뇌허혈이나 뇌손상 같은 임상상황에서 glutamate 와 같은 흥분성 아미노산들이 synaptic cleft 에 급격히 증가하게 되며 이들에 의한 excitotoxicity 가 뇌손상의 주요 기전 중 하나이다(Benveniste 등, 1984; Rothman 등, 1986; Goldberg 등, 1987; Koh 등, 1987; Koh 등, 1990; Choi 등, 1990; Choi, 1992; Nishizawa 등, 2001).
증가된 glutamate 는 시냅스 후부의 N‐methyl‐D‐aspartate (NMDA),
α-amino-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA), kainate 등의 ionotropic 수용체를 흥분시키게
되며 (Watkins 등, 1987; Dingledine 등, 1999), 이에 의해 급격히 증가된 세포내 Ca2+에
괴사 (necrosis) 형태의 세포사멸 (cell death)를 주로 일으키지만 (Choi 등, 1987;
Gwag 등, 1997), 최근에는 DNA 분열과 염색질 응축을 특징으로 하는 apoptosis
형태의 세포사멸도 glutamate 수용체에 의한 excitotoxicity 에서 나타난다는
보고가 많다(Bonfoco 등, 1995; Ankarcrona 등, 1995).
본 연구에서 사용된 AMPA 자극에 의해 활성화되는 AMPA 수용체는 4 개의
단백질인 GluR1-4 (A-D)의 조합에 의해 이루어져 있으며 (Madden 등, 2002),
이들의 조합이나 RNA editing 에 의해 AMPA 수용체의 기능이 달라지는데
(Hollmann 등, 1991; Seeburg 등, 1996), GluR2 가 많이 함유되어 있으면 Ca2+
투과성이 낮고, GluR2 가 적게 함유되어 있으면 Ca2+ 투과성이 높다고 하며,
대부분의 신경세포는 전자에 속하며, 해마에 분포하는 neuron, neocortex 등이
후자에 속한다(lino 등, 1990; Hollmann 등, 1991; Burnasheve 등, 1992; Jonas 등, 1994;
Seeburg 등, 1996; Madden 등, 2002). 그러나, 전뇌허혈과 같은 임상 상황에서는
GluR2 의 표현이 억제되는 새로운 형태의 AMPA 수용체가 형성되며 Ca2+
투과성이 높아져 glutamate 에 의한 뇌독성이 증가한다고 하며, 이와같은 변화가
허혈 등에 의해 지연되어 나타나는 뇌병변 (delayed neurodegeneration)의 주요
원인이고, 주로 apoptosis 형태의 병변을 일으켰다 한다(Pellegrini-Giampietro 등,
1992; Pellegrini-Giampietro 등, 1997). 본 연구에서는 대뇌 피질 신경원을 사용하여
연구하였으며, Ca2+ 투과성이 높다고 알려진 세포는 아니었지만, fluo-3 AM 를
이용한 calcium imaging 실험에서 AMPA 50 μM 자극 시 450.26%의 신경세포
내로의 calcium influx 의 증가율을 보여, 세포내 calcium 증가에 의한 세포 손상의
가능성을 보여주었으며, propofol 50 μM 혼합투여 시 351.26%로 calcium
influx 증가율이 감소하여, 본 연구에서 72 시간 동안, 50 μM AMPA 자극 시
세포사율이 49.31%에서 AMPA 50 μM + propofol 50 μM 혼합투여 시 세포사율이
29.38%로 의의있게 감소한 원인 중 하나로 제시될 수 있겠다.
Glutamate 수용체의 과도한 흥분에 의해 일어나는 excitotoxicity 는 대부분
NMDA 수용체의 의해 일어나지만, AMPA 수용체 등의 비 NMDA 수용체도
관여한다.
Frandsen 등은 AMPA 등의 비-NMDA 수용체도 excitotoxicity 에 관여한다
보고하였다(Frandsen 등, 1989). Garthwaite 등은 AMPA 에 의한 세포손상이 세가지
기전으로 일어남을 관찰하였는데, 소뇌의 golgi 세포에서 빠르게 팽창성으로 오는
괴사 형태의 손상은 NMDA 자극 시와 마찬가지로 Ca2+ 의 세포 내로의 유입에
의해 일어나며, 나머지 뇌부분에서는 apoptosis 양상으로 서서히 뇌손상을
나타낸다 하였는데 (Garthwaite 등, 1991), 이는 본 연구에서와 같은 대뇌피질
신경원을 사용한 연구는 아니었다.
Gwag 등은 쥐의 피질신경원 배양 모델에서 3-100 µM AMPA 자극을 주며
24 시간 관찰한 결과 대부분 necrosis 형태의 손상이 오나, apoptosis 형태의 손상이
혼재되어 있을 가능성을 배제하지 못한다 하였으며 (Gwag 등, 1997), Koh 등은
쥐의 피질신경원 배양에 모델에서 500 µM AMPA 5 분 자극을 주어 세포손상을
주지 못하였지만, 5 µM AMPA 20-24 시간 자극은 용량의존적으로 lactic
dehydrogenase (LDH, necrosis 형태의 세포손상 시 증가) 증가와 세포손상 면적을
증가시켜 강력한 뇌독성을 나타내었다 하였으며, 짧은 고농도의 자극보다 긴
저농도의 자극이 뇌독성을 나타내는 이유는 AMPA 수용체가 NMDA 수용체와
달리Ca2+ 투과성이 낮기 때문이라 하였다(Koh 등, 1990).
본 연구에서는 Gwag, Koh 등의 연구에서와 같은 백서 피질신경원 배양모델을
사용하였는데, 8 또는 24 시간 동안 30-100 µM AMPA 자극을 통한 예비실험 결과
세포사율이 높지 않아 72 시간 동안 50 µM 의 AMPA 자극주어 49.31%의
세포사율을 보였다. 또한, 전체 신경 세포중 apoptosis 일으킨 비율 28.01% 이어서
결국 세포사를 일으킨 신경원 중 apoptosis 에 의한 세포사는 56.8% 정도였다.
LDH 측정 등 necrosis 형태의 세포손상을 보는 실험을 하지 않아 정확하지는
않지만, 위의 연구들로 미루어볼 때 necrosis 와 apoptosis 가 혼재된 형태의
세포사가 일어난 것으로 추정된다. 또한, Larm 등도 백서의 피질 신경원세포
배양모델에서 100-300 µM 의 (S)–AMPA 를 24 시간 투여하여본 결과 50% 정도의
세포에서 apoptosis 형태의 세포사를 일으킨다 하였는데 (Larm 등, 1997), 이는 본
연구의 결과보다 높은 수치이며, AMPA 자극 농도와 시간이 다르기 때문이
뇌보호를 위해 MK-801 과 같은 NMDA 수용체 길항제 들이 많이 연구되어 왔었는데
(Choi 등, 1990), NMDA 수용체 길항제의 여러가지 부작용으로 인해 GYK-52466 같은
AMPA/kainite 수용체 길항제들에 대한 연구, NMDA 와 AMPA 길항제의 혼합투여에 대한
연구들이 이루어지고 있다(Strasser 등, 1995; Arias 등, 1999).
본 연구에서 사용한 propofol 은 흔히 쓰이는 정맥마취제이며, 뇌보호 효과에 대해서는
in vivo 와 in vitro 에서 긍정적 혹은 부정적 의견들이 있다(Kochs 등, 1992; Hans 등,
1994; Orser 등, 1995; Yamakura 등, 1995; Zhu 등, 1997; Young 등, 1997; Peters 등,
2001; Shibuta 등, 2001; Engelhard 등, 2004; Chen 등, 2008).
Propofol 의 뇌보호 기전에 대해서는 여러가지 기전들이 제시되었는데,
두개내압의 감소, 뇌대사율의 감소, 뇌의 산소요구량 감소 (Kochs 등, 1992),
glutamate 수용체에 길항제로서의 작용 (Hans 등, 1994; Orser 등, 1995; Yamakura 등,
1995), Na+ 이온채널 의존적 glutamate 분비 감소 (Ligamaneni 등, 2001), glutamate
흡수의 증가 (Peters 등, 2001; Velly 등, 2003), 세포외 glutamate 농도의 감소,
항산화제로 작용하여 유리기 제거자(free radical scavenger)로 작용하는 기전
(Sagara 등, 1999)등이 보고되고 있다.
Yamakura 등은 recombinant glutamate 수용체 channel 을 이용한 연구에서,
AMPA 수용체의 subtype 에 따라 propofol 에 대한 반응이 억제되기도 하고
증가되기도 함을 보고하였는데, 억제효과는 500 μM 의 고농도(임상농도: ~35 μM)
propofol 에서만 일어났고 임상용량에서는 억제효과를 나타내지 않았다(Yamakura
등, 1995). 이는 50 μM 의 propofol 투여가 생존세포수를 47.04 % 에서 65.13 %로
증가시킨 본 연구 결과와는 일치하지 않는다.
Krampfl 등은 recombinant AMPA-type glutamate 수용체 channel 을 이용하여 patch
clamp 실험을 한 결과 100 μM 이상의 propofol 은 AMPA 수용체의 탈감작에
관여하여 AMPA 자극을 오히려 강화한다 하였으며 (Krampfl 등, 2005), Zhu 등은
112 μM 의 propofol 이 AMPA 로 유도된 뇌독성의 증감에 아무 영향도 미치지
않는다 하였는데 (Zhu 등, 1997), 이들 결과들도 본 연구와 일치하지 않았다.
Young 등은 백서를 이용한 in vivo 뇌허혈-재관류 실험에서 propofol 을 뇌허혈
중간부터 재관류 시까지 투여하였을 때 뇌경색 용적을 21% 감소시킬 수
49.31% 에서 29.38%로 낮춘 본 연구의 신경세포 손상에 대한 보호 효과와
비슷하였으나, in vivo 와 in vitro 실험 간의 차이가 있으므로 단순 비교는 어렵다.
Engelhard 등은 백서의 허혈-재관류 모델에서 propofol 이 허혈 4 시간 후에
necrosis 뿐 아니라 apoptosis 를 유도하는 단백질인 Bax 의 농도를 감소시킨다
보고하였으며 (Engelhard 등, 2004), Chen 등은 백서 국소 허혈-재관류 모델에서
propofol 이 apoptosis 에 의한 뇌독성에 미치는 영향을 시간대 별로 살펴본 결과,
국소허혈-재관류는 necrosis 와 apoptosis 가 혼재된 형태의 뇌손상을 일으키는데,
apoptosis 는 재관류 6 시간 후부터 일어나기 시작하여 3 일 후까지 존재하다
감소하며, propofol 은 뇌경색면적을 감소시키는 등 뇌보호 효과가 있으며,
apoptosis 감소에도 효과가 있었다 보고하였다( Chen 등, 2008).
뇌허혈-재관류 시 glutamate 가 상승하며, 이 중 일부는 AMPA 수용체를
자극하여 necrosis 혹은 apoptosis 형태의 뇌세포 손상이 온다 가정할 경우
(Garthwaite 등, 1991; Garthwaite 등 1991), propofol 50 μM 첨가 시 AMPA 자극에
의한 뇌세포보호 효과를 보였으며, apoptosis 비율도 28.01%에서 20.07%로 낮춘
본 연구의 결과와 비슷하였다. 그러나, 본 연구에서 보인 apoptosis 의 억제가
AMPA 수용체 간의 직접적인 상호작용에 의한 것인지, Engelhard 나 Chen 등의
연구에서와 같이(Engelhard 등, 2004; Chen 등, 2008) propofol 이 AMPA 자극에 의해
유도된 apoptosis 과정 중 일부에 관여해서 인지는 확실치 않으며, 추가 연구가
필요하다.
백서 피질 신경원 배양 모델에서 72 시간 동안 AMPA50 μM 자극과 동시에
0.1-50 μM 농도의 propofol 을 투여하여 propofol 이 뇌보호 효과가 있는지, 72 시간
동안 AMPA 50 μM 자극 시 apoptosis 형태의 신경세포 손상을 얼마나 일으키며,
propofol 을 주면 어느 정도 감소 효과가 있는지 살펴본 결과, 49.31%의
세포사율을 보였으며 50 μM propofol 은 세포사율을 29.38%로 감소시켰고,
세포사율 감소 원인 중 일부는 propofol 에 의한 apoptosis 감소에 기인한다
생각되어지며, 추후 뇌보호 효과의 기전 등에 관한 추가 연구가 이루어져야겠다.
V. 결론
백서 피질 신경원 혼합배양 모델에서 72 시간, 50 μM AMPA 자극은 49.31%의
세포사율과 28%의 apoptosis 비율을 보여, necrosis 와 apoptosis 가 혼합된 형태로
추정되는 세포사멸을 일으켰으며, 50 μM propofol 의 처치는 세포사율을 29.38%로,
apopotosis 비율을 20%로 의의있게 낮추어 뇌보호 효과가 있었으며, 신경
세포내로의 calcium 이동의 억제가 기전 중 하나로 제시될 수 있겠다. 또한,
necrosis 가 어느 정도 관여하는지, apoptosis 의 기전 중 어느 부위에 관여하는지,
증가된 calcium 의 기원이 무엇인지 알려면 추가 연구가 필요하다.