2.1. 실험 시료 발효 및 배합
우엉 뿌리와 황칠나무잎은 여러 번 흐르는 물에 세척한 후 1 cm크기로 잘라 놓았다. 자른 우엉뿌리와 황칠나무잎은 믹서기를 이용해 잘게 분쇄하였다. 분쇄 한 우엉뿌리와 황칠나무잎은 121°C에서 1시간동안 멸균 처리하였다. 멸균 처리 한 우엉뿌리 26.4 g에 효소 1 g, 증류수 100 ml를 넣고, 황칠나무잎 45.6 g에 효소와 증류수를 같은 방법으로 첨가시킨 후 각각 37°C Incubator에서 5일 동 안 발효 배양하였다. 발효된 우엉뿌리와 황칠나무잎을 원심분리 시킨 후 우엉 뿌리에서 43.83 g, 황칠나무잎에서 42.65 g의 상등액을 분리하였다. 각각의 상 등액에 증류수를 30 ml씩 섞어 각각의 시료를 만들고 우엉뿌리와 황칠나무발 효액을 1:1비율로 배합해 우엉뿌리 발효액, 황칠나무잎 발효액, 우엉뿌리와 황 칠나무잎 발효배합액 총 3종류의 시료를 실험에 사용 하였다. 시료 제작 과정 은 Figure 10에 나타내었다.
Figure 10.시료 제작 과정.
2.2. 동물의 처치
Mouse를 1주간 적응 시킨 후 mouse의 등을 animal clipper와 남성용 전기면 도기를 이용해 제모 시킨 후 연구를 수행하였다. 시료도포는 제모 당일부터 5 주(35일)간 제모부위에 대해 1일 1회씩 월요일부터 금요일까지 매일 오후 4시 경 24시간 간격으로 경피 도포하였으며, 도포양은 약 0.2 ml 정도 붓을 이용하 여 도포하였다.
2.3. 육안적 관찰(외형효과)
실험 시작 후 털이 자란 상태의 외형적 분석은 육안적 관찰에 의하여 수행하 였다. 육안적 관찰 방법은 연구 시작일로부터 1, 7, 14, 21, 28, 35일 동안 1주일 간격으로 관찰 기록하고 사진 촬영을 하였다. 실험군과 대조군의 발모 효과는 사진상으로 시료 도포 부위에 털이 어느 정도 자랐는지 육안으로 평가하였다.
2.4. 육안적 관찰(경피 내측 효과)
실험 시작 5주(35일) 후 육안적 관찰이 끝난 후 mouse를 희생하고 등 쪽 피 부를 적출하여 경피 내측색을 육안으로 관찰하였다. 경피 내측 색의 변화로 모 발 성장주기를 파악 할 수가 있다.
2.5. 조직학적 분석(Hematoxylin & Eosin)
실험 5주 경피 적출한 피부 조직들은 10% 중성 포르말린에 3시간 동안 고정 한 다음 흐르는 물에 수세하였다. 피부조직은 4 mm 간격으로 자르고 tissue capsule에 넣어 50% 알코올, 70% 알코올, 80% 알코올, 95% 알코올, 100% 알 코올로 각각 1시간 처리하여 탈수하였다. 그리고 xylen을 4회에 각각 1시간씩 담가둔 후 파라핀으로 치환하였다. 피부조직은 파라핀에 포매된 조직은 4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 hematoxylin & eosin 염색하여 광학현미경으로 모낭 조
직의 조직학적 변화를 관찰하였다.
2.6. 조직학적 분석(Toluidin Blue)
실험 5주 경피 적출한 피부조직들은 10% 중성 포르말린에 3시간 동안 고정 한 다음 수세하였다. 피부조직은 4 mm 간격으로 자르고 tissue capsule에 50%
알코올, 70% 알코올, 80% 알코올, 95% 알코올, 100% 알코올에 각각 1시간 처 리하여 탈수하였다. 그리고 xylen을 각각 1시간씩 4회 담가둔 후 파라핀으로 치환하였다. 피부조직은 파라핀에 포매 된 조직은 4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 toluidin blue 염색을 실시하여 관찰하였다.
2.7. 시료의 생리활성
1) Polyphenol 함량 측정Polyphenol의 함량 측정은 Folin-Denis법에 따라 (AOAC, 1990) 구하였다. 물 에 methanol 10 mL을 가하여 70℃에 30분 동안 반응 한 후 1 mg/mL 로 희석 하여 사용한다. 검액 50 μL에 증류수 650 μL를 넣고 Folin-Denis reagent 50 μ L를 가하여 3분 동안 실온에서 반응시킨다. 이에 10% Na2CO3 포화용액을 100 μL 첨가하고 최종 볼륨을 1 mL로 맞추기 위해 증류수 120 μL를 넣어 잘 혼합 시킨다. 37℃ 항온수조에 1시간 반응시킨 후 Absorbance reader(Bio Tek Instrument Inc.)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험 시료 용액 대신 methanol액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 tannic acid (Sig ma Co., USA) 농도를 0∼500 μg/mL이 되도록하고 이로부터 총 polyphenol 함 량을 구하였다.
2) Flavonoid 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 Davis 등의 방법에 따라, 추출물에 methanol을 10 mL 가하여 70℃에 30분 동안 추출할 후 1 mg/mL을 만들어 사용하였다. 검액 100 μL에 1 mL diethylene glycol을 첨가하고 1N NaOH 100 μL를 넣어 잘 혼 합시켜 37℃ 항온수조에 1시간 반응시킨 후 Absorbance reader(Bio Tek Instrument Inc.)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험 시료 용액 대신 methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin (Sigma Co. USA) 농도를 0 - 300 μg/ml이 되도록 하여 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
3) DPPH radical 소거능 측정
전자공여능 측정에 사용 된 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 자체가 매우 안정한 free radical로서 알코올 등의 유기용매에 매우 안정하며 항산화 기작 중 proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육 안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있어 다양한 천연소재로부터 항산화 물질 을 검색하는데 많이 이용되고 있다. 517 nm - 520 nm에서 강한 흡수띠를 보 이는 보라색 분획물이다. 반응액의 색이 노란색으로 변화되는 것을 흡광도의 감소로 측정함으로써 radical 소거활성을 알 수 있다. DPPH radical 소거 활성 실험은 (Blois, 1958)을 응용하여 다음과 같이 실행하였다. 96-well plate에 배 합액을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.5% 의 농도로 하여 희석액을 100 μl씩 분주한 후 여기에 0.5 mM의 DPPH를 100 μL을 넣은 후 20분간 방치한다. 동 일한 방법으로 vit C(vitamin C), BHT(butylated hydroxy toluen)도 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 및 15.6 μg/ml의 농도로 처리한다. Absorbance reader(Bio Tek lnstrument lnc.)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정은 3회 반복 수행하여 흡광도의 평균값을 도출하였다. Blank는 시료용액 대신 순 수한 추출용매를 사용하였으며, 전자공여 효과는 시료 첨가군과 첨가하지 않은
경우의 흡광도를 아래 식에 따라 백분율로 나타내었다.
전자공여능 (%) = (1 – 시료첨가군의 흡광도
무첨가군의 흡광도 ) × 100
2.8. 세포독성
세포생존율은 MTT (Thiazolyl Blue Tertazolium Bromide) Assay를 이용하 였으며 이는 세포 내 소기관인 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 생성되는 formazan의 흡광도를 측정하는 원리이다. macrophage 세포인 Raw 264.7 세포 의 배양은 10% Fetal bovine serum (FBS)과 1% Penicillin/streptomycin (100 U/mL)을 첨가한 Dulbeco’s modified eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하 였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하여 사용하였다.
48-well plate에 2×105 으로 RAW264.7을 접종하여 24시간 배양하여 각각의 배 합액을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.5%의 농도로 처리한 후 20시간 동안 추 가 배양하였다. 배양된 well plate에 5 mg/ml의 농도로 제조한 MTT (Thiazolyl Blue Tertazolium Bromide)를 100 μl를 첨가하여 4시간 배양 후 DMSO(JUNSEI-JAPAN)을 1 ml씩 첨가하여 Absorbance reader(Bio Tek lnstrument lnc.)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회 반복 수 행하여 세포생존율 평균값을 도출하였다.