Fig. 15. Effect of IFITM1 overexpression on mitochondrial morphology. (A) Confocal microscopic analysis of the malignant cells overexpressing pEYFP-N1-IFITM1 construct (green) stained with mitotracker (red). (B) Confocal microscopic analysis of the normal, benign and malignant cells stained with mitotracker (red). The mitochondrial morphology of the malignant cells was changed to an elongated form by overexpression of the IFITM1 construct.

B.

Normal Benign Malignant

pCDNA in Malignant

(42)

32

-I. IFITM1 과발현에과발현에과발현에 의한과발현에 의한의한의한 미토콘드리아미토콘드리아미토콘드리아 형태조절미토콘드리아 형태조절 단백질의형태조절형태조절 단백질의단백질의단백질의 발현량발현량발현량 변화발현량 변화변화 변화

IFITM1이 미토콘드리아의 융합(fusion) 및 분열(fission)에 직접적으로 관여하는 지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 형태조절 단백질(mitochondrial shaping

protein)의 발현량을 분석하였다. 우선, 미토콘드리아의 융합에 관여하는

Mitofusion protein 1(MFN1), Mitofusion protein 2(MFN2), Optic actrophy type 1(OPA1) 단백질과 미토콘드리아 분열에 관여하는 Dystrophin-related protein 1(DRP1), Mitochondrial fission protein 1(FIS1) 단백질의 발현양상을 정상세포, 양성종양세포, 악성종양세포에서 확인한 결과, 악성종양세포에서 OPA1의 발현량이 감소하였으 며, 반대로 DRP1과 FIS1의 발현량이 증가되어 있었다(Fig. 16). 악성종양세포에

IFITM1을 과발현 시켰을 때, 미토콘드리아의 분열에 관여하는 두 단백질인

(43)

Fig. 16. Expression patterns of mitochondria shaping proteins in the malignant cells overexpressing of IFITM1. Western blot analysis of mitochondrial shaping proteins, MFN1, MFN2, OPA1, DRP1, and FIS1, in the malignant cells after overexpression of

IFITM1 showed that expression levels of DRP1 and FIS1 proteins were decreased in the

malignant cells overexpressing the IFITM1 construct.

IFITM1 IFITM1 N B M pCDNA pCDNA pEYFP-N1 pEYFP-N1

Mfn1

Mfn2

OPA1

Drp1

hFis1

Actin

(44)

34

-IV. 고찰

고찰

고찰

고찰

본 연구는 신경섬유종증 제 1 형의 종양발생과 악성화에 관여하는 IFITM1(interferon induced transmembrane protein 1)의 분자 기전을 규명하기 위하여,

NF1 환자의 정상조직, 양성종양조직, 악성종양조직에서 분리 배양한 primary

fibroblast 를 실험재료로 사용하여 생화학적 및 세포생물학적 연구를 수행하였다.

본 연구를 통하여, NF1 의 종양형성 및 악성화 기전 규명과 더 나아가서 NF1 치료법 개발에 응용할 수 있는 기초 자료를 획득하는 것을 목표로 하였다.

선행연구(Jeong 등, 2008)에서 NF1 종양조직에서 발현량이 현저히 감소된 유전자로 발굴 및 동정된 IFITM1 은, 배양된 primary fibroblast 를 사용한 본 연구에서도 동일하게 양성 및 악성종양세포에서 발현량이 현저하게 감소되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 다양한 암에서 IFITM1 의 발현량이 감소되어 있다는 이전의 보고(G Yang 등, 2007)와 일치한다. IFITM1 의 잘 알려진 기능으로는 IFN-γ 의 anti-proliferation 을 조절하는데 중요한 역할을 하며, G1 phase 에서 cell growth 를 arrest 한다는 것이 알려져 있다(G Yang 등, 2007). 본 연구에서도 NF1 세포에서 IFN-α 와 IFN-γ 의 처리에 의해 IFITM1 의 발현량이 증가하였다. IFN 은 실제 NF1 의 치료제로 쓰이고 있는데(R.J. Packer 등, 2002) 이러한 실험결과를 미루어 보아 IFN 의 효과는 IFITM1 의 발현량이 증가 함에 따른 apoptosis 증가에 의한 것이라고 예상 된다.

IFITM1의 과발현(overexpression)과 p-ERK inhibition 실험을 통하여, IFITM1이

RAS/MAPK 신호전달에 관련된 단백질의 발현양상에 직접적으로 관여하고

(45)

IFITM1의 발현량이 증가함에 따라, GTP-RAS, total RAS, ERK, p-ERK, p-STAT3의 발현량이 감소하고 p-ERK inhibitor 처리에 의해 IFITM1의 발현량이 감소하였다. 또한, 악성종양세포의 apoptosis(세포자멸사) 감수성 실험을 통하여 IFITM1이

apoptosis 신호전달에도 깊이 관련되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 결과는 IFITM1이

RAS/MAPK 신호전달과 apoptosis 신호전달에 깊이 관련하는 기전으로 NF1의

종양발생 및 악성화에 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.

공초점 현미경 실험을 통하여 IFITM1의 subcellular localization이 endoplasmic reticulum(ER) 이라는 것이 밝혀졌으며 이러한 결과는 이전의 보고(G Yang 등,

2007)와 동일하다. 본 연구에서 가장 흥미로운 결과는, IFITM1의 과발현이 NF1

악성종양세포에서 미토콘드리아의 융합(fusion)을 유도한다는 것을 밝힌 것이다. 특히, IFITM1이 미토콘드리아 형태조절 단백질(shaping protein)의 발현량 변화에 직접 연관되어 있다는 사실이 밝혀졌다. 최근, 미토콘드리아는 세포내에서 에너지 생산과 세포자멸사 조절 외에도 세포의 삶과 죽음을 포함한 세포의 운명 결정과 직결된 매우 다양한 생명활동에 관여하고 있으며, 이것은 미토콘드리아의 형태(morphology)와 밀접한 관계가 있다는 사실이 차츰 밝혀지고 있다(McBride H.M. 등, 2006; Chan, D.C. 등, 2006; Cerveny, K.L. 등, 2007). 미토콘드리아의 형태조절은 세포의 항상성(homeostasis) 유지에 필수적이며, 특정 단백질들에 의해 정교하게 이루어진다(Chan, D.C. 등, 2006; Cerveny, K.L. 등, 2007; Hoppins, S. 등, 2007).

미토콘드리아는 세포의 종류에 따라, 더욱이 같은 종류의 세포 간에도 작은 공(sphere) 모양이나 짧은 막대(rod) 모양에서부터 긴 관(tubule) 모양까지 그

형태는 매우 다양하다. 최근의 연구에서, 미토콘드리아는 끊임없이

(46)

36

-소기관이라는 사실이 밝혀졌다(Chan, D.C. 등, 2006; Cerveny, K.L. 등, 2007; Hoppins, S. 등, 2007). 즉, 미토콘드리아 관(tubule)은 세포골격 트랙(cytoskeletal track)의 축을 따라 이동하여 네트워크(network)를 형성하고 있으며, fusion과 fission의 균형에 의해 그 모양과 수가 유지되고 조절되고 있다. 이러한 미토콘드리아 형태 조절은 미토콘드리아 shaping 단백질이 관여하는 미토콘드리아 fusion-fission machinery에 의해 정교하게 조절되고 있다(Cerveny, K.L. 등, 2007). 미토콘드리아의 fusion에 관여하는 단백질로는 mitofusin1(Mfn1), mitofusin2(Mfn2), Opa1이 밝혀졌으며, 미토콘드리아의 fission에 관여하는 단백질로는 Drp1/Dlp1과 Fis1이 밝혀졌다. 미토콘드리아의 형태변화가 종양형성유전자(oncogenesis)에 관련이 있다는 직접적인 보고는 아직 없다. 하지만, 미토콘드리아의 형태와 apoptosis는 밀접하게 연관되어 있고, 또한 악성종양세포(cancer)의 metabolism은 주로 TCA cycle을 거치는 respirative phenotype이 아니라 glucose→pyruvate→lactate로 이어지는 glycolytic phenotype을 보이기 때문에, cancer 세포의 외부환경은 산성을 띄게 되고 따라서 악성종양세포(cancer)의 미토콘드리아는 단편화 된다는 발견으로부터 미토콘드리아의 형태와 oncogenesis가 어떤 연관성이 있을 것으로 추정되고 있다(Alirol, E. 등, 2006). 본 연구에서, 미토콘드리아가 매우 단편화(fragmentation)되어 있는 악성종양세포에 IFITM1을 과발현 시켜 미토콘드리아의 형태를 자세히 관찰한 결과, IFITM1의 과발현에 의해 미토콘드리아가 길어진 형태(elongation)로 변화되며, IFITM1이 미토콘드리아 형태조절 단백질 중에서 미토콘드리아 분열에 관여하는 DRP1과 hFIS1 단백질의 발현량이 감소된 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과를 NF1의 종양발생과 관련하여 보았을 때, 미토콘드리아 형태변화가 NF1의 악성화 기전에 관여할 수 있다는 것을 시사한다.

(47)

결론적으로, NF1 악성종양세포에 IFITM1을 과발현 함으로써 RAS/MAPK 신호전달 관련 단백질의 발현량, apoptosis 감수성, 미토콘드리아 형태가 정상세포에서와 유사하게 나타났다. 즉, IFITM1의 과발현을 통해서 악성종양세포가 정상세포와 유사한 형태로 변환될 수 있음을 보여주고 있다. 본 연구결과는 NF1의 종양발생 및 악성화 기전의 규명에 주요한 기초 자료를 제공할 뿐만 아니라, 향후 IFITM1을 응용한 NF1의 새로운 치료법 개발에도 응용 될 수 있을 것으로 기대된다.

(48)

38

-V. 결론

결론

결론

결론

본 연구에서는 신경섬유종증 제 1 형의 종양발생과 악성화 과정으로 가는 데에 있어서 IFITM1 이 어떠한 기전으로 관여하는 지에 초점을 맞추어서 연구를 수행하였다. 선행연구에서 NF1의 종양형성과 악성화에 관여하는 유력한 유전자로 발굴·동정된 IFITM1의 발현량을 배양된 primary fibroblast 세포에서 조사하여, 정상세포에 비해 양성종양세포와 악성종양세포에서 IFITM1의 발현량이 현저히 감소되어 있음을 확인하였다. IFITM1을 악성세포에 과발현(overexpression) 시키는 실험과 p-ERK inhibition 실험을 통하여, IFITM1이 RAS/MAPK 신호전달에 관련된 단백질의 발현양상에 직접 관여하고 있으며, IFITM1이 ERK 신호전달의 하류(down-stream)에 있음이 밝혀졌다. 또한, 악성종양세포의 apoptosis(세포자멸사) 감수성 실험을 통하여 IFITM1이 apoptosis 신호전달에도 깊이 관련되어 있음이 밝혀졌다.

공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여, IFITM1이 endoplasmic

reticulum(ER)에 발현하고 있음을 확인하였다. 또한, 흥미롭게도 IFITM1의

과발현에 의해 미토콘드리아의 형태가 변화된다는 사실이 밝혀졌다. 미토콘드리아가 매우 단편화(fragmentation)되어 있는 악성종양세포에 IFITM1을 과발현시켜 미토콘드리아의 형태를 자세히 관찰한 결과, IFITM1의 과발현에 의해 미토콘드리아가 길어진 형태(elongation)로 변화되며, IFITM1이 미토콘드리아 형태조절 단백질(mitochondrial shaping protein) 중에서 미토콘드리아 분열에 관여하는 DRP1와 hFIS1 단백질의 발현량을 감소시킨 것으로 밝혀졌다.

(49)

결론적으로, IFITM1 은 NF1 유래의 primary fibroblast 세포의 RAS/MAPK 및

apoptosis 신호전달과 미토콘드리아 형태조절에 깊이 관여하는 분자 기전을

통하여 신경섬유종증 제 1 형의 종양발생과 악성화에 관여한다는 것을 시사한다.

(50)

40

-참고문헌

참고문헌

참고문헌

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수치

표  차례 차례 차례 차례
Fig. 1. The various phenotypes of neurofibromatosis type 1.
Fig.  2.  Ras  pathway  and the function  of  neurofibromin.  (A)  Structure of  NF1  gene  (B)  Function of neurofibromin (C) Simplified version of the Ras pathway
Fig.  3.  A  diagram  of malignant  degeneration  pathway of  NF1  (Dasgupta  et  al.,  2003)
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참조

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