Ⅲ. 연구결과 및 고찰
4. PFOA 노출에 의한 대사체 분석 결과
다. NMR (Nuclear magnetic resonance)용 시료 준비
완전 건조 된 시료를 중수(D2O, 기준물질 TSP-d4 2 mM 첨가) 700 μL로 녹여서
마. 데이터 분석
정량 및 정성 분석을 위해서 Chenomx NMR suite 7.1 소프트웨어(Chenomx Inc., Canada)를 이용하였다. 1 차원 양성자 NMR 스펙트럼은 푸리에 변환하고 바탕선과 위상을 조정하여 정량 오차를 최소화시켰다. Chenomx를 이용하여 기준물질(3-(trimethylsilyl) propionic-2,2,3,3-d4 acid, TSP-d4) 2 mM를 기준으로 δ를 0 mg/L로 맞추고, 상대농도를 결정하였다. 본 실험에서는 Chenomx의 600 MHz 라이브러리를 이용하여 대사체들을 확인하고 정량하였다.
바. 통계분석
통계분석을 위하여 SIMCA P+ 12.0(Umetrics, Sweden) 소프트웨어를 이용하였다.
0.5 mg/L ~ 10 mg/L 사이의 스펙트럼을 0.01 mg/L 간격으로 구분하고 물 피크가 포함된 4.7 mg/L ~ 4.9 mg/L는 제외시켰다. 구분 자료는 SIMCA를 이용하여, 주성분 분석(Principal component analysis, PCA), 부분최소자승판별 분석(Partial least square-discriminant analysis, PLS-DA), 또한 직교부분 최소 자승판별 분석(Orthogonal partial least square-discriminant analysis, OPLS-DA) 방법으로 분석하였다. 이들 분석법은 모두 스펙트럼의 유사성을 비교하여 그룹화 하였다.
Items TG 229(Fish Short Term Repoduction Assay)
TG 234(Fish Sexual Development Test) Recommended species Medaka (Oryzias latipes)
Test type Flow-through Flow-through or semi-static Water temperature 25 ℃ ± 2 ℃
Illumination quality Fluorescent bulbs
Light intensity 10 μE/M2/s ~ 20 μE/M2/s, 540 lux ~ 1000 lux Photoperiod 12 h ~ 16 h light,
12 h ~ 8 h dark Loading rate < 5 g per L
Test chamber size 2 L(minimum) 7 L(minimum) Test solution volume 1.5 L(minimum)
Volume exchanges of
<Table 4> Comparison of OECD test guideline No. 229 and No. 234
<Table 4> Comparison of OECD test guideline No. 229 and No. 234(Continued)
No. of treatments 3(plus controls) Minimum 3(plus controls) No. of replicates Minimum 4
three times daily(ad libitum)
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc. feed twice daily Aeration > 60 % air saturation
Dilution water Clean surface, well or dechlorinated tap water Pre-exposure period 7 d ~ 14 d recommended
Test substance
exposure duration 60-dph (days post-hatch) Chemical exposure
duration 21 d
Biological endpoints
Survival, behaviour, fecundity, 2nd sex characteristics, VTG, optionally gonadal histopathology values per treatment level.
나. 미국 환경청(EPA)과 일본 국립환경연구소(NIES)의 다세대 노출시험 절차
미국과 일본의 다세대 노출시험 절차를 검토한 결과, 종말점은 산란수, 성비 (표현형/유전형), 부화율, 생존율, 조직분석으로 동일하였다. 단, 시험개체 및 반복구의 차이가 있었다. 시험반복구의 경우, 미국과 일본이 각각 6 반복구와
4 반복구를 사용하였으며, 미국방법을 본 연구에 적용시 공간과 시설적 제약이 수반되었기 때문에, 본 연구에서는 일본과 동일하게 4 반복구를 적용하였다 (Figure 5).
<Figure 5> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in USA and Japan.
다. 다세대 장기노출 시험절차(안) 도출
각 대조군과 노출군의 F0 세대는 건강한 개체를 선택하여 4 개의 수조에 암수 8 쌍으로 나누어 노출시켰다. 3 주간 노출시킨 후 각각의 수조에서 산란율을 파악하고, 4 주차부터 각 수조에서 알을 채란하여 발생을 확인하였다. 채란은 다음 세대 노출에 필요한 개체 수의 세 배수 이상을 채울 때까지 진행하였다.
일주일간 채란한 알은 동일한 농도군을 모두 섞은 후 F1 세대의 치사율을
고려하여 각 농도군당 노출개체수의 3 배인 192 개체(16 마리 × 4 반복 × 3 배)를 각각 배양하였다. 노출이 끝난 F0 세대의 성체는 동결건조하여 대사체분석을 진행하였다. F1 세대는 암수 구별이 될 때까지 사육 후 반복구 당 암수 각각 8 마리씩 남기고 나머지는 폐기하였다. 9 주 ~ 14 주 사이에 비텔로제닌과 조직학적인 변화를 확인하기 위하여 암수 2 쌍을 채취하여 분석하였다. 14 주 이후 F1 세대에서와 동일한 개체수 만큼의 알을 채란한 후 F2 세대 노출을 진행하였고, 노출이 끝난 F1 세대는 유전학적 성별확인과 체내 축적량 측정을 위해 처리하였다. F2 세대 역시 최종 노출 개체수는 F1 세대와 동일하며 산란율을 확인할 수 있는 시기까지 노출을 진행하였다. F2 세대의 경우 체내축적량 확인을 하지 않았기 때문에 비텔로제닌과 조직관찰용 시료를 한 쌍씩 늘려 채취하였다(Figure 6).
<Figure 6> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in this study.
2. 과불화화합물의 노출농도
가. 노출용액 농도분석
PFOA의 노출 설정농도는 0, 0.3, 3, 30 mg/L로 하였고, 매주 노출 시료를 채취하여 LC/MS/MS에 의해 실측농도 값을 측정하여 비교하였다(Figure 7).
각 노출농도 실측값(평균값 ± 표준편차)은 각각 0.28 mg/L ± 0.01 mg/L, 2.84 mg/L ± 0.15 mg/L, 28.45 mg/L ± 1.38 mg/L로 노출기간 동안 모든 농도에서 설정농도대비 80% 이상으로 비교적 안정적으로 유지되었다.
<Figure 7> Exposure concentration of PFOA during test periods.
나. 송사리 체내 PFOA 농도
PFOA에 노출된 송사리 중 F1 세대의 체내 축적량은 Figure 8에 도식화 하였으며 암수에 따른 유의한 차이는 없었다. 체내 축적농도를 노출농도로 나눈 값인 체내농축지수(bioconcentration factors, BCFs) 평균값은 0.3 mg/L 농도군의 암수 각각에서 2.2 L/Kg과 1.8 L/Kg로, 3 mg/L의 암수 모두에서 1.7 L/Kg, 30 mg/L에서 1.4 L/Kg, 1.3 L/Kg으로 확인되었다. EPA에서는 BCFs 값이 1,000 L/Kg 이상일 때 , EU에서는 2,000 L/Kg 이상일 때 생물축적성이 있는
것으로 판단하고 있다23,24. 또한 사례연구 결과에서도 PFOA의 BCFs 값은 PFOS를 포함한 다른 과불화화합물보다 작은 값을 보이는 것으로 보고되었다25,26. 따라서 PFOA는 생물축적성이 없는 것으로 보인다. 그러나 본 연구에서는 F1 세대의 BCFs 값만을 산출하여 다음 세대로의 전이성 확인은 할 수 없었기 때문에 추후 연구에서는 보다 장기간에 거친 다세대 생물축적성 연구가 필요할 것으로 판단된다.
<Figure 8> Cumulative concentration of PFOA in the F1 generation medaka.
3. PFOA 다세대 장기노출 영향
가. F0, F1 및 F2 세대의 산란율 변화
Figure 9a는 각 세대별로 하루에 한 마리의 암컷이 생산하는 평균 산란수를 비교한 그래프이며, Figure 9b는 각 세대별로 대조군 대비 노출농도에 따른 산란율을 비교한 그래프이다. 각 세대에서 대조군을 포함한 모든 노출군의 산란율이 저조하여, 세대에 따른 산란율 변화에 대한 통계적 유의성 확인은 어려울 것으로 판단된다. 그러나 모든 세대의 최고농도 30 mg/L에서 각 세대별 대조군 대비 산란율이 약 50 % 감소하였으며 통계적으로도 유의하였다(p < 0.05).
따라서 고농도의 PFOA가 송사리의 생식능력을 저하시키는 것으로 판단되나 30 mg/L는 환경 중 농도보다 훨씬 높은 수준이며27,28,29 PFOA의 앞의 BCFs
측정 결과에 따르면 생물축적성이 없는 것으로 확인되었기 때문에 일반 수계환경 중에서 PFOA가 어류 생식능력에 미치는 영향은 적을 것으로 사료된다.
한편, 본 연구에서는 다양한 종말점 확인을 위해 노출 개체수를 늘려 한 수조에 개체밀도가 높아졌는데, 이로 인해 개체간 스트레스 증가하여 저조한 산란율을 야기하였을 것으로 보인다. 따라서 추후 연구에서는 개체간의 스트레스를 줄이고 보다 정확한 산란율 산출을 위해 각 수조마다 산란에 필요한 최소 개체의 노출이 필요할 것으로 판단된다.
<Figure 9> Reproductivity of the multi-generation medaka exposed to PFOA.
(a) Average number of eggs per fish a day. (b) Reproductivity compared to control group in each generation.
나. F1과 F2 세대의 부화율 및 치사율 변화
부화율에 있어서 F1, F2 각 세대별 대조군과 각 노출군은 통계학적으로 서로 유의한 차이가 나타나지 않았으며, F1과 F2 세대 간의 유의성 역시 확인되지 않았다(p < 0.05).
자어 생존율의 경우, F1 세대는 대조군과 노출군 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, F2 세대는 농도 증가에 따라 통계적으로 유의한 감소추이를 보였다. 세대간 비교결과 F1 세대에 비해 F2 세대의 자어 생존율이 전반적으로 증가하였으나, 최고농도인 30 mg/L에서는 감소하였다(p < 0.05)(Figure 10).
<Figure 10> Hatchability and sac-fry survival rate of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA.
다. F1과 F2 세대의 암수 성비 및 수컷의 2차 성징
F1 세대는 대조군과 3 mg/L 노출군의 암컷 비율이 수컷에 비해 약 24 ~ 25 % 낮았고, F2 세대에서는 최고농도에서 암컷 비율이 38 % 가량 낮았으나, 통계적 유의성은 없었다(p < 0.05)(Table 5). 또한 16 주차 수컷에서 확인한 2차 성징인 유두상 돌기형성에서도 각 세대에서 대조군 대비 유의한 차이는 없었으며, 세대간 차이 역시 통계적으로 차이가 없었다(p < 0.05)(Figure 11).
<Table 5> Sex ratio of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA Exposure
concentration F1(M:F) F2(M:F) Control 1 : 0.74 1 : 1.00 0.3 mg/L 1 : 1.31 1 : 1.09 3 mg/L 1 : 0.75 1 : 1.16 30 mg/L 1 : 1.33 1 : 0.62
<Figure 11> Second characteristic of the male medaka exposed to PFOA. Number of joint plates with papillary processes(Left). Papillary processes of the male medaka(PP, papillary processes; AF, anal fin)(Right).
라. 비텔로제닌(VTG) 발현량 평가
수컷의 간을 이용한 VTG 발현량은 F1 세대의 대조군에서 13.5 ng/μL로 가장 높게 관찰되었으나, 보통 수컷에서도 일반적으로 확인되는 농도였다.
그밖에 농도 의존적 또는 세대에 따른 유의한 영향이 나타나지 않았다(Figure 12).
<Figure 12> VTG concentrations of the male medaka exposed to PFOA.
마. F1과 F2 세대의 생식소중량지수(GSI), 간중량지수(HSI), 비만도지수(CI) 생식소중량지수, 간중량지수, 비만도지수는 성별 및 노출농도에 따른 통계적 유의성이나 경향성은 확인되지 않았다(p < 0.05)(Figure 13).
<Figure 13> Gonadosomatic index(a,b), hepatosomatic index(c,d), and condition index(e,f) of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA.
바. PFOA 노출에 의한 생식소 조직 영향
송사리 생식소 내 이성생식세포 발생 여부를 조직학적 방법으로 확인한 결과 대조군을 포함한 모든 노출군에서 이성생식세포가 관찰되지 않았다(Figure 14).
즉, 위에서 언급한 표현형적 암수 성비와 VTG 발현량 및 이성생식세포 여부 확인결과 PFOA의 어류 다세대 노출에 따른 내분비계장애 영향은 나타나지 않는 것으로 판단된다.
<Figure 14> Light microscope of female and male gonad in the medaka of control group.
사. PFOA 노출에 의한 생식소 발달단계 영향
송사리 생식소의 발달단계를 각각 4 단계로 구분하여 관찰하였다. 그 결과, F1 세대 암컷 대조군은 성장기 및 성숙기가 분포하고 있었으나, 노출농도가 높아질수록 성숙기로 발달단계가 빨라졌다. F1 세대 수컷 대조군에서는 성숙기가 관찰 되었으나, 노출군에서는 성장기, 성숙기, 완숙 및 방정기 등 다양한 발달단계가 나타났다. F2 세대 암컷의 경우, 대조군에서는 성숙기와 완숙기가 나타났으며, 성숙기가 차지하는 비중이 높았다. 하지만 노출농도가 높아질수록 성숙기보다 완숙기의 발달단계가 더 많은 비중을 차지하였다. F2 세대 수컷 대조군은 성장기가 주로 나타났지만, 농도가 높아질수록 성숙기 발달이 빠르게 나타났다 (Figure 15). 앞서 언급된 세대에 따른 산란율 영향에서 F1 세대의 3 mg/L 노출군과 F2 세대의 0.3 mg/L 및 3 mg/L 노출군의 산란율이 대조군 보다 높게 나타난 원인이 발달단계의 변화와 연관되어 있는 것으로 판단된다.
송사리 생식소의 발달단계를 각각 4 단계로 구분하여 관찰하였다. 그 결과, F1 세대 암컷 대조군은 성장기 및 성숙기가 분포하고 있었으나, 노출농도가 높아질수록 성숙기로 발달단계가 빨라졌다. F1 세대 수컷 대조군에서는 성숙기가 관찰 되었으나, 노출군에서는 성장기, 성숙기, 완숙 및 방정기 등 다양한 발달단계가 나타났다. F2 세대 암컷의 경우, 대조군에서는 성숙기와 완숙기가 나타났으며, 성숙기가 차지하는 비중이 높았다. 하지만 노출농도가 높아질수록 성숙기보다 완숙기의 발달단계가 더 많은 비중을 차지하였다. F2 세대 수컷 대조군은 성장기가 주로 나타났지만, 농도가 높아질수록 성숙기 발달이 빠르게 나타났다 (Figure 15). 앞서 언급된 세대에 따른 산란율 영향에서 F1 세대의 3 mg/L 노출군과 F2 세대의 0.3 mg/L 및 3 mg/L 노출군의 산란율이 대조군 보다 높게 나타난 원인이 발달단계의 변화와 연관되어 있는 것으로 판단된다.