가.홍삼의 조사포닌 추출
홍삼에 함유되어 있는 기능성 물질은 기존에 알려져 있는 홍삼 사포닌을 원료 전처리에 따른 분해 및 변화를 측정하고자 하였으며,이는 부탄올을 이용하여 조추출된 홍삼을 HPLC-MS(HighPerformanceLiquidChromatogrpahyMassSpectrometry,WatersZQ 2000,Manchestor,England)를 이용하여 분석하였으며,추출 방법은 Figure3에 도식화 하였다.식품공전(2007)의 홍삼 실험법,환류 추출 방법에 의하여 시료 약 7 g을 달아 물 포화 부탄올 60㎖로 70∼80℃에서 3회 1시간 반복 환류 추출하여 이를 분액 여두에 모아 20㎖ 증류수를 첨가하여 물 포화 부탄올 층을 취하였다.항량된 농축플라스크를 사 용하여 감압 농축한다.부탄올 층에 에스테르 50㎖를 첨가하여 35℃에서 20분간 환류 추출하여 지방을 분리해 낸 후 잔류물을 건조기(105℃)에서 20분간 건조하고 데시케이 터에서 30분간 방냉하여 다음의 식에 따라 조 사포닌의 함량을 구하였다.
조사포닌(㎎/g)함량 =A-B/C
A :농축 플라스크의 건조 후 무게(mg) B :농축 플라스크의 건조 전 무게(mg) C :시료 무게(g)
나.홍삼의 사포닌 추출 조건
시료로 이용한 양삼,홍삼농축액,홍삼 분말에 함유되어 있는 사포닌을 분석하기 위하 여 홍삼의 가공 공정에 따른 사포닌을 추출하기 위하여 3단계를 공정을 거쳐서 진행하 였다.기존의 수화부탄올을 활용하여 조사포닌 함량을 식품공전에 의해서 추출하는 과 정에 식품용으로 재활용하여 다시 사용할 수 있도록,용매에 따라서 단순 추출 방법을 적용하였다.시료는 solid phase extraction용 실리카 컬럼(Sep-pak Silica cartridge, Long Body Sep-pak Plus;WatersCo.,Milford,MA,USA)를 이용한 미니 컬럼 크로 마토그래피법으로 당질과 단백질 및 갈변화 색소 물질 등의 여분의 불순물을 제거한 후 사포닌 함량을 분석하였다.실리카 컬럼은 105℃ 진공 오븐에서 2시간 건조시킨 후 데 시케이터에서 방냉하고,5㎖ 에탄올을 이용하여 불순물을 제거한 후 실험에 사용하였 다.샘플 0.2 g을 정확하게 취하여 실리카 컬럼에 첨가한 후 5 ㎖ 에탄올로 용출시켜
홍삼 사포닌을 추출하였다.추출액은 PEFE 실린지 필터(0.2 ㎛ X 13 mm,National ScientificCompany,Lawrenceville,GA,U.S.A)로 여과한 후 HPLC-MS에 주입하였다.
이 때 1차 사포닌을 추출하고 난 후 데시케이터에서 4시간 방냉 후 다시 2차 용매인 물 을 이용하여 동일하게 추출한 후 분석하였으며,다시 4시간 방냉 후 3차 용매인 에탄올 을 이용하여 잔여 사포닌을 추출하였다.
Redginseng(7g)
extractedat75℃ suspendedin n-BuOH(60㎖,3times)
n-BuOH
layer Extractlayer
washedwithH2O(20
㎖)
n-BuOH layer Aqueouslayer
addedethylether50㎖ and concentratedat 35℃
Crudesaponin
Figure3.Extractionprocedureofcrudesaponinfrom redginseng.
다.홍삼의 사포닌 분석
인삼의 기능성 물질 추출은 기존의 부탄올을 이용한 방식을 가장 많이 사용하고 있으 나,이는 상용화가 어려운 부분이 있으므로,이러한 방법이 아닌 열수 추출 또는 에탄올 을 함유한 열수 추출을 식품용으로 사용하고 있다.이에 기존의 물과 에탄올 외에도 아 세톤을 활용한 추출 방법을 함께 연구하였다.각 시료 약 0.5g씩을 50㎖ 튜브에 취 하여 50% 메탄올로 1시간 초음파 추출 후에 10분 간(3,000rpm)원심·분리하여 상층액 만을 0.45㎛ 필터로 여과한 후 시험용액으로 하여 Waters사의 HPLC/MS를 이용하여 분석하였으며 분석조건은 Table6∼8과 같다.
System WatersAlliance2690 Detector UV/Vis(285nm)
Analyticalcolumn XterraC18(150mm X 2.1mm,3㎛,Waters,USA) Injectionvolume 20㎕
Mobilephase A :0.25% aceticacidinMeOH B :0.25% aceticacidinwater
Gradientprogram
0min B 50%
2min B 50% → 20%
38min B 20% → 0%(A 100%) 43min B 0%(A 100%)
Flow rate 0.30㎖ /min
Table6.AnalysisconditionofginsenosidesinredginsengextractbyHPLC
Model WatersZQ 2000
Ionsourcetype ESI
Sourcepolarity positive
Capillaryvoltage 3.5
Conevoltage(v) 120
Extractor 300
RF lens 40
Sourcetemp.(℃) 700
Desolvationtemp.(℃) 3
Desolvationgasflow rate(h/ℓ) 0.1
Conegas 50
Table 7. Liquid Chromatograph Mass Spectrometer(LC/MS) and operating parametersfor
analysisofginsenosideinredginsengextract
compounds retentiontime (min)
precursor m/z
Rb1 17.30 1,131(M+Na)
Rc 19.61 1,101(M+Na)
Re,Rd 22.71 969(M+Na)
Rg1,Rf 16.46 823(M+Na)
Rg2,Rg3 28.39 801(M+Na)
Rh1 20.17 661(M+Na)
Noto-R2 17.56 793(M+Na)
Table8.MS dataofginsenosidesinredginsengextractusingLC/MS