혈청 유무 조건에서의 세포 transfection 효율 평가 38

의 유전자 전달 효율을 확인하였다. 양성 대조군으로 무게 비 1의

PEI25K/pDNA 폴리플렉스를 사용하였다. 24-well cell culture plate incubator에서 cell lysate가 형성되도록 하였다. lysate는 원심분리하 여 상등액만 취해 분석하였다. 우선 luciferase 발현량은 luciferase assay kit을 이용해 발광도를 측정하였고, 또한 세포 내 단백질 정 량은 BCA^TM Protein Assay Reagent Kit를 이용하여 측정하였다.

분석에는 microplate reader (Synergy H1, BioTek, USA)를 이용하 였다. 실험 결과는 세포 내 단백질의 단위 mg 당 상대적 발광도 값 PEI25K/pDNA 폴리플렉스를 사용하였다. 6-well cell culture plate 에 세포를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 분주하고, well의 70-80 %정도 로 증식하도록 배양하였다. 시료는 pDNA 1 μg을 기준으로 무게 비

10, 30, 50에 맞춰 각각의 고분자를 이용한 폴리플렉스를 well 당 analyzer (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용해 시료 당 총 1×10⁴ 개의 세포를 확인하고 Becton Dickinson CellQuest software 를 이용해 세포 내 투과율을 분석하였다. 실험 결과는 Flowing software를 이용해 정리하였다.

3.2.4.5 poly(CBA-AG) 폴리플렉스의 세포 내 거동 관찰

공초점 주사 현미경 (CLSM, Confocal Laser Scanning Microscope)을 이용하여 폴리플렉스의 세포 내 거동을 관찰하였다.

양성 대조군으로 무게 비 1의 PEI25K/pDNA 폴리플렉스를 사용하였 다. Hela 세포를 confocal imaging dish에 8×10⁴ cells/well의 밀도로 분주하고, well의 70-80 %정도로 증식하도록 배양하였다. 시료는

였다. 최종적으로 증식 배지로 교환하여 시료를 준비하고 CLSM (Leica TCS SP8X Gated STED, Germany)을 이용해 세포를 관찰 하였고, LAS AF Lite program (Leica Application Suite, Advanced Fluorescence Lite)를 통해 이미지를 얻었다.

3.2.4.6 poly(CBA-AG)/pJDK-apoptin 폴리플렉스의 치료성능 poly(CBA-DAB) 폴리플렉스를 사용하였다. pJDK-apoptin을 이용한 폴리플렉스를 준비하여 transfection 효율 평가 실험과 동일하게 세포 를 염색하는 FITC-Annexin V/PI apoptosis assay를 통해 apoptin 의 활성을 알아보았다. 양성 대조군으로 무게 비 1의 PEI25K/pDNA

폴리플렉스를 사용하였고, 비교군으로 무게 비 100의 poly(CBA-DAB) 폴리플렉스를 사용하였다. 6-well cell culture plate에 A549 세포를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 분주하고, well의 70-80 %정도로 증식하 도록 배양하였다. pDNA 4.0 μg을 기준으로 무게 비 30, 50, 100에 맞춰 준비한 폴리플렉스/DMEM 용액을 4 시간 동안 처리하고, 배 양액 교체 후 유전자 발현이 일어나도록 48 시간 동안 추가 배양하 였다. 배양된 세포는 세척 후 Alexa Fluor® 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit를 이용해 염색하였고, 두 형광 염료 사이의 간섭 효과를 보정하기 위해 각각 한 가지 염료만을 무게 비 50의 poly(CBA-AG) 폴리플렉스를 처리한 세포에 따로 염색하여 보정용 시료를 준비하였다. 분석은 BD FACScan analyzer (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용해 시료 당 총 1×10⁴ 개의 세포를 확인하여 세포 내 투과율을 분석하였다.

제 4 장 결과 및 고찰