카페인

(1)표준용액조제

Caffeine표준물질 50,100,150,200mg/kg을 표준용액을 10μL 주입하여 peak 면 적으로 caffeine정량에 이용하였다.

(2)카페인

총 caffeine함량은 동결건조한 녹차 시료 1g에 80℃ 증류수 50mL를 가하여 1시 간 동안 추출 하여 상층액 4mL을 취하였다.추출액에 chloroform 4mL을 넣어 충분 히 교반한 후 chloroform층을 취한 뒤 0.45μm membrain filter로 여과 하였다.이 용 액을 HPLC를 이용하여 280nm에서 분석하였다.

Table13. HPLC conditionsforanalysisofcatechin andcaffeine

Instrument Column MobilePhase

Wavelength Flow rate Columntemp.

Injectionvolume

SHIMADZU Promineceseries

EclipsC18,250mm × 4mm i.d.,5μm

A -0.2% Phosphoricacidinwater:Tetrahydrofuran

=99:1(v/v)

B -Acetonitrile:Tetrahydrofuran=99:1(v/v) 280nm

1.0mL/min 40℃

10μL

2.휘발성 유기성분 분석

1)휘발성 유기성분의 추출

담양 죽로차 생엽과 반발효잎의 휘발성 유기성분을 추출하기 위해 연속수증기증류추 출(simultaneoussteam distillationandextraction,SDE,Normschliff,Germany)장치를 이용하였다.분석 시료 생엽 150g,반발효차 30g과 MilliQ water500mL를 혼합하 여 Waringblender로 3분간 분쇄한 후 1N NaOH 용액과 1M phosphatebuffer(pH 7.0)를 첨가하여 pH 7.0으로 조정하고 이를 휘발성 유기성분의 추출용 시료로 사용하 였다.

휘발성 유기성분의 추출은 Schultz등(28)의 방법에 따라 개량된 SDE장치(Fig.4)에 서 추출용 시료에 spiral로 충전된 doubledistilling apparatus로 재증류한 n-pentane:

diethylether혼합용매(1:1,v/v)100mL를 사용하여 상압 하에서 3시간 동안 추출하 였다.정량분석을 위해 n-butylbenzene(100ppm)을 추출용 시료에 첨가하였다.유기성 분의 유기용매 분획구에 무수 Na2SO4를 가하여 수분을 제거한 후,Vigreux column과 질소가스를 이용하여 약 0.5mL까지 농축하여 GC/MS의 분석시료로 사용하였다(Fig.

5).

Fig.4.Diagram ofsimultaneous steam distillation and extraction (SDE) apparatusaccording toLikensandNickerson.

Fr eshandsemi -f er ment edl eavesofC.si

nensis

BLENDI NG

․Added500mL ofMilliQ water

․AdjustedtopH 7.0with1N NaOH and 1M Phosphatebuffer(pH 7.0)

․Addedn-butylbenzene(100ppm)5mL asI.S.

S D E

․Bysolventmixtureofn-pentane/diethylether(1:1,v/v)100mL, for3hr

DEHYDROGENATION

․AddinganhydrousNa2SO4forovernight

․Filteration

CONCENTRATION

․Concentrateto0.5mL byVigreuxcolumnandN2

GC/MS ANALYSIS

Fig.5.Analysisofvolatileflavorcomponentsin freshandsemi-fermented leavesofDamyang Jukro-tea.

2)휘발성 유기성분의 확인 및 정량 분석

가.머무름 지수(retention index)의 수립

머무름 지표의 합리적인 표시법으로써 Kovats(29)가 제안한 머무름 지수(retention index orKovatsindex,RI)는 직쇄 알칸을 기준으로 하여 머무름 시간을 등간격으로 표시한 것이다.

머무름 지수는 chromatogram으로부터 용질을 확인하기 위하여 사용된 parameter로 서 어떤 한 용질의 머무름 지수는 혼합물의 chromatogram 위에서 그 용질의 머무름 시간의 앞과 뒤에 나타나는 두 개의 직쇄 알칸의 머무름 시간으로부터 구할 수 있다.

RIi＝ 100 Z + 100 ｛ LogVR(i)-LogVR(Z) ｝ LogVR(Z+1)-LogVR(Z)

․RIi:화합물 i의 retentionindex

․VR(i),VR(Z),VR(Z+1):화합물 i,탄소수가 각각 Z,Z+1인 직쇄 알칸의 각 공간보정 시간

(VR(Z)≤ VR(Z+1))

정의에 의하면,직쇄 alkane의 머무름 지수는 column 충진제,분리온도 및 다른 chromatography 조건과 무관하게 그 화합물에 들어 있는 탄소 수의 100배와 같은 값 을 갖는다.따라서 n-alkane은 어느 분석 column에서도 항상 CH4(RI=100),C2H6

(RI=200)… CnH2n+2(RI=100n)이라는 표준지표를 나타낸다.

머무름 지표를 구하기 위하여 탄소수 10개부터 25개까지의 n-Alkane표준물질을 구 입하여 재증류된 10mL의 n-hexane에 희석하여 조제하였다.조제된 stock 혼합액의 n-alkane표준물질을 희석하여 분석용 혼합액으로 조제하였으며 이들 1μL를 취하여 휘발성 유기성분의 GC/MS 분석조건과 동일한 조건에서 분석하였다.

나.휘발성 유기성분의 분석

휘발성 유기성분의 질량분석을 위해 HP 5973 mass selective detector (Agilent technologiesInc.,USA)가 연결된 HP 6890Seriesgaschromatograph를 사용하였으 며,시료의 이온화는 electron impactionization (EI)방법으로 행하였다.GC/MS 분석 조건은 ionization voltage를 70eV로 하였고,injector와 ion source의 온도는 각각 25 0℃,230℃이며,또한 분석할 분자량의 범위(m/z)는 40-350으로 설정하였다.Column은 DB-WAX (60m × 0.25mm i.d.,0.25μm film thickness,J&W,USA)를 사용하였고, 온도 프로그램은 40℃에서 3분간 유지한 다음 2℃/min의 속도로 120℃까지 상승시켜 5분간 유지하고 동일한 속도로 180℃까지 상승시켜 5분간 유지하였으며,다시 4℃/min 의 속도로 200℃까지 상승시킨 후 10분간 유지한 다음 5℃/min의 속도로 230℃까지 상승시킨 후 10분간 유지하도록 설정하였다.Carriergas는 helium을 사용하여 유속이 1.0ml/min가 되게 하였으며,시료는 1μL를 split10:1로 주입하였다(Table14).

Table14.GC/MS conditionsforidentification ofvolatilecompounds GC/MS HP 6890GC/5973MS

Column DB-WAX (60 m × 0.25mm i.d.,0.25μm film thickness,J&W)

Carriergas Helium (1.0mL/min)

Temp.program 40℃(3 min)-2℃/min-120℃-2℃/min-180℃-4℃

/min-200℃(10min)-5℃/min-230℃(10min) Injector 250℃

Ionsourcetemp. 230℃ Interfacetemp. 280℃

Ionization Electronimpactionization(EI) Ionizationvoltage 70eV

Massrange(m/z) 40～ 350 Injectionvolume 1μL

다.휘발성 유기성분의 확인 및 정량

GC/MS에 의해 totalionizationchromatogram(TIC)에 분리된 각 peak의 성분분석은 mass spectrum library (WILEY 275&7N,NBS 75K)와 mass spectraldata book의 spectrum(A,B)과의 일치 및 GC-MS 분석에 의한 retentionindex와 문헌상의 retention index(C,D)와의 일치,그리고 실험실에 축적된 표준물질의 분석 data를 비교하여 확인 하였다.

정량을 위하여 유기성분 추출 시 내부표준물질로 첨가된 n-butylbenzene과 동정된 유기성분의 peakarea를 이용하여 시료 1kg에 함유된 휘발성 유기성분을 상대적으로 정량하였으며,정량을 위해 사용한 내부표준물질과 동정된 각 화합물의 검출기 내에서 의 responsefactor등은 고려하지 않았다.

ComponentContent(mg/kg)＝ C× 1000 A×B

․A :각 시료에서 internalstandard의 peakarea

․B :시료의 양(g)

․C :각 시료에서 각 성분의 peakarea

Table 15.Retention time of n-alkanes for gas chromatographic retention index

n-Alkane Name Retentiontime C10H22

C11H24

C12H26

C13H28

C14H30

C15H32

C16H34

C17H36

C18H38

C19H40

C20H42

C21H44

C22H46

C23H48

C24H50

C25H52

n-Decane n-Undecane n-Dodecane n-Tridecane n-Tetradecane n-Pentadecane n-Hexadecane n-Heptadecane n-Octadecane n-Nonadecane n-Eicosane n-Heneicosane n-Docosane n-Tricosane n-Tetracosane n-Pentacosane

11.443 16.714 22.115 29.970 36.835 43.475 49.900 55.999 61.532 65.971 68.062 73.243 75.395 78.404 81.677 85.971

Fig.6.GC/MS chromatogram ofn-alkanestandardmixture.

제 4장 결과 및 고찰

제 1절 담양 죽로차의 일반성분 및 비휘발성 유효성분

1.수분 및 조회분

담양 죽로차 생엽과 반발효차의 수분 및 회분 함량은 Table 16에 나타내었다.이 (30)의 연구에서 생엽의 수분함량은 78.54± 1.17%로 보고된 바와 같이 죽로차 생엽의 수분함량이 77.12%∼78.18%로 나타났으며,생육기간이 길수록 약간 감소함을 보였다.

최(31)의 연구에서 발효차의 수분함량은 3.01%∼3.27%로 보고되었으나,본 연구에서 반발효차의 수분함량은 8.54∼9.28%의 비율을 보였다.이는 차나무 생엽의 종류와 차 의 제조방법 등에 의한 차이로 죽로 반발효차 제다시 roasting 과정이 없어 일반적인 발효차의 수분함량 보다 높게 나타난 결과로 사료된다.

담양 죽로차 생엽의 회분함량은 1.28%∼1.89%로 나타났으며,반발효차의 회분함량은 5.85%∼5.96%을 보였다.최(31)의 발효차의 회분은 5.24%∼5.43%로 보고되었으나,죽 로 반발효차의 회분 함량이 약간 높았으며,생육기간에 비례하여 증가함을 확인하였다.

Table 16.Comparison ofmoisture and ash contents in Damyang Jukro-tea according togrowing period

Sample Moisture Ash

Freshleaves

40dayleaves 78.18 1.43 60dayleaves 77.45 1.28 90dayleaves 77.12 1.89

Semi-fermented Jukro-tea

40dayleaves 9.28 5.85 60dayleaves 8.75 5.91 90dayleaves 8.54 5.96

2.테아닌

담양 죽로차 생엽의 생육기간 및 제다방법에 따른 theanine 함량을 알아보기 위해 생엽을 40일엽,60일엽,90일엽으로 나누어 채엽하였고,채엽한 생엽으로 반발효차를 제다하여 비교․분석한 chromatogram을 Fig.7과 8에 나타내었다.생육기간에 따른 생엽의 theanine 함량은 40일엽에서 1.63%,60일엽에서 0.62%,90일엽에서 0.59%로 40일엽에서 가장 높은 함량을 보였다.반발효 후 theanine의 함량은 40일엽에서 1.53%, 60일엽에서 0.51%,90일엽에서 0.27%로 생엽과 유사한 경향을 보였다.전체적으로 생 엽이 반발효차보다 약간 높은 함량을 보였으며 생육시기가 늦을수록 theanine함량은 감소하는 경향을 나타내었다.이는 채엽 시기가 늦어지면 지속적으로 감소한다는 이 (32)의 연구와 비슷한 경향을 나타내었다.제다방법에 따른 theanine의 함량은 죽로 차 나무 생엽이 반발효차보다 높게 확인되어 발효과정을 거치면서 theanine의 함량이 감 소함을 확인하였다.

Fig.7.Chromatogram oftheanine contents in fresh leaves ofDamyang Jukro-tea.

Fig.8.Chromatogram oftheanine contents in semi-fermented leavesof DamyangJukro-tea.

Table 17.Comparison oftheanine contents in Damyang Jukro-tea according togrowing period

(Unit:%)

Theanine

Growthstage(days)

40dayleaves 60dayleaves 90dayleaves Freshleaves 1.63 0.62 0.59 Semi-fermentedleaves 1.53 0.51 0.27

3.카테킨

담양 죽로차의 채엽시기 및 제다방법에 의한 카테킨 함량을 알아보기 위하여 담양 죽로 차나무 생엽의 생육기간을 40일,60일,90일로 구분하여 채엽한 후 각각의 시료들 을 반발효차로 제다한 후 분석한 chromatogram을 Fig.9와 10에 나타내었다.

일반적으로 녹차에서의 항산화능에 영향을 주는 물질은 (-)-epigallocatechingallate(EGCg) 로 알려져 있으며,이 등(33)은 차의 수확시기와 가공하는 방법의 차이에 따라 카테킨 성분 중 항산화능에 영향을 미치는 주요 성분은 (-)-epicatechin(EC),(-)-epicatechingallate (ECg),(-)-epigallocatechingallate(EGCg)로 녹차,우롱차,홍차 등 모든 차에서 카테킨 중 EGCg의 함량이 가장 높게 나타났다고 보고하였다.

담양 죽로 차나무 생엽과 반발효차의 주요 카테킨 조성을 Table18에 나타내었다.

담양 죽로차의 생육기간에 따른 카테킨의 함량은 EGCg가 40일엽에서 9.94%,60일엽 에서 6.80%,90일엽에서 1.79%로 40일엽에서 가장 높은 함량을 나타내어 생육기간이 길수록 감소함을 확인하였다.반발효차로 제다시 EGCg의 함량은 미량으로 확인되어, 발효가 되는 과정에서 카테킨의 조성이 변화되고 발효되는 기간이 길어질수록 감소한 다는 정 등(34)의 연구결과와 비슷한 경향을 나타내었다.EGC의 함량은 생엽에서 40 일엽 3.16%,60일엽 7.12%,90일엽 3.18%로 60일엽에서 가장 높은 함량을 나타내었으 며,반발효차로 제다시 각각 0.61%,1.10%,1.29%로 발효시 약간 감소함을 확인하였다.

ECg의 함량은 각각 4.31%,4.26%,0.82%로 90일엽에 가장 낮은 함량을 보였고,40일 엽과 60일엽의 함량은 비슷하였다.반발효차에서는 0.19%,0.14%,0.51%로 반발효시 감소함을 확인하였다.담양 죽로 차나무 생엽의 카테킨 조성은 EGCg,ECg,EGC 등으 로 동정되었고,반발효차에서는 EGC,GCg,EGCg등으로 확인되어,반발효시 EGCg의 함량이 가장 많이 감소함을 나타내었다.생엽의 카테킨 조성을 비교하여 Fig.11에 도 식하였고,반발효차의 카테킨 조성별 함량을 Fig.12에 나타내었다.

Fig. 9. Chromatogram of catechin contents in fresh leaves of Damyang Jukro-tea.

Fig. 10. Chromatogram of catechin contents in semi-fermented leaves of

DamyangJukro-tea.

Table 18.Comparison ofcatechin contents in Damyang Jukro-tea according togrowing period

Unit:%

Composition

40day leaves 60day leaves 90day leaves fresh

leaves

semi -fermented

fresh leaves

semi -fermented

fresh leaves

semi -fermented

EGC

3.16 0.61 7.12 1.10 3.18 1.29

C

t¹⁾ t t t t t

EC

^{t t 0.18 t 0.10 t}

EGCg

^{9.94 0.19 6.80 0.23 1.79 0.79}

GCg

^{0.25 0.18 1.17 0.36 0.32 0.23}

ECg

4.31 0.19 4.26 0.14 0.82 0.51

Cg

0.29 0.05 0.30 0.06 0.03 0.02 Total 18.95 1.22 19.83 1.89 6.24 2.84

1)

Trace

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

EGCg EC EGC ECg

% 40day leaves

60day leaves 90day leaves

Fig. 11. Comparison of catechin contents in fresh leaves of Damyang Jukro-tea.

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40

EGCg EC EGC ECg

% 40day leaves

60day leaves 90day leaves

Fig. 12. Comparison of catechin contents in semi-fermented leaves of DamyangJukro-tea.

4.카페인

담양 죽로차 생엽의 생육기간 및 제다방법에 따른 caffeine함량을 알아보기 위해 생 엽을 40일엽,60일엽,90일엽으로 나누어 채취하고 이와 같은 시기에 채엽한 생엽을 발 효시켜 비교․분석한 후 chromatogram을 Fig.13과 14에 나타내었다.특유의 쓴맛을 내며 각성작용,이뇨작용 효과가 있는 caffeine은 재배조건과 채취시기에 따라 차이가 많이 난다.생육기간별 죽로차의 caffeine함량은 40일엽에서 0.91%,60일엽에서 1.65%, 90일엽에서 0.43%로 60일엽에서 가장 높은 함량을 보였다.발효 후 caffeine의 함량은 40일엽에서 1.32%,60일엽에서 1.40%,90일엽에서 0.88%로 생엽과 유사한 경향을 보였 다.발효과정을 통해 40일엽과 90일엽은 caffeine함량이 증가하였고,60일엽은 약간 감 소함을 확인할 수 있었다(Table19).조 등(35)의 연구결과에 따르면 caffeine함량이 수확 중기까지는 증가하다가 후기에 감소하는 경향을 보인다고 보고되었다.이와 같은 결과처럼 담양 죽로차 60일엽에서 가장 높은 양의 caffeine이 검출되었다.제다방법에 따른 caffeine의 함량은 40일엽과 90일엽은 발효과정을 거치면서 약간 증가함을 확인하 였다(Fig.15).

Fig.13.Chromatogram of caffeine contents in fresh leaves of Damyang Jukro-tea.

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