카할 사이질세포에서 기록되는 전기적 활동도 1.
Current-clamping mode (I=0 에서 카할 사이질세포는 세포막 전압이) 주기적으로 변화하는 향도잡이 전압을 발생시켰다 (Figure 10A). 안정 막 전압은 -59.6 ± 2.6 mV (n=5), 향도잡이 전압의 빈도는 14.7 ± 0.8
를 보였다 투여시 안정막 전압의 탈
cycles/min (n=5). 10 nM carbachol
분극이 발생하면서 향도잡이 전압의 크기는 감소하였다 (Figure 10B).
이 존재하에 카할 사이질세포의 안정막 전압은
Carbachol -39.4 ± 3.6
향도잡이 전압의 빈도는 를 보였다
mV (n=5), 2.6 ± 4.3 cycles/min 와
(n=5) (Fig. 10C 10D).
Figure 10. Effects of carbachol treatment on pacemaker potentials recorded in cultured interstitial cells of Cajal (ICCs) from mouse small intestine. (A) Pacemaker potentials of ICCs in current clamping mode (I = 0). The vertical solid lines represent the scale of pacemaker potential amplitude and the horizontal solid lines represent the scale of pacemaker potential recording duration. (B) Pacemaker potentials of ICCs exposed to carbachol (CCh, 10 nM) in current clamping mode (I = 0). Cellular responses to CCh are summarized in (C) and (D). The bars represent mean values ± SE.
Asterisks represent significant differences from untreated control
카할 사이질세포에 과발현 후 향도잡이 전압의 변화
2. STIM1
의 역할을 확인하고자 를 카할 사이질세포에 과발
STIM1 STIM1 cDNA
현 시켰다 전류 고정 상태에서 대조군는 정상적인 향도잡이 전압을. 보여주었다 하지만. STIM1이 과발현된 카할 사이질세포는 향도잡이 전 압의 빈도수가 크게 증가하였다(Figure 11A 와 11B). 더불어 정상상태 의 향도잡이 전압의 형태가 STIM1 과발현시 불규칙해지며 융합된 형 태의 향도잡이 전압 양상을 보였다 대조군에서 카할 사이질세포의 안. 정막 전압과 빈도수는 -57.4 ± 2.9 mV (n=5), 33.6 ± 0.8 cycles/2
이였으며 이 과발현 된 카할 사이질세포의 안정막 전압 및
min , STIM1
빈도수는 -62.4 ± 5.4 mV (n=5), 48.6 ± 5.2 cycles/2 min였다(Figure 와
12A B).
Figure 11. Pacemaker potential recorded in control or STIM1-overexpressed cultured ICCs from mouse small intestine. (A) Pacemaker potentials of ICCs in current clamping mode (I = 0).
Vertical solid lines represent the scale of pacemaker potential amplitude and horizontal solid lines represent the scale of pacemaker potential recording duration. (B) Pacemaker potentials of STIM1-overexpressing ICCs in current-clamping mode (I = 0).
Figure 12. Pacemaker potential difference recorded in control or STIM1-overexpressed cultured ICCs from mouse small intestine.
Pacemaker potential responses in STIM1-overexpressing ICCs are summarized in (A) and (B). The bars represent mean values ± SE.
Asterisks represent significant differences from empty
카할 사이질세포에서 과발현 후 향도잡이 전압 변화
3. SARAF
의 역할을 확인하고자 를 카할 사이질세포에 과
SARAF SARAF cDNA
발현 시켰다 전류 고정 상태에서 대조군은 정상적인 향도잡이 전압을. 보여주었다 반면. SARAF이 과발현 된 카할 사이질세포는 향도잡이 전 압의 빈도수가 크게 감소하였다(Figure 13A 와 B). 대조군이 발현된 카 할 사이질세포의 안정막 전압과 빈도수는 -58.1 ± 4.1 mV (n=5), 31.6
이였으며 이 과발현된 카할 사이질세포의 안
± 3.4 cycles/2 min , SARAF
정막 전압 및 빈도수는 -64.8 ± 5.5 mV (n=5), 7.6 ± 2 cycles/2 min 였다(Figure 14A 와 B).
Figure 13. Pacemaker potential recorded in control or SARAF-overexpressed cultured ICCs from mouse small intestine. (A) Pacemaker potentials of ICCs in current clamping mode (I=0).
Vertical solid lines represent the scale of pacemaker potential amplitude and horizontal solid lines represent the scale of pacemaker potential recording duration. (B) Pacemaker potential of SARAF-overexpressing ICCs in current clamping mode.
Figure 14. Pacemaker potential differences recorded in control or SARAF-overexpressed cultured ICCs from mouse small intestine.
Pacemaker potential responses in SARAF-overexpressing ICCs are summarized in (C) and (D). The bars represent mean values ± SE.
Asterisks represent significant differences from empty vector-expressing control cells (Con) (*P < 0.01). RMP: Resting
카할 사이질세포에서 과 의 발현여부확인
4. STIM1 SARAF
과발현 상태가 아닌 실제 카할 사이질세포에 STIM1과 SARAF의 존 재여부를 확인하고자 RT-PCR을 시행하였다 배양된 세포 중 카할 사이. 질세포만 선택한 후 특이적 지시자인 ANO1 양성 세포만을 선별하여
을 시행하였다 그 결과 양성 세포인 카할 사이질세포에
RT-PCR . ANO1
과 이 정상적으로 발현되어 있는 것을 확인하였다
STIM1 SARAF (Figure
15).
Figure 15. Molecular expression of STIM1 and SARAF in cultured ICCs from mouse small intestine. RT-PCR detected the transcripts for STIM1 and SARAF in whole mounted cultured cells (upper panel) and in ANO1 positive cultured ICCs (lower panel).
카할 사이질세포의 향도잡이 활동도에 대한 과 칼슘
5. gadolinium
용액의 효과 -free
향도잡이 활동도에 대한 세포외 칼슘의 기전을 확인해 보고자 배양 된 카할 사이질세포에 비선택성 양이온 통로 억제제인 10 μM 과 칼슘 용액을 투여하였다 두 가지 조건 모두 카할 사
gadolinium -free .
이질세포에서 발견되는 향도잡이 전압의 발생이 완전히 차단하였다
와 정상 카할 사이질세포의 안정막 전압과 빈도수는
(Figure 16A B).
이였으며
-58.6 ± 1.1 mV (n=5), 32.6 ± 1.4 cycles/2 min , gadolinium 및 칼슘-free 용액의 처리 후 카할 사이질세포의 안정막 전압 및 빈도 수는 -50.4 ± 7.5 mV (n=5), 0.5 ± 0.6 cycles/2 min 및 -59.6 ± 3.5
였다 와
mV (n=5), 0.2 ± 0.8 cycles/2 min (Figure 17A B).
FIgure 16. The effects of gadolinium or an external Ca2+-free solution on pacemaker potentials in cultured ICCs from mouse small intestine. (A) Gadolinium exposure (Gd3+, 10 μM) abolished the generation of pacemaker potentials in cultured ICCs. Vertical solid lines represent the scale of pacemaker potential amplitude and horizontal solid lines represent the scale of pacemaker potential recording duration. (B) External Ca2+-free solution exposure inhibited pacemaker potential generation.
Figure 17. Pacemaker potential differences recorded in control or gadolinim or Ca2+-free solution in cultured ICCs from mouse small intestine. The bars represent mean values ± SE. Asterisks represent significant differences from untreated Control cells (Con) (*P <
0.01). RMP: Resting membrane potentials.
과 과발현 후 세포내 칼슘 변화 6. STIM1 SARAF
세포내 칼슘에 대한 STIM1과 SARAF의 역할을 확인하고자 칼슘 지 시자인 fluo-4AM을 처리 한 후 변화를 관찰하였다 대조군으로. 만을 과발현 시킨 카할 사이질세포는 일정한 세포내 칼슘 진 pcDNA
동 (oscillation)을 보였다 (Figure 18A). 하지만 STIM1이 과발현된 세포 는 세포내 칼슘 요동이 크게 증가되었으며 (Figure 18B), 반면 SARAF 이 과발현된 세포는 세포태 칼슘 요동이 크게 억제되었다 (Figure
이와 같은 결과는 에 요약하였다
18C). Figure 18D .
Figure 18. Effects of STIM1 or SARAF overexpression in cultured ICCs from mouse small intestine on intracellular Ca2+ oscillation. (A), (B), and (C): Fluorescence intensity changes in cultured mouse ICCs overexpressing empty vector (A), STIM1 (B), or SARAF (C).
Horizontal solid lines represent the scale of fluorescence intensity change duration. Pacemaker potential responses in STIM1- or SARAF-overexpressing ICCs are summarized in (D). The bars represent percentage difference. Asterisks represent significant