공초점 광학 현미경과 형광 공초점 현미경

공초점 현미경의 원리는 점 광원이 렌즈에 의해 초점이 형성되고 시료의 초점에서 반사된 빛은 다시 점 광원과 같은 위치에 초점을 형성하게 되는데 이를 공초점이라 한다( Minsky 등(1961), Shotton (1989) ). Fig 1은 이러한 공초점을 검출하기 위해 반투과 거울을 사용하여 측정의 위치만을 바꾼 것이다. 또한 공초점 현미경의 가장 큰 장점은 Fig. 1에서 처럼 공초점 부분에 바늘 구멍을 사용하여 비 초점면을 제거하 도록 한 것이다. 반면 기존의 광학 현미경은 초점과 초점 외의 정보를 모두 받아들임 으로서 수차 등의 왜곡에 의한 영향으로 전체적인 분해능이 크게 감소한다.

그러므로 공초점 현미경은 일반 광학 현미경에 비하여 높은 해상도를 가질 수 있는 것이다. 또한 초점면의 정보만을 받아들임으로써 시료에 손상을 주지 않고 3차원의 상을 얻을 수 있다( Corle 등(1996) ). 그러나 공초점 현미경은 공초점 된 위치에서의 점 광원만을 받아들이므로 그것으로 상을 구성 할 수는 없다. 이러한 이유로 공초점 현미경은 주사 방식을 통하여서 상을 구성한다. 현재 전산기를 사용한 상 구성 기술 (Video image processing technique)의 발전으로 주사방식을 통한 상의 구성은 3차원 으로 측정된 시료를 원하는 위치에서 원하는 부분을 관찰 할 수 있도록 할 뿐 아니 라, 상 구성 소요시간 역시 매우 짧아 일반 광학 현미경과 같이 살아 움직이는 시료 의 관찰이 가능해졌다. 또한 제어공학의 발전으로 주사 시 시료를 움직일 수 있는 한 계가 수십 ㎚영역까지 좁혀짐으로서 보다 정밀한 공초점 현미경을 구성 할 수 있다.

2. 공초점 광학 현미경과 형광 공초점 현미경

공초점 광학 현미경과, 형광 공초점 현미경의 차이점은 시료의 형광 염색 여부이다.

그러나 이는 단순한 시료의 형광 염색 유․무에 그치지 않고 공초점 현미경의구조 및

Fig 1. The principle of confocal microscope focus defocus

point light source

pin-hole detector beam-splitter

object lens

microscope (b) Fluorescence type confocla microscope (c) Schematic diagram of Galvano-mirror scaning system

그 특성을 결정짓는 결정적인 요인이 된다. 우선 공초점 광학 현미경의 경우 시료에

(c) (d)

Fig. 3 Fluorescence and Bandpass-Filter (a) Energy level of fluorescence (b) Bandpass wave length range of Bandpass-Filter (c) Absorption wave length (d) Fluorescence Emission wave length

hν' hν

S0

S'1

S1

(a) (b)

wavelength (㎚) I(%)

절률 차에 무관하다. 세포 시료의 경우 항원 항체 반응을 이용한 형광 염색 기법으로 특정 부분의 염색이 가능하며, 조직내의 특정 부분을 선별적으로 관찰 할 수 있다. 또 한 조사된 빛은 새로운 점 광원을 형성함으로 세포 내부의 구조를 확실히 검출할 수 있게 된다. Bandpass-Filter를 사용하여, 시료 표면 등에서 반사되는 빛과 외부에서 유입되는 빛을 제거하고, 형광 물질에서 여기되는 파장대의 빛 만을 검출하므로서, 주 변잡음을 최소화하여 보다 좋은 상을 구성할 수 있다.