1. 서론
폴리테트라 플루오르에틸렌(PTFE)는 생체재료에 널리 사용되는 고분자 중 하 나로 현재 혈관보철지지체나 신경재생용 관형 지지체로서 구강 악안면 수술에 사용되고 있다 [69-70]. 특히 공극이 확장된 폴리테트라 플루오르에틸렌 (e-PTFE)은 우수한 유연성, 열안정성, 화학저항성으로 생체재료의 적용면에서 가장 매력적인 고분자 중 하나로 알려져 있다 [71]. 일반적으로 e-PTFE 막은 혈 전 보호 및 골세포의 결함으로 이주하는 상피 조직을 예방, 골 결손 부분을 다 시 채우기 위한 일종의 기계적 멤브레인으로 사용된다 [72]. 그러나 e-PTFE의 불활성 특성은 주변 세포 부착이 어려워 주변 조직과의 낮은 친화력을 보인다고 알려져 있다 [73]. 이러한 e-PTFE의 표면의 소수성을 개선하기 위해 수산기, 카 르복실기, 아미노기와 같은 친수기를 도입하는 많은 표면개질 연구들이 진행 되 어왔다 [74,75].
플라즈마 중합은 재료표면에 친수기를 도입하는 대표적인 표면개질법 중 하나 이다. 플라즈마 중합하는 동안 모노머는 활성기체 상태로 이온화되고 재조합 되거나 고분자 표면에 가교 구조를 형성하기 위해 중합되고 플라즈마에 의하여 표면 개질된 고분자 표면은 표면 친수성, 부착, 재료선택성 및 생체적합성 등의 필요 특성을 달성할 수 있다 [76,77].
대기압 플라즈마에는 아크방전, 코로나방전, 유전체장벽방전 등이 있으며, 아 크방전 플라즈마나 코로나방전 플라즈마에서 발생되는 높은 온도는 생체재료 표 면개질에 적용하기에는 부적합하다 [78]. 대기압 플라즈마는 여러 가지 면에서 저압 플라즈마의 단점을 극복 할 수 있다 [79-81]. 고가의 진공 장비 및 챔버가 필요 없고 고분자 표면에 열 손상을 최소화하며 낮은 온도에서 발생한다 [82].
따라서 본 연구에서는 e-PTFE를 유전체장벽방전 대기압 플라즈마 중합을 통하 여 표면 개질한 후 표면 특성과 in vitro 생물학적 평가를 하였다.
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-2. 실험재료 및 방법
1) 실험재료
e-PTFE는 THINK GRAFT로부터 구입하였다. e-PTFE는 1 × 1 cm2로 자른 후 실험 에 사용되기 전까지 아세톤을 이용하여 10 분 동안 세정하였고, 하루 동안 실온 에서 건조하였다. 아크릴산(AA: Acrylic acid)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였 다. 아르곤 가스는 (Argon, purity of 99.5%) 아주산소에서 구입하였고, 본 연 구에서 사용된 대기압 플라즈마 반응장치의 모식도는 Fig.17 에 나타내었다.
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-2) e-PTFE 시편 준비 및 플라즈마 중합
e-PTFE의 플라즈마 중합은 유전체장벽방전 방식의 대기압 플라즈마 장비를 사 용하였고, 운반기체는 아르곤 가스로 분당 5리터(5 L/min)를 흘려주었다.
고분자 중합막을 형성하는 모노머는 아크릴 산(Acrylic acid)을 사용하였고, 모노머 버블링 가스는 아르곤을 사용하였고 유량은 0.4 ml/min로 설정하였다.
플라즈마 방전세기는 200 W이고, 각각 1, 3, 5, 10 분간 중합하였다.
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-3) 표면분석
무 처리 e-PTFE와 플라즈마 중합된 e-PTFE를 준비하여 접촉각을 측정하였다.
각각의 시편을 준비한 후, Ⅱ.실험의 2-4)의 접촉각 측정과 동일하게 측정하였 다.
주사전자현미경(FE-SEM: Field emission scanning electron microscopy, JEM-7500F, JEOL, Japan)을 이용하여 무 처리 e-PTFE의 표면형상과 플라즈마 중 합된 e-PTFE의 표면 형상을 관찰하였다.
화학적 변화를 확인하기 위해 전반사 퓨리에 변환 적외분광(ATR-FTIR:
Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy)을 이 용하였다.
원자 힘 현미경(AFM: Atomic force microscopy)을 이용하여 표면의 삼차원 이 미지와 표면 거칠기의 값을 측정하였다.
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-4) 생물학적 평가
본 실험에서는 세포의 배양, 증식, 초기부착, live and dead cell assay를 실시하였고 방법은 Ⅱ. HDPE 지지체의 저압 플라즈마 표면 개질 part에서 실험 2-5, 6, 8. 10 과 동일한 방법으로 평가하였다.
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-5) 통계학적 분석
모든 실험 데이터는 Ⅱ. HDPE 지지체의 저압 플라즈마 표면 개질 part에서 2-13과 동일하게 평가하였다.
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-Fig. 16. (a) Structural formula of e-PTFE and (b) photograph.
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-Fig. 17. Schematic diagram of atmospheric pressure DBD plasma equipment.
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-3. 실험결과
1) 표면특성
Fig. 18는 주사 전자 현미경으로 15 kv에서 500배의 배율로 각각 무 처리, 1, 3, 5, 10분 동안 중합한 e-PTFE 지지체의 표면 형상을 측정한 결과이다. 다공성 의 구조를 가지는 e-PTFE 지지체는 플라즈마 중합 시간이 1, 3, 5 분 동안 중합 한 그룹에서는 표면 형상이 크게 변화되지 않았지만 10 분 동안 플라즈마 중합 후에는 플라즈마 중합막에 의해 e-PTFE 표면이 코팅됨을 관찰 할 수 있었다.
Fig. 19은 플라즈마 중합 시간에 따른 중합 막의 두께의 변화를 알아보기 위 해 실리콘 웨이퍼에 각각 1, 3, 5, 10 분 동안 플라즈마 중합한 후 중합 막의 두께를 FE-SEM을 사용하여 측정한 결과이다. 1 분에서는 11.781 nm, 3 분에서는 41.250 nm, 5 분은 216 nm, 그리고 10 분 동안 플라즈마 중합된 실리콘 웨이퍼 에서는 628 nm로 중합막의 두께가 플라즈마 중합 시간이 증가함에 따라 중합막 의 두께가 점점 두꺼워지는 것을 확인 할 수 있었다.
Fig. 20은 플라즈마 중합 후 표면 친수성의 변화를 확인하기 위해 접촉각 측 정한 결과이다. 무 처리 e-PTFE 지지체의 경우 접촉각이 100 ± 3.37로 측정 되 어 강한 소수성의 표면 특성을 가지고 있으며, 1 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서는 접촉각이 67.52 ± 6.21°로 측정되었고, 3 분은 39.94 ± 3.84°, 5 분은 35.75 ± 5.22°, 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에 서는 11.45 ± 5.03°의 결과를 나타내었으며 플라즈마 중합 시간이 증가함에 따라서 접촉각이 점차 감소하여 친수성이 증가됨을 확인 할 수 있었다.
Fig. 21은 e-PTFE 지지체 표면에 플라즈마 중합 후 표면의 화학적 변화를 알 아보기 위해 전반사 퓨리에 변환 적외분광(ATR-FTIR)으로 측정한 결과이다. 플 라즈마 처리 전에는 e-PTFE 지지체의 고유 C-F 결합만 확인 되었지만, 플라즈마 중합 후에는 플라즈마 중합된 아크릴 산에 의해 카르복실기 피크가 나타남을 확 인 할 수 있었다.
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-Fig. 22는 AFM을 사용하여 측정한 표면의 삼차원 이미지와 거칠기 값을 나타 낸 결과이다. 무 처리 e-PTFE 지지체는 표면의 거칠기가 69.01 nm를 나타내었으 나 5 분, 10 분 동안 플라즈마 중합된 후 e-PTFE 지지체의 표면의 거칠기는 5 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체는 표면의 거칠기가 18.89 nm, 10 분 동 안 플라즈마 중합 된 e-PTFE 지지체는 표면의 거칠기가 16.02 nm로 플라즈마 중 합 시간이 증가함에 따라서 표면의 거칠기가 감소되는 결과를 확인 하였다.
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-Fig. 18. FE-SEM image of (a) pristine, (b) 1 min, (c) 3 min, (d) 5 min, and (e) 10 min plasma-polymerized e-PTFE.
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-Fig. 19. Cross-sectional FE-SEM images of thin film deposited on Si wafer with respect to plasma treatment time; (a) 1 min, (b) 3 min, (c) 5 min, and (b) 10 min.
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-Fig. 20. Water contact angles on the acrylic acid plasma-polymerized e-PTFE membrane with respect to plasma treatment time.
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-Fig. 21. ATR-FTIR spectra of (a) pristine, (b) 1 min, (c) 3 min, (d) 5 min, and (e) 10 min plasma-polymerized e-PTFE.
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-Fig. 22. 3D topography images of (a) pristine, (b) 5 min, and (c) 10 min plasma-polymerized e-PTFE.
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-2) 생물학적 평가
Fig. 23은 주사전자현미경으로 무 처리 e-PTFE와 5 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체와 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서의 조골모세포 의 초기부착의 변화를 알아보기 위해 각각의 지지체에 세포를 분주한 후 10 분 후 조골모세포의 형상을 관찰한 결과이다. 화살표는 조골모세포를 나타내며, 무 처리 e-PTFE 지지체에서는 조골모세포가 원형의 모습을 하며 표면에 부착이 잘 되어 있지 않지만 5 분, 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체 표면에서 세포들이 지지체에 부착되어 퍼져있는 모습을 확인 할 수 있었다. 특히 플라즈 마 중합 시간이 5 분인 e-PTFE 지지체에서보다 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서 우수한 세포 부착 효과를 나타내었다.
Fig. 24은 무 처리 e-PTFE 지지체와 5 분 및 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서의 조골모세포 증식의 차이를 알아보기 위해 MTT assay를 이 용하여 관찰한 결과이다. 1 일 차에서는 무 처리 e-PTFE 지지체에서의 세포를 기준으로 하였으며 5 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체와 10 분 동안 플 라즈마 중합된 e-PTFE 지지체를 각각 1 일, 3 일 동안 증식을 비교하였다. 1 일 차의 무 처리 e-PTFE 지지체에서 보다 5 분, 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서 더 높은 세포 증식율을 보였다. 3 일 차에서 무 처리e-PTFE 의 세포는 1 일 차보다 세포증식이 감소한 결과를 나타낸 반면에 5분, 10 분 동 안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서는 배양 기간이 증가하면서 유의성 있게 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 또한 3 일차에서 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE에서 가장 높은 세포 증식율을 보였다. 초기 부착의 결과에서와 같이 세 포증식 역시 플라즈마 중합 시간이 증가할수록 우수한 세포증식을 나타냄을 확 인 할 수 있었다.
Fig. 25는 무 처리, 5 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체와 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서 살아있는 세포를 시각적으로 관찰 할 수 있 는 live and dead cell assay를 한 결과로서 플라즈마 중합되지 않은 e-PTFE 지 지체 표면에서는 살아있는 세포가 거의 관찰되지 않았으며 5 분 동안 플라즈마
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-중합된 e-PTFE 지지체와 10 분 동안 플라즈마 -중합된 e-PTFE 지지체에서는 많은 수의 살아있는 세포를 관찰 할 수 있었다. 특히 10 분 동안 플라즈마 중합 된 e-PTFE에서 가장 많은 수의 세포를 관찰 할 수 있었다.
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-Fig. 23. Cell attachment images of MC3T3-E1 cell seeded on (a) pristine, (b) 5 min, and (c) 10 min plasma-polymerized e-PTFE.
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-Fig. 24. The proliferations of MC3T3-E1 cells seeded on pristine and plasma-polymerized e-PTFE for 1 and 3 days.
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-Fig. 25. Live and dead cell images of the MC3T3-E1 cells seeded on (a) pristine, (b) 5 min, and (c) 10 min plasma-polymerized e-PTFE.
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-4. 고찰
1) 표면특성
주사 전자 현미경으로 플라즈마 중합 전 e-PTFE 지지체와 플라즈마 중합 후 e-PTFE의 표면 형상을 관찰한 결과 플라즈마 처리 전에는 일정한 기공을 가진 e-PTFE의 표면이 1, 3, 5 분 동안 플라즈마 중합하였을 때는 크게 표면 형상의 변화가 없었으나, 10 분 동안 플라즈마 중합 후에는 아크릴 산에 의해 기공을 뒤덮는 막을 생성됨을 확인 하였다. 이는 플라즈마 중합에 의해 아크릴 산이 코 팅되었음을 알 수 있다. 이러한 현상에 대해 Chen-Yang 등 (2004)은 플라즈마 중합하는 동안 고분자 박막이 재료표면에 증착되었기 때문이라고 보고하였다 [83]. 플라즈마 중합 시간이 증가함에 따라 중합막 두께가 1 분 중합 시 11.78 nm, 3 분 중합 시 41.25 nm, 5 분 중합 시 216 nm 10분 중합 시 628 nm로 증가 함을 확인 할 수 있었다. 접촉각 측정 결과에서 무 처리 e-PTFE 지지체의 표면 은 약 100°정도의 높은 소수성의 특징을 나타내었지만 각각 1, 3, 5, 10 분 동 안 중합한 e-PTFE 지지체의 표면은 플라즈마 시간이 증가함에 따라 100 ± 3.37°에서 각각 67.52 ± 6.21°, 39.94 ± 3.84°, 35.75 ± 5.22 °, 11.45
± 5.03°로 친수성이 증가함을 확인 하였다. 이에 대해 Njatawidjaja 등 (2006)은 아크릴 산 농도가 높아지면 접촉각이 감소한다고 보고하였다 [84]. 아 크릴 산이 플라즈마 중합에 의해 코팅되는 것은 주자 전자 현미경 외에 화학적 분석인 전반사 퓨리에 변환으로 확인 할 수 있었다. 플라즈마 처리 전에는 e-PTFE 지지체의 고유의 C-F 결합이 각각 1202 cm-1, 1147 cm-1 피크에서 나타났 고, 아크릴 산의 카르복실기(C=O)가 나타나지 않았으나, 플라즈마 중합된 모든 그룹에서는 카르복실기 1716 cm-1 의 피크에서 나타남을 알 수 있었다. Okubo 등 (2010)에 의하면 카르복실기가 없던 소수성의 e-PTFE의 표면에 플라즈마 중합을 통하여 카르복실기가 나타났기 때문이며, 이 카르복실기가 표면의 친수성을 증 가 시켰기 때문이라고 보고하였다 [85]. 아크릴 산에 의해 중합된 e-PTFE 표면
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-은 원자 힘 현미경으로 2×2 ㎛2의 면적을 측정한 결과 표면이 무 처리 e-PTFE 지지체 표면 거칠기가 69.01 nm에서 5, 10분 동안 중합한 후에는 18.89 nm, 16.02 nm으로 거칠기가 감소하였다. Gupta 등 (2010)은 플라즈마 중합 막에 의 해 표면의 거칠기가 플라즈마 중합이 거친 재료표면에 중합 막을 형성하면서 거칠기가 감소했기 때문이라고 보고하였다 [86].
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-2) 생물학적 평가
플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체의 생체적합성을 평가하기 위해 생물학적 평가 로서 세포부착 및 세포 증식을 평가하기 위해 전자 현미경으로 세포 초기부착 관찰하였고, MTT assay, live and dead cell assay를 사용하여 세포 증식을 조 사 하였다. 세포 부착을 전자 현미경으로 관찰한 결과 무 처리 e-PTFE 지지체 표면에서 조골모세포는 위족이 거의 형성되지 않고 원형의 모양을 유지하였다.
하지만 플라즈마 중합하였을 시 조골모세포가 위족을 형성하며 원형모양 대신 재료 표면에 세포가 퍼져있는 모습이 관찰되었으며 특히 10 분 동안 플라즈마 중합된 e-PTFE의 표면에서는 조골모세포가 완전히 재료표면에 점착되어있음을 확인 할 수 있었다. Wang 등 (2009)과 Wang 등 (2010)에 의하면 표면의 C-O 와 C=O 화학결합이 조골모세포 부착에 긍정적인 영향을 미친다고 서술하였다 [87,88]. 세포 생존과 증식을 알아보기 위해 각각 MTT assay와 live and dead cell assay를 관찰 하였다. 각각의 지지체에서 조골모세포의 세포증식의 변화를 알아보기 위해 MTT assay를 관찰 한 결과에서 배양 후 1 일 차에서는 무 처리 e-PTFE 지지체보다 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서 조골모세포의 증식이 유 의성 있게 차이가 났으며, 3 일 차에는 무 처리 e-PTFE에서 세포 증식율이 1 일 차에 비해 감소한데 반해 플라즈마 중합된 e-PTFE 지지체에서는 1 일 차의 플라 즈마 중합된 e-PTFE에서보다 더 높은 세포 증식율을 보여줌으로써 플라즈마 중 합된 e-PTFE에서 조골모세포의 증식이 증가되었다.
또한 live and dead cell assay의 결과에서도 무 처리 e-PTFE는 살아 있는 세 포가 거의 관찰되지 않았으나, 플라즈마 처리 된 e-PTFE에서는 점점 많은 수의 살아있는 조골모세포를 확인할 수 있었다. 특히 5 분 보다 10 분 동안 중합하였 을 때 훨씬 세포 생존력이 증가함을 알 수 있는데 이 결과는 Kunzler 등 (2007) 과 Cai 등 (2002)에 의하면 표면 지형, 친수성과 표면 화학물질은 표면위의 조 골세포의 반응에 영향을 끼친다고 보고하였다 [89-90].