부록 Ⅰ. EU REACH 시험항목별 등록서류 분석
73)1. 인체건강 유해성
가. 급성독성
급성독성 중 경구독성은 1톤 이상 등록 시 요구되며(부속서 Ⅶ), 경피와 흡입독성은 10톤 이상(부속서 Ⅷ)의 등록 시 핵심자료이다. 급성독성의 표준 실험종은 래트이지만 마우스도 사용되며, 투여량의 효과는 EU TMR/OECD TG 표준 프로토콜에 따라 관찰되고 보고된다.
하나의 in vitro 시험법인 3T3 Neutral Red Uptake Cytotoxicity Assay는 미분류된(급 성경구독성, ≥2,000㎎/㎏ Body Weight) 화학물질을 확인하는 시험법으로 검증되었다.
그러나 독립적인 방법이 아닌, 통합적 시험 전략(ITS: Integrated Testing Strategy)에 따라 다른 시험법과 함께 사용하는 것을 권장하고 있다. 따라서 이용할 수 있는 대체시험법은 Read-Across 나 Grouping과 같은 예측방법을 이용하거나, 실험방법과 예측방법을 혼합한 증거 가중치를 활용하는 방법이다. 본 절에서의 급성독성 구분은 경구, 피부, 흡입 경로 또는 모든 가능한 경로에 대한 급성독성 결과를 바탕으로 정리한 것이다.
<부록 그림 1-1>에서 볼 수 있듯이 1,000톤 이상 기존 화학물질에서는 총 1만 5,987건의 서류가 제출되었고, 그중 시험연구는 9,355건(58.5%)으로 과반수 이상을 차지하였고, Read- Across는 3,323건(20.8%), 증거 가중치를 제출한 서류는 1,531건(9.6%)이었다.
100~1,000톤 이상의 기존 화학물질에 대한 서류는 총 1만 854건이었다. 이 중 시험연구는 4,265건(42.6%)에서 사용되었으며, Read-Across는 3,009건(27.7%), 연구면제는 1,762건 (16.2%)이 사용되었다. 증거 가중치 접근법은 1,265건(11.7%)에서 사용되었으며, 기타 정보 출처는 143건(1.3%)에서 사용되었다. 50건(0.5%)에서는 QSAR가 ESR로써 사용되었다.
1,000톤 이상의 기존 화학물질에 비해 100~1,000톤 이상의 기존 화학물질에서는 시험 연구가 58.5%에서 42.6%로 감소된 반면 Read-Across는 27.7%로 증가하였다. 한편 100톤 이상 신규 화학물질에서 시험연구의 총 비율은 50.1%로 확인되었다.
자료: ECHA(2014), pp.42-43 참조하여 재구성.
<부록 그림 1-1> EU REACH 등록서류 시험항목 분석: 급성독성
나. 피부 자극성/부식성
자극성/부식성은 시험물질을 단회 노출시킨 후 최초 인체 부위(피부, 눈, 호흡기 또는 소화관 점막)에서의 국부적인 영향을 예측하는 것으로, 강도, 가역성 또는 비가역성 여부에 따라 자극성 또는 부식성 영향으로 구분된다. 피부 자극성/부식성 in vivo 연구에서는 시험 물질이 4시간 동안 실험동물의 피부에 단일 용량을 처리한 결과이며, 실험동물은 주로 알비노 토끼가 사용된다.
REACH 부속서 Ⅶ과 Ⅷ에 따르면, 피부 자극성/부식성에 대해 부속서 Ⅶ(1~10톤)에서는 in vitro 시험75)만을 요구하고 있다. 대체시험법으로 물질 분류를 결론 내릴 수 있거나 물질이 자극성 또는 부식성 물질로 분류되어 있지 않다면, 10톤 이상의 물질 등록에서는
75) EU REACH 부속서 Ⅶ에 따르면, 이용 가능한 정보를 근거로 피부 자극성/부식성 분류가 가능하거나, 물질이 실온에서 인화성인 경우, 또는 물질이 피부와 접촉 시 고독성인 경우, 또는 경피급성독성에서 한계투여량 (2,000㎎/㎏ 체중)까지 피부 자극이 없을 경우에는 in vitro 시험이 필요 없음(자료: EEA(2006), p.178:
환경부, 국립환경과학원 REACH 대응추진기획단, 2007, pp.70-71에서 재인용).
추가적으로 확실한 in vivo 연구결과를 요구한다.
REACH에서의 표준정보 요구사항을 충족하는 대체시험법에는 예측방법, 증거 가중치 접근법, 부속서 Ⅶ, Ⅷ 2열에 따른 정보 요구사항 적용 가능성이 포함된다. 화학물질의 물리 화학적 특성(강산/강염기, 자발적 인화성 여부 등)에 따라서도 자극 또는 부식을 일으킬 가능성이 예측될 수 있다. 부속서 Ⅺ 1.4에 따르면, 등록자는 in vitro 연구결과를 기반으로 한 in vivo 연구에 대한 표준정보 요구사항을 적용할 수 있다. 하나의 in vitro 연구는 오직 피부 부식성 및 피부 자극성의 잠재력만 나타내므로, 첫 번째로 수행된 연구결과를 기반으로 전체 종말점을 나타내기 위해서는 단계적 시험전략이 필요할 수 있다.
피부 부식성/심한 자극성 결과값을 얻기 위한 in vitro 시험법으로는 TER(Trans- cutaneous Electrical Resistance)시험, 인체피부모델시험, 방어막시험(Membrane Barrier)과 같은 EU TMR/OECD TG 표준 프로토콜을 들 수 있으며, 피부 자극성에서는 RHE(Reconstructed Human Epidermis) 방법으로 동물시험을 대체하는 효과를 얻을 수 있다.
<부록 그림 1-2>에서와 같이, in vitro 연구에서 1,000톤 이상의 기존 화학물질의 제출 서류는 총 443건으로, 그중 시험연구가 339건으로 전체의 76.5%를 차지하고, 나머지는 Read-Across와 증거 가중치가 각각 12.6%, 10.2%를 차지하고 있으며 QSAR로 제출된 건수는 없다.
100~1,000톤 기존 화학물질의 서류는 총 684건이었으며, 시험연구는 479건(70%)에 사용되었으며, Read-Across 접근법은 118건(17.3%)이 입력되어 두 번째로 흔히 사용되는 접근법으로 나타났다. 82건(12.0%)에서는 증거 가중치가 사용되었으며, 3명의 등록자는 연구면제를 사용하였다.
100톤 이상의 신규 물질에서는 총 35건의 ESR이 제출되었으며, 주로 시험연구(82.9%)와 Read-Across(14.3%)가 사용되었다.
자료: ECHA(2014), pp.42-43 참조하여 재구성.
<부록 그림 1-2> EU REACH 등록서류 시험항목 분석: 피부 자극성(in vitro)
In vivo 피부 자극성의 경우, <부록 그림 1-3>에서와 같이 1,000톤 이상 기존 화학물질 등록서류에서는 전체 6,676건 중에서 67.1%에 해당되는 4,482건의 시험연구가 제출되었고, Read-Across는 1,376건(20.6%)에 달했다.
100~1,000톤 기존 화학물질의 in vivo 연구에 대한 서류는 총 4,198건이었다. 시험연구는 2,035건(48.5%)이 사용되었으며, Read-Across 접근법은 1,163건(27.7%)으로 두 번째로 흔히 사용되는 접근법이었다. 630건(15.0%)에서는 증거 가중치가 사용되었고, 302건(7.2%) 에서는 연구면제를 제출하였으며, 47건(1.1%)의 QSAR 자료도 제출되었다.
100톤 이상 신규 화학물질에서는 총 347건의 ESR이 제출되었으며, 시험연구 208건 (59.9%), Read-Across 65건(18.7%), 증거 가중치 42건(12.1%)를 포함하고 있다.
자료: ECHA(2014), pp.42-43 참조하여 재구성.
<부록 그림 1-3> EU REACH 등록서류 시험항목 분석: 피부 자극성(in vivo)
다. 심한 눈 손상/눈 자극성
심한 눈 손상/눈 자극성 연구는 사람의 눈에 시험물질을 단회 노출하였을 때의 국부 영향을 예측하는 것으로, in vivo 시험은 EU TMR/OECD TG 표준 프로토콜에 따라 수행된다.
피부 자극성/부식성과 같이 알비노 토끼를 대상으로 하며, 시험동물의 눈에 시험물질을 24 시간 단회 투여량만큼 노출시키며 72시간에 걸쳐 관찰한다.
심한 눈 손상 또는 눈 자극성을 일으킬 가능성이 있는 물질이 in vitro 시험법을 이용하여 분류할 수 있거나 눈 자극성 또는 부식성(강산, 강염기, 상온에서 가연성) 물질로 분류되어 있지 않았다면, 부속서 Ⅶ에 따라 10톤 이하에서는 in vitro 시험을 사용하여 평가될 수 있고, 10톤 이상에서는 in vivo 시험을 해야 한다.
심한 눈 손상/눈 자극성에 대한 대표적인 in vitro 시험법으로는 BCOP(Bovine Corneal Opacity and Permeability), ICE(Isolated Chicken Eye), Fluorescein Leakage 시험법 등이 있다.
<부록 그림 1-4>와 같이 눈 자극성에 대한 in vitro 시험 건수는 in vivo 시험(부록 그림 1-5 참조)에 비해 훨씬 적어서 1,000톤 이상 기존 화학물질에서는 총 250건에 불과하며, 거의 시험연구(78%) 결과이며, Read-Across와 증거 가중치가 각각 10.4%, 7.6%를 차지 하고 있다. 1차 등록과 비교해 볼 때, 2차 등록에서의 1,000톤 이상 물질에 대한 서류 건수는 30% 정도 증가하였고, 시험연구가 8.6% 감소하였고, Read-Across와 증거 가중치는 3.4%와 4.7% 각각 증가하였다.
100~1,000톤 기존 화학물질 서류는 in vitro 연구에 대해 총 500건으로 합계되었다.
그중 실험연구는 348건(69.6%)이었으며, Read-Across는 93건(18.6%)로 두 번째로 많이 사용되었다. 이와 같은 비율은 1차 등록 때보다 전체적인 서류 수는 대체로 증가했으나, 전체 구성 면에서 유사한 경향을 보이고 있다.
100톤 이상 생산된 신규 화학물질 중 in vitro 눈 자극성 정보제출은 28건에 불과하였다.
자료: ECHA(2014), pp.42-45 참조하여 재구성.
<부록 그림 1-4> EU REACH 등록서류 시험항목 분석: 눈 자극성(in vitro)
in vivo 시험은 10톤 이상 기존 화학물질이면 수행해야하기 때문에, 앞서의 in vitro 시험보다는 제출 건수가 크게 증가한다. <부록 그림 1-5>에서와 같이 1,000톤 이상의 기존 화학물질은 총 5,254건에 달하며, 이중 과반수 이상인 66.2%가 시험연구결과를 포함하고 있다. Read-Across는 1,116건(21.2%), 증거 가중치는 315건(6%)이며, 연구면제는 232건이 신청되었다.
100~1,000톤 간의 기존 화학물질에 대한 in vivo 시험항목 제출서류는 총 3,691건이며, 이중 시험연구가 1,861건(50.4%)이었고 982건(26.6%)은 Read-Across 접근법으로 사용 되었다. 이 결과를 1차 등록과 비교해 볼 때, 제출된 ESR의 수가 3,167건 증가하였으며, 시험연구는 15.0% 감소, Read-Across는 7.1% 증가되었음을 확인할 수 있었다.
100톤 이상의 신규 화학물질은 299건의 ESR이 제출되어 이전의 보고서와 비교하여 50% 정도가 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이 중 시험연구 건수는 181건, Read-Across 65건 이었으며, 이 수치는 1차 등록에 비해 각각 15.5%와 10.3% 증가하는 경향을 나타내고 있다.
자료: ECHA(2014), pp.42-45 참조하여 재구성.
<부록 그림 1-5> EU REACH 등록서류 시험항목 분석: 눈 자극성(in vivo)
라. 피부 과민성
피부 과민성은 반복 노출을 통해 알레르기성 접촉 피부염을 유발하는지를 확인하는 시험 이며, 이용 가능한 정보를 통해 피부 과민성으로 충분히 분류되었거나 또는 강산, 강염기, 인화성일 경우에는 in vivo 시험을 할 필요가 없다. 국제적인 표준시험방법으로는 LLNA (Murine Local Lymph Node Assay), GPMT(Guinea Pig Maximisation Test), Occluded Patch Test of Buehler 방법이 있다.
LLNA 시험은 마우스의 귀에 시험물질을 3일간 노출시킨 후 3중수소방사성티미딘 (Tritiated Radioactive Thymidine)을 주입하여 림프절의 세포증식을 측정하는 방법으로, 대조군에 비해 증가된 림프절 세포 여부를 통해 과민성을 확인하는 방법이다.
GPMT 방법은 우선 기니피그에 피내주사로 시험물질을 유도 노출시킨 후, 폐색 (Occlusion)을 통한 국소 적용을 한다. 휴식기간(보통 10~14일) 후 유발농도(Challenge Dose)를 24시간 동안 진피에 주입하고, 대조군과 유발노출 동안의 피부반응 정도 및 면적을 비교하여 과민성 여부를 결정한다.
Buehler 시험은 폐색 하에서 국소 적용을 통해 기니피그에 시험물질을 반복적으로 유도 노출시키고, 12일의 휴식기간 후 폐색조건에서 진피를 통한 유발노출을 실시하는 방법이다.
이들 3가지 시험법 중에서 가장 우선적으로 고려되어야 할 in vivo 시험법은 피부 과민성 유발 예측력이 타 시험법에 비해 우수한 LLNA 방법이다.
이들 3가지 시험법 중에서 가장 우선적으로 고려되어야 할 in vivo 시험법은 피부 과민성 유발 예측력이 타 시험법에 비해 우수한 LLNA 방법이다.