척하고 horseradish peroxidase(HRP) conjugated anti-mouse IgG antibody (New
England Biolab, USA) 또는 anti-rabbit IgG antibody(New England Biolab, USA)를 처리하여 실온에서 40분간 반응시킨 후 TBST 용액으로 10분간 3회 세 척하였다. 결과를 확인하기 위해 chemiluminescence 기질액인 sloution Ⅰ과 solution Ⅱ(Amersham Pharmacia Biotech, UK)를 동량 섞어 nitrocellulose paper 에 1분간 처리한 후 cassette(Kodak, USA)내에서 X-ray film(Amersham Pharmacia Biotech, UK)에 5분간 노출시키고 암실에서 현상액에 1분간 담근 후 현상하였다.
제 3 장 결 과
1. 전자현미경을 이용한 HT-29 spheroid 세포의 관찰
완전한 spheroid 세포를 얻기까지는 보통 3일 정도가 소요되며 이런 과정을 통해서 얻은 것을 주사현미경을 통하여 관찰한 결과 1 ㎜ 정도의 in vivo의 암형 태의 spheroid 세포를 생성하였음을 알 수 있었다. 또한 그 spheroid 세포는 많은 단층세포들이 집적되어 공의 형태를 이룬 작은 spheroid 세포들의 집합체라는 것 을 확인할 수 있었다. 각각의 작은 spheroid 세포들은 그 크기와 형태는 대개 유 사하였다. 그리고 조직에서 볼 수 있는 세포간의 연접부(juction)처럼 spheroid 세 포에서도 세포와 세포들간에는 접촉이 잘된 조직의 모습으로 관찰되었다 (Figure 1-A, B).
또한 투사전자현미경을 이용한 관찰에서 spheroid 세포의 중심부와 주변부가 성장분화의 차이에 의해 형태적으로 다양한 세포들이 분포되어 있어 조직과 유사 한 구조를 나타냈으며, 세포안의 구조물들은 정상적으로 잘 발달된 형태를 나타냈 다. 또한 핵의 상태를 관찰한 결과 세포의 분화가 정상적으로 잘 이루어진 것을 알 수 있었고, 세포와 세포간의 연접부(juction)도 정상적으로 이루어져 전체적인 형태는 조직에서 나타나는 특징과 유사하게 나타났다 (Figure 1-C, D).
Figure 1. Scanning electron micrographs(A,B) and Transmission electron micrographs(C,D) of HT-29 spheroid cells. A(x75), B(x750), C(x6,000), D(x6,000)
A B
C D
`
2. DNA fragmentation analysis
HT-29 spheroid 세포에서 arsenic trioxide와 taxol이 apoptosis를 유도하는지 의 여부를 HT-29 단층세포에서의 결과와 비교하고자 세포에 arsenic trioxide를 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM의 농도로 처리하고, taxol을 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM의 농도로 처리하였다. 또한 병행처리시에는 arsenic trioxide 20 μM에 taxol을 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM의 농도로 처리하였다. 처리후 48시간후 에 DNA를 분리하여 1.8% agarose gel electrophoresis를 실시하여 DNA 분절을 확인하였다. Arsenic trioxide를 처리한 단층세포에서는 10 μM의 농도에서부터 DNA의 분절이 보였으나 spheroid 세포의 경우는 처리군의 가장 높은 농도인 30 μM에서도 DNA의 분절이 보이지 않았다(Figure 2). 또한 taxol을 처리한 단층세 포에서는 100 nM의 농도에서부터 DNA 분절이 보였으나 spheroid 세포의 경우는 미약한 DNA 분절 형태를 관찰할 수 있었다(Figure 3). 그리고 두 약제를 동시에 처리한 경우에서는 단층세포의 경우 taxol만 처리한 것에 비해서 그 DNA 분절의 성향이 많이 감소하는 것을 나타내었고 spheroid 세포의 경우에서는 DNA 분절형 태를 관찰할 수 없었다(Figure 4).
Figure 2. Analysis of DNA fragmentation on HT-29 monolayer cells (A) and HT-29 spheroid cells (B) treated with arsenic trioxide for 48 h. lane M, DNA 100 bp marker ; lane 1, control ; lane 2, 10 μM arsenic trioxide ; lane 3, 20 μM arsenic trioxide ; lane 4, 30 μ M arsenic trioxide.
M 1 2 3 4
A
M 1 2 3 4
B
B
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
A B
Figure 3. Analysis of DNA fragmentation on HT-29 monolayer cells (A) and HT-29 spheroid cells (B) treated with taxol for 48 h. lane M, DNA 100 bp marker ; lane 1, control ; lane 2, 50 nM taxol ; lane 3, 100 nM taxol ; lane 4, 200 nM taxol ; lane 5, 400 nM taxol.
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
A B
Figure 4. Analysis of DNA fragmentation on HT-29 monolayer cells(A) and HT-29 spheroid cells(B) treated with the combination of arsenic trioxide and taxol for 48h. lane M, 100 bp DNA marker ; lane 1, control ; lane 2, 20 μM arsenic trioxide and 50 nM taxol, lane 3, 20 μM arsenic trioxide and 100 nM taxol ; lane 4, 20 μM arsenic trioxide and 200 nM taxol
; lane 5, 20 μM arsenic trioxide and 400 nM taxol.
3. HT-29 monolayer cells과 spheroid cells에서의 taxol
Figure 5. Cytotoxic effects of taxol on the monolayer and the spheroid of HT-29 cells. The cells were incubated with indicated concentraton of taxol for 48h.
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25 30
Taxol concentration (nM)
cell survival(%)
Monolayer Spheroid
Figure 6. Cytotoxic effects of arsenic trioxide on the monolayer and spheroid of HT-29 cells. The cells were incubated with indicated concentraton of arsenic trioxide for 48h.
0 20 40 60 80 100
0 10 20 30 40 50 60 70
Arsenic trioxide concentration (uM)
cell survival(%)
Monolayer Spheroid
Figure 7. Cytotoxic effects of 20 uM arseinc trioxide with various
4. DAPI stain을 통한 HT-29 spheroid 세포의 핵염색
48 well microplate에서 배양된 spheroid 세포를 동결박절하여 DAPI stain을 통해서 형광현미경으로 관찰한 결과 형광이 spheroid 세포의 내부에서는 보이지 않고 표면부분에서만 관찰되었다(Figure 8). 이 결과를 통해서 DAPI 분자가 spheroid 세포의 내부로는 침투되지 못하였다는 것을 추측할 수 있었다.
A
B
Figure 8. DAPI staining of HT-29 spheroid cells. The spheroid cells were fixed and stained with DAPI and viewed by light (A) and epifluorescence (B) microscopy under 400 × magnification.
5. MAP Kinase(Mitogen-activated protein kinase)의 활성확인
HT-29 monolayer와 spheroid 세포에서의 taxol과 arsenic trioxide에 의한 MAPK의 활성을 확인하였다. 먼저 100 nM taxol을 처리한 경우에는 monolayer와 spheroid 세포에서 모두 ERK1/2가 점차로 활성을 나타내어 30분을 기점으로 그 활성이 감소하는 것으로 나타났다(Figure 9). 그리고 20 μM arsenic trioxide를 처 리한 경우에는 monolayer 세포에서는 10분에서 최대활성을 나타내고 점차 감소하 는 것으로 나타났으며 spheroid 세포에서는 30분에서 최대 활성을 나타내고 점차 로 감소하는 것으로 나타났다(Figure 10). 마지막으로 100 nM taxol과 20 μM arsenic trioxide를 병행처리한 군에서도 역시 monolayer 세포에서는 10분에서 최 대활성을 나타내고 점차 감소하는 것으로 나타났으며 spheroid 세포에서는 30분에 서 최대활성을 나타내고 점차 감소하는 것으로 나타났다(Figure 11). 그리고 모든 처리군에서 p38과 JNK는 활성을 나타내지 않았다(data not shown).
C 10 30 60 120 (mins)
p-MAPK ⇉
MAPK ⇉
Monolayer Spheroid
C 10 30 60 120 (mins)
Figure 9. Immunoblotting analysis of ERK1/2 activation by taxol on the monolayer and the spheroid HT-29 cells. HT-29 cells were treated with 100 nM taxol.
p-MAPK ⇉
MAPK ⇉
Monolayer Spheroid
C 10 30 60 120 (mins)
C 10 30 60 120 (mins)
Figure 10. Immunoblotting analysis of ERK1/2 activation by arsenic trioxide on the monolayer and the spheroid HT-29 cells. HT-29 cells were treated with 20 μM arsenic trioxide.
p-MAPK ⇉
MAPK ⇉
C 10 30 60 120 (mins)
C 10 30 60 120 (mins)
Figure 11. Immunoblotting analysis of ERK1/2 activation by arsenic trioxide and taxol on the monolayer and the spheroid HT-29 cells. HT-29 cells were treated with the combination of 20 μ M arsenic trioxide and 100 nM taxol.
Monolayer Spheroid
제 4 장 고 찰
위하여 collagen-gel 배양, mash-supported organoid 배양(histoculture), multicellular spheroid 배양 등의 3차원적 특성을 나타내는 세포배양 모델이 개발결과 형성된 spheroid 세포는 직경이 1 mm에 이르는 크기의 구상체 형태이었으
HT-29 human colorectal cancer에서 taxol과 arsenic trioxide에 의한 MAP kinase pathway의 활성을 확인한 결과 monolayer 세포와 spheroid 세포 모두에서 ERK1/2의 활성을 관찰할 수 있었다. 그 활성이 10분부터 나타나서 30분에 최대 활성을 나타내다가 점차로 감소하는 성향을 나타내었다. 그러나 p38과 JNK의 경 우는 활성을 나타내지 않았다. 특이하게도 spheroid 세포에서는 control에서도 ERK1/2의 활성이 관찰되었다. 이것은 spheroid 세포를 형성하는 과정에서 영양분 고갈로 인해서 spheroid 세포에 스트레스를 주게되어 ERK1/2를 활성시킨것으로 생각된다.
이상의 결과를 통해서 HT-29 human colorectal cancer의 단층세포에서와 고 형암의 특성에 더욱 근접한 spheroid 세포에서의 동일한 실험의 결과가 많은 부분 에서 차이가 나타남을 알 수 있었다. 즉 in vitro 상태에서 단층세포로 실험한 결 과를 in vivo 상태의 고형암에 직접적으로 적용하는데는 문제가 있음을 알 수 있 었다. 따라서 고형암에 대한 항암제의 효과를 연구하기 위해서는 좀 더 in vivo 상태의 고형암의 특성에 근접한 실험모델이 필요하다는 결론을 얻었고 이 실험모 델로서 spheroid 세포를 사용 할 수 있다는 가능성을 확인하였다.
또 DAPI 분자를 이용한 형광현미경 관찰을 통해 얻어진 결과에서 약제의 고 형암내로의 침투가 용이하지 못함이 약제에 대한 내성을 증가시킨다는 추측을 확 인하는 실험이 앞으로 진행되어져야 할 것이다. 또한 이런 차이가 세포신호전달체 계에서 어떤 차이를 나타내는가를 알아보는 실험도 진행되어야 할 것이다.
제 5 장 결 론
5. Taxol과 arsenic trioxide를 처리한후 10분, 30분, 60분, 120분에서 세포내의 MAP kinase가 활성화되는 것을 관찰한 결과 monolayer 세포와 spheroid 세포에서 모두 ERK1/2가 10분에서부터 활성화 되어 30분을 정점으로 점차 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
위의 실험 결과로 볼 때, HT-29 human colorectal cancer cell의 단층세포에 선 taxol과 arsenic trioxide 각각은 세포독성효과를 나타내지만 둘을 병행처리하였 을때는 세포독성효과가 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 spheroid 세포를 이용한 실험을 통해서 단층세포에서 나타난 각 약제의 세포독성효과가 현저하게 줄어드 는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 DAPI stain을 통한 spheroid 세포의 핵을 염색 한 결과를 통해서 각 약제에 대한 저항성이 약제의 spheroid 세포 내부로의 침투 저해에 의한 것이라는 추측을 할 수 있었다.
이상의 결과를 통해서 고형암의 형태를 가지는 HT-29 human colorectal cancar cell의 경우는 단층세포와 spheroid 세포간에 세포독성효과가 크게 차이가 있음을 확인하였고, arsenic trioxide가 taxol의 효과에 길항작용을 나타냄을 알 수 있었다.
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