poly(CBA-AG)의 특성 분석

3.2.2.1 poly(CBA-AG)의 구조 분석 - ¹H NMR

poly(CBA-DAB)와 poly(CBA-AG)의 구조는 핵자기공명분광기 를 이용하여 확인하였다. 각 시료는 10 mg/mL 농도로 500 μL씩 준 비하였으며, 용매는 D2O를 사용하였다. 모든 구조 분석은 400 MHz Jeol JNM-LA400 (JEOL, Japan)을 이용하여 확인하였다.

3.2.2.2 poly(CBA-AG)의 분자량 확인 - GPC

poly(CBA-DAB)와 poly(CBA-AG)의 분자량은 Gel Permeation Chromatography (GPC: YL-9100, Young Lin Instrument, Korea)를 통해 확인하였다. polyethyleneglycol을 standard로 사용하였고, 각각 의 시료는 10 mg/mL로 준비하였으며 용매는 1% 포름산을 사용하 였다. 모든 분석은 Ultrahydrogel 250 (Waters, U.S.A) 컬럼을 사용 하여 1% 포름산을 유속 1 mg/mL 상태에서 측정되었다.

3.2.2.3 poly(CBA-AG)의 분해거동 확인 - GPC

PBS (pH 7.4) 상에서 poly(CBA-AG)의 분해거동은 시간에 따라 준비된 고분자 시료의 분자량의 변화 양상을 고분자의 농도와 반응 물의 농도에 따라 관찰하였다. 먼저 구아니딘 기로 개질하기 전후를 비교하기 위해 PBS (pH 7.4)를 용매로 10 mg/mL의 동일한 농도의

poly(CBA-DAB)와 poly(CBA-AG) 용액을 각각 준비하였다. 또한

3.2.2.4 poly(CBA-AG)의 분해거동 확인 - fluorescamine assay

poly(CBA-AG)의 분해 반응이 실제로 아미드 결합의 가수분해에 해당하는 지 여부를 확인하기 위해, 일차 아민을 정량하는 대표적 방법인 fluorescamine assay를 통해 알아보았다. 대조군으로써 poly(CBA-DAB)를 사용하였고, 시료는 10 mg/mL 농도의 고분자 /PBS 용액을 37 ^oC에 보관하면서 일정시간마다(5시간, 10시간, 24시 간, 96시간) 100 μL씩 취해 동결건조하여 최종 분석시료로 준비하였 다. 각각의 시료는 pH 8.5 boric acid/NaOH buffer 상에 1 mg/ml의 농도로 준비하고, 50 μL씩 취해 동일한 부피의 3 mg/mL의

fluorescamine/DMSO 용액과 96-well black plate에서 반응시켰다.

충분한 반응이 일어나도록 상온에서 10 분간 shaker 위에서 진행하 였다. 반응을 마친 후, microplate reader (Synergy H1, BioTek, U.S.A.)를 이용하여 Ex/Em = 390/475 nm에서 형광량을 측정하였

3.2.2.5 poly(CBA-AG)의 분해거동 확인 – Ellman’s assay PBS상에서 poly(CBA-AG)의 분해 반응이 일어날 때 이황화결합 였다. 티올기의 측정은 microplate reader (Synergy H1, BioTek, U.S.A.)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였 고, 분석은 DTT standard를 통해 측정값을 보정하여 얻었다. 결과 는 초기 노출된 티올기의 몰수 대비 각 시간에 따라 측정된 티올기 의 몰수의 비로 나타내었다. 모든 실험은 3 배수로 진행하였다.

3.2.3 poly(CBA-AG)/pDNA 폴리플렉스의 특성 분 석

3.2.3.1 pDNA의 추출 및 정제

플라스미드 DNA로 luciferase reporter gene을 발현하는 pCN-Luci [61] 와 apoptin을 발현하는 pJDK-apoptin [62] 를 각각 사용하였다. Competent cell은 Escherichia coli DH5a를 사용하였으 며, pDNA는 Nucleobond^® Xtra Midi kit (Macherey-Nagel, Germany)를 이용하여 추출하였다. 두 가지 pDNA 중 apoptin 발현 (0.7 %, wt/v)은 Tris base-Acetate-EDTA buffer (TAE)를 이용하 여 0.5 μg/mL의 ethidium bromide을 함유하도록 제조하였다. 전기 영동은 TAE buffer 상에서 Mupid-2plus® (Takara Bio Inc., Japan) 전기영동장치를 이용하여 12 분간 진행하였다. 추가적으로 환원성 환경에서 poly(CBA-AG) 폴리플렉스의 거동을 관찰하기 위 하여, 준비된 폴리플렉스 시료들을 2.5 mM DTT, 37 ^oC 조건에서