초점심도 - 이 론 - 형광 공초점 현미경에서의 side-lobe 감소 방안에 대한 연구

Ⅱ. 이 론

5. 초점심도

평행광선이 렌즈로 들어갔을 때 그 경로는 Fig. 6과 같게 된다. 여기서 초점심도는

Airy 원반의 2배가되는 거리를 말한다. 초점심도 z₀는

2z₀ = 2π w₀

λ (3)

로 정의된다. 여기서 w0는 식(1)에 나타낸 Airy 원반의 크기이다. 이러한 초점심도는 대물렌즈의 광축 방향의 해상도를 결정하게 된다( Bahaa E. 등(1991) ).

z₁

y₂ z₂ γ₂

γ₁

n₂ n₁

y₁

Fig. 7 Illustrating the sine condition and the Herschel condition

θ L D

l d

Fig. 8 Geometry of focusing by a lens

6. sine과 Herschel 조건

로 주어진다( Sheppard 등(1991) ). 여기서 광축으로부터 렌즈의 높이가 h, L점에서

로 주어진다( Sheppard 등(1981) ). 여기서 , z는 시료가 광축 방향으로 이동한 거리,

-100 -50 50 100

400 500 600 700 800 900 1000 kz

θ₂

t

θ₁ glass (n1)

water (n2) mirror

Fig. 10 Light reflection from a perfect reflector with a water layer

로서 상에 잡음이 발생하며, 해상도를 저하시키게 된다.

8. Fresnel 방정식

Fresnel 방정식은 파동이 경계면을 입사할 때, 그 경로를 해석하기 위하여 사용된 다. 본 연구에서는 공초점 현미경에서 조사된 빛이 시료에 입사될 때, 시료의 굴절률 및 두께 등의 특성에 따른 경로를 알아보기 위하여 도입하였다.

Fresnel 방정식에서 전기장 E가 입사면에 수직한 경우의 반사계수 ( r⊥)는

r_⊥ = n_icosθ_i - n_tcosθ_t

n_icosθ_i + n_tcosθ_t (15) 이고, 전기장 E가 입사면에 평행한 경우의 반사계수 ( r||)는

r_|| = n_tcosθ_i - n_icosθ_t

n_icosθ_t + n_tcosθ_t (16) 이 된다( Hecht (1998) ).

Fig. 10과 같이 거울위에 물이 있고, 그 위에 덮게 유리(Cover-glass)가 놓여있는 3 중층 구조에 빛이 입사하였을 경우 전체 반사계수 r은

r = r₁₂ - r₂₃exp(2iβ) (averaged reflection coefficient) R(θ) 는

R ( θ) = r_||+ r_⊥

-40 -20 20 40

로 표현되며, 여기서 c = cos θ1 , n = n₁

0 5 10 15 20 25 30 0.012

0.018 0.024 0.030 0.036 0.042

intensity

Fig. 12 Intensity for various values of coefficient B with sample thickness a=15 ㎛, b=33 ㎛.

0 5 10 15 20 25 30 35

0.016 0.024 0.032 0.040

intensity

thickness(㎛)

Fig. 13 The variations of intensity by not phase compensation(a) and phase compensation(b)

-250 -200 -150 -100 kz 0.005

0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 I

-300 -250 -200 -150 -100 -50 kz 0.01 0.02 0.03 0.04 I

(a) (b)

Fig. 14 Axial response intensity for various values of coefficeient B.

( t : sample thickness, B = - 12 kd²∇

(

¹^l

)

, d : distance from objective to sample, l : distance from objective to image, a : before phase compensation, b : after phase compensation)

t = 15㎛

B = 16

-450 -400 -350 -300 -250 -200

광경로차 조절이 되지 않은 식(21)의 전산 시늉인 Fig. 11은 광경로차 조절이 가능 한 식(22)를 이용하여 그 광경로차 조절을 통한 위상 오차의 최소화가 가능해지며, Fig. 12는 t = 15 ㎛(Fig. 11(b)),와 t = 35 ㎛인 경우(Fig. 11(d))의 광경로차 조절 을 위한 B값에 따른 빛의 세기이다. t = 15 ㎛의 경우 B = 16에서 빛의 세기가 최대가 되며, t = 35 ㎛의 경우 B = 28에서 빛의 세기가 최대가 된다. 즉 대물렌 즈에서 시료까지의 거리 d와, 대물렌즈에서 상까지의 거리 l의 광경로차를 조절하여 줌으로써 위상 오차를 최소화하여, side-lobe를 최소화하고, 빛의 세기를 증가시킬 수 있다. 또한 Fig. 13은 시료의 두께의 변화에 따른 위상 오차를 광경로 변화값 B에 의 해 위상 보정을 해주지 않았을 때(a)와 보정을 해주었을 때(b)의 빛의 세기 변화를 보 여주고 있다. 위상 보정을 해주지 않았을 때는 시료의 두께가 증가함에 따라 그 빛의 세기가 급격히 감소하고, 이는 두꺼운 시료에서의 관측을 불가능하게 한다.

Fig. 14와 Fig. 15는 시료의 두께가 15 ㎛, 35 ㎛ 일 때에 위상 보정 전․후의 광축 방향에 대한 빛의 세기 변화를 보여주고 있다. Fig. 14에서 (a)는 위상 보정전의 상태 이며, (b)는 위상 보정 후의 상태이다. Fig. 12의 전산 시늉 결과에서 시료의 두께가 15 ㎛일 때 빛의 세기가 가장 크게 나타난 B = 16을 도입하면 side-lobe의 영향이 최소화된다. 즉 위상 보정치 B = 16을 적용하면, 빛의 세기는 증가하였고, side-lobe는 감소한다. Fig. 15는 시료의 두께가 35 ㎛인 경우 B = 28의 값을 적용 하여 side-lobe 영향을 최소화한 것이다. 즉 시료의 두께에 따른 위상 오차를 보정하 여 광축 방향의 side-lobe의 영향을 최소화 할 수 있다. 즉 시료의 3차원 상을 형성할 때 중요한 요소로 작용하는 광축 방향의 분해능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

III. 실험 방법

Z-axis trance stage z

detector

He-Ne laser mirror

mirror

expander pin-hole

splitter

pin-hole objective lens

confocal lens filter sample

d

l

Fig. 16 Schematic diagram of confocal microscope

(a) Absorption spectra

(b) Fluorescence emission spectra

Fig. 17 Absorption and emission spectra of cy-5

Fig. 18 Which is possible phase compensation flourescence-type confocal microscope

2. 실험 방법

본 연구에서는 시료의 굴절률과 두께에 따른 위상 오차의 발생을 최소화하기 위하 여, 시료에서 대물렌즈까지의 거리 d와, 대물렌즈에서 상까지의 거리 l을 보정하는데 있다. 이를 실험으로 하기 위하여 Fig. 16과 같은 실험장치를 구성하였다. 본 연구에 서는 10배의 대물렌즈를 사용하였으며, 본 연구에서 사용한 10배의 대물렌즈의 경우

d값은 4300 ㎛이다.

본 연구에서는 우선 시료의 두께에 따른 위상 오차를 고려하기 위하여, 시료의 두 께가 15 ㎛와 35 ㎛를 광축 방향에 대하여 측정 비교하였으며, 시료의 굴절률 차이에 따른 위상 오차를 고려하기 위하여, 형광 염색과정에서 증류수와 생체 식염수를 사용 한 2가지의 경우를 고려하였다. 이러한 결과를 토대로 실제 세포인 쥐의 뇌세포를 형 광 염색하여, 위상 오차를 보정할 수 있는 실제 공초점 현미경을 제작 후(Fig. 18) 위 상 오차를 보정하여, 위상 오차가 보정되지 않은 경우와 위상 오차가 보정 된 경우를 비교해 보았다.

실험의 진행은 우선 d값을 4300 ㎛로 고정하여, d값에 의한 공초점 위치까지의 거 리 l값을 결정 후 공초점 위치에 바늘 구멍을 설치하고, 광축 방향으로 스텝모터를 움직이며, 빛의 세기를 측정한다. d값이 4300 ㎛인 경우는 시료의 특성이 고려되지 않은 일반적인 형광 공초점 현미경이다. 다음에는 d값을 5 ㎛ 움직이고, 이에 따른 l 값을 결정하여 바늘 구멍 위치를 재설치하고, 같은 방법으로 진행한다. 이와 같은 방 법으로 5 ㎛씩 위상 보정을 하여 가며 실험하였다.

쥐의 뇌세포의 경우는 Fig. 18과 같은 형광 공초점 현미경을 구성하여 위상 오차를 보정하였으며, 쥐 뇌세포 시료의 두께는 약 15 ㎛이며, 형광 염색과정에서 생체 식염 수를 사용하였다. 위상 보정은 15 ㎛로 제작한 시료에서 생체 식염수를 사용하여 형 광 염색을 한 경우의 결과를 토대로, 빛의 세기가 최대가 되며, side-lobe가 최소가 되 는 d값과 l값을 적용하여 위상 보정하였다.

IV. 결과 및 논의

cover glass fluorescent (distilled water)

slide glass

Fig. 19 The sample with a thin thickness

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 10 20 30 40 50

Z-axis (㎛)

intensity (mV)

d : 4300㎛, l : 20㎝

d : 4305㎛, I : 25㎝

d : 4310㎛, I : 30㎝

Fig. 20 Intensity of optical axis of sample with a thin thickness

cover glass fluorescent (distilled water)

slide glass

15㎛

Fig. 21 Fluorescent dyed sample with distilled water a thickness 15 ㎛

d : 4300㎛

I : 20㎝

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 10 20 30 40 50 60 70

Z-axis (㎛)

intensity (mV)

Fig. 22 Intensity distribution of light with a decompensated phase

d : 4305㎛

즉, Fig. 21과 같이 그 두께가 15 ㎛이며, 증류수를 사용한 형광 물질의 경우이다. d

cover glass fluorescent (distilled water) slide glass

35㎛

Fig. 24 Fluorescent dyed sample with distilled water a thickness 35 ㎛

d : 4300㎛

I : 20㎝

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 20 40 60 80 100

Z-axis (㎛)

intensity (mV) .

Fig. 25 Intensity distribution of light with a decompensated phase

d : 4305㎛

cover glass fluorescent

(a solution of salt) slide glass

15㎛

Fig. 27 Fluorescent dyed sample with a solution of salt thickness 15 ㎛

d : 4300㎛

l : 20㎝

0 10 20 30 40 50 60 70

Z-axis (㎛)

intensity (mV) .

Fig. 28 Intensity distribution of light with a decompensated phase

d : 4310㎛

Fig. 30 Image of decompensated phase

d : 4300㎛

l : 20㎝

Fig. 31 Image of decompensated phase

d : 4310 ㎛

l : 30㎝

기가 증가하였으며, side-lobe는 발생하지 않았으며, 측정된 두께는 약 15 ㎛로 실제의 시료 두께와 일치하였다. Fig. 29(b)는 15 ㎛ 보정한 d값이 4315 ㎛인 경우로, side-lobe가 심하며, 빛의 세기가 매우 낮아 졌다. 즉 Fig. 27과 같이 시료가 식염수이 며, 그 두께가 15 ㎛인 경우 d값이 4310 ㎛인 10 ㎛ 보정한 경우 위상 오차를 최소화 할 수 있다. 이 결과는 같은 두께의 시료라 할지라도 시료의 굴절률의 차이에 따라 위상 오차의 정도가 다르며, 그 보정의 정도 또한 다르며, 굴절률이 클 경우 두께가 두꺼운 경우와 마찬가지로 위상 오차가 심해지며, 보정값 또한 커진다.

이러한 위상 보정의 결과를 토대로 실제 형광 공초점 현미경에서의 side-lobe 감소 를 알아보기 위하여 시료를 제작하였다. 시료는 두께 약 15 ㎛의 쥐의 뇌 세포 조직 을 식염수를 사용하여 형광 염색하였다. 또한 이제까지의 결과를 얻었던 Fig. 16의 실 험장치와 달리 평면방향의 주사를 위하여 Fig. 18과 같이 X-Y Scan Unit을 사용하였 고, d와 l값을 조절할 수 있도록 제작하였다. 쥐의 뇌 세포 시료의 경우 그 두께가 약 15 ㎛이고, 식염수를 사용하여 형광 염색을 한 경우로 Fig. 24의 시료와 일치한다.

즉 위상 보정을 10 ㎛한 d값이 4310 ㎛인 경우에 위상 오차를 최소화 할 수 있다.

Fig. 30은 d값이 4300 ㎛인 경우로 위상 보정을 하지 않은 경우이고, Fig. 31은 d값 이 4310 ㎛인 경우로 10 ㎛ 위상 보정을 한 경우이다. 위상 보정을 하지 않은 경우는 side-lobe의 영향으로 실제 세포 외 영역에 잡음이 발생하여 전체적으로 어둡게 보이 고, 뇌 세포의 신경 가지가 확인되지 않는다. 그러나 위상 보정을 한 경우는 세포와 세포 외의 영역이 확실히 구분되어, 전체적으로 밝고 뚜렷하게 구분되며, 2 ㎛이하의 뇌 세포의 신경 가지까지 확인 할 수 있었다. 즉 위상 보정을 통하여 side-lobe를 최 소화함으로써 상 형성 시 잡음을 최소화 할 수 있을 뿐 아니라, 해상도의 향상으로 측정되지 않았던 부분을 측정할 수 있었다.

V. 결론

형광 공초점 현미경은 수차를 최소화함으로써 고해상도의 상을 얻을 수 있다. 그 러나 시료의 특성에 따른 side-lobe의 발생으로 해상도에 악 영향을 미치고 있다. 본 연구에서는 side-lobe가 최소화되는 조건을 찾기 위하여 대물렌즈와 상까지의 거리 그리고 시료와 대물렌즈까지의 거리를 조절하여 광경로 차에 의한 위상오차를 보정하 였다.

전산기 시늉을 통해 시료의 특성에 따른 side-lobe 발생은, 시료의 두께가 15 ㎛인 경우 B = 16을 적용하여 위상 오차를 보정 하였고, 시료의 두께가 35 ㎛일 때는 B = 28을 적용하여 side-lobe의 영향이 최소화됨을 확인할 수 있었다. 이를 실험에 적용하여 시료 두께와 굴절률의 변화에 따른 side-lobe 변화를 측정하였다. 시료의 두 께가 없는 경우에는 위상 보정을 하지 않은 d = 4300 ㎛에서 side-lobe가 최소가 되 었고, 두께가 15 ㎛인 경우 5 ㎛의 위상 보정을 한 d = 4305 ㎛에서 side-lobe가 최 소가 되었고, 시료의 두께가 35 ㎛인 경우 10 ㎛의 위상 보정을 한 d = 4310 ㎛에 서 side-lobe가 최소가 되었다. 또한 식염수를 사용하여 형광 염색을 한 경우 10 ㎛의 위상 보정을 한 d = 4310 ㎛에서 side-lobe가 최소가 되었다. 실험 결과를 비교해 볼 때 시료의 두께가 두꺼워질수록 side-lobe의 발생이 증가하고, 빛의 세기는 감소하 였고, 굴절률이 높을수록 side-lobe의 발생이 증가하고, 빛의 세기는 감소하였다. 또한 위상 보정이 가능한 형광 공초점 현미경을 구성하여 쥐의 뇌 세포를 관찰한 결과 보 정을 하지 않은 경우에 비하여 side-lobe가 적은 상을 얻을 수 있었고, 광축 방향의 해상도 향상으로 2 ㎛ 이하의 신경 가지 부분을 확인 할 수 있었다.

이와 같이 본 연구에서 얻어진 시료의 불규칙적인 특성(굴절률 및 두께)에 따른 side-lobe의 최소화 방안을 고려한다면, 형광 공초점 현미경을 통해 고해상도의 상을

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