과불화화합물(PFOA)의 어류 다세대 노출 시험방법 구축 및 생체기작 연구
환경건강연구부 위해성평가연구과
김수진, 이병천, 류지성, 류태권, 신유진, 이재우 김지은, 김경태, 이두희, 이재안, 최경희, 김필제
Establishment of test protocol and biomechanisms of PFOA on Medaka
by multi-generation exposure
S.J. Kim, B.C. Lee, J.S. Ryu, T.K. Ryu, Y.J. Shin, J.W. Lee J.E. Kim, K.T. Kim, D.H. Lee, J.A. Lee, K.H. Choi, P.J. Kim
Risk Assessment Division
Environmental Health Research Department National Institute of Environmental Research
2013
목 차
목차 ··· i
표목차 ··· ii
그림목차 ··· iii
Abstract ··· v
Ⅰ. 서 론 ··· 1
Ⅱ. 연구내용 및 방법 1. 다세대 및 장기노출 시험방법 검토 ··· 3
2. 다세대 장기노출 ··· 3
3. PFOA 영향분석 ··· 8
4. PFOA 노출에 의한 대사체 분석 ··· 13
Ⅲ. 연구결과 및 고찰 1. 다세대 및 장기노출 시험방법(안) 제안 ··· 15
2. 과불화화합물의 노출농도 ··· 19
3. PFOA 다세대 장기노출 영향 ··· 20
4. PFOA 노출에 의한 대사체 분석 결과 ··· 28
Ⅳ. 결 론 ··· 33
참고문헌 ··· 34
표 목 차
<Table 1> Exposure period and endpoints of muli-generation toxicity tests ··· 5
<Table 2> Analysis conditions of LC/MS/MS for PFOA ···7
<Table 3> Gonad developmental stage of the medaka ···11
<Table 4> Comparison of OECD test guideline No. 229 and No. 234 ···· 15
<Table 5> Sex ratio of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA ···22
그 림 목 차
<Figure 1> Standard curve for PFOA by LC/MS/MS ···8
<Figure 2> Histological observation of the thyroid gland in the medaka ··9
<Figure 3> Ovarian(a) and testis(b) development stage of the medaka ···11
<Figure 4> Classification of female and the male of the medaka ···12
<Figure 5> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in USA and Japan ·· 17
<Figure 6> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in this study ·· 18
<Figure 7> Exposure concentration of PFOA during test periods ···19
<Figure 8> Cumulative concentration of PFOA in the F1 generation medaka ··20
<Figure 9> Reproductivity of the multi-generation medaka exposed to PFOA ·· 21
<Figure 10> Hatchability and sac-fry survival rate of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA ···22
<Figure 11> Second characteristic of the male medaka exposed to PFOA ·· 23
<Figure 12> VTG concentrations of the male medaka exposed to PFOA ·· 23
<Figure 13> Gonadosomatic index, hepatosomatic index, and condition index of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA ···24
<Figure 14> Light microscope of female and male gonad in the medaka of control group ···25
<Figure 15> Gonad development stage of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA ···26
<Figure 16> Light microscope of thyroid follicle cell of male on the medaka and pathological change in exposed to 30 mg/L PFOA ···27
<Figure 17> Light microscope of thyroid follicle cell of female on the medaka and pathological change in exposed to 30 mg/L PFOA ···27
<Figure 18> Spectral analysis of metabolomic pattern according to gender and concentration using PLS-DA on the medaka exposed to PFOA ··· 28
<Figure 19> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to energy of the medaka exposed to PFOA ··· 29
<Figure 20> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to amino acid concentration of the medaka exposed to PFOA ···30
<Figure 21> Various amino acids related to TCA cycle ···31
<Figure 22> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to nucleic acid of the medaka exposed to PFOA ·· 31
<Figure 23> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to lipid and osmotic pressure of the medaka exposed to PFOA ···32
Abstract
A certain type of chemicals may have adverse effects including endocrine disruption or morphological malformation by bioaccumulation even at low concentrations on a long-term basis. Thus, long-term toxic effects need to be further explored. The objective of the present study was to establish a protocol on long-term exposure and new endpoints by evaluating toxic effects of perfluorooctanoic acid (PFOA) throughout multi-generation of the medaka.
Toxicity test method of multi-generation exposure for fish was prepared by considering exposure protocol, the number of statistically significant testing species and endpoints, etc. Various endpoints were applied in relation to endocrine disruption: mortality, reproduction, hatching, growth rate, the number of reproduction, sex ratio (phenotype), vitellogenin, bioconcentration factors, gonadosomatic index, hepatosomatic index, and histopathology, etc.
The results showed that the PFOA was not bioaccumulative and had no effects of endocrine-disrupting on the medaka. But, there were decrease in the size of cell nucleus in thyroid, change in the gonad development stage histologically, and reduction of reproduction rates of the medaka exposed to the highest concentration (30 mg/L) of PFOA. However, it considered to have no or little effective to the aquatic environment because that concentration was much higher level than in the actual environmental water.
Metabolites for the application of new endpoints related to energy, amino acid, nucleic acid metabolism, and osmotic pressure showed significant effects. Therefore, further studies are need to reconfirm if these metabolites are relevant as new endpoints and to identify the relations between thyroid hormone and the growth of organism.
The new multi-generation procedure (draft) on long-term exposure was found to be suitable, because the exposure concentration was well maintained within the allowable range. But it is need to change of some exposure conditions for fecundity and fertility of test animals.
Ⅰ. 서 론
과불화화합물(Perfluorinated compounds)은 인위적으로 합성된 물질로서 탄소와 불소사이의 강력한 공유결합으로 인하여 열화학적으로 매우 안정하며, 산과 염기와도 반응이 잘 되지 않는 특성으로 인하여 현재 국내·외적으로 주목받고 있는 물질이다1. 또한 물과 기름에 반발하는 독특한 물리화학적 특성과 안정성 때문에 다양한 산업분야와 소비자 제품에 이용되어 왔다2. 하지만, 이러한 특성으로 환경 중 또는 생체 내에서 오랜 기간 동안 잔류함으로써 유해성과 위해성이 우려되는 물질이며3, 특히 과불화화합물 중 PFOS (Perfluorooctane sulfonate) 및 그 염들의 경우 스톡홀름협약의 새로운 대상물질로 지정되었다4.
본 연구의 대상물질인 PFOA (Perfluorooctanoic acid)의 경우 테플론, 종이컵·
음식용기의 코팅제, 반도체 세척, 카페트의 오염방지제, 금속도금, 포장지 및 코팅 첨가제 등과 같이 다양한 용도로 사용되고 있다5,6.
PFOA의 경우 동물에 암을 유발할 우려는 있으나, 인체에서의 발암성 증거는 아직까지 밝혀져 있지 않은 상태이다7. 또한, PFOA에 대한 많은 인체 및 생태 독성 연구들이 보고되고 있으나8, 아직까지 유해성 자료는 충분하지 못한 상황이다.
설치류에서는 혈액중의 단백질과 결합하는 것으로 보고되었고, 동물시험에서는 간독성과 면역독성을 유발하는 것으로 알려져 있다9,10. 따라서 유해영향정도를 규명하기 위해서 다양한 시험을 바탕으로 한 연구가 필요하다고 판단된다.
또한 PFOA는 내분비계 장애물질로 의심되고 있으며, 단백질이나 핵산과 같은 거대분자들과 결합함으로써 수중생물의 비정상적인 발생 및 산란에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다11. 하지만 대부분의 연구가 육상 포유동물을 대상으로 하고 있어 수생태에 미치는 영향에 대해서는 독성학적 정보가 매우 부족하며, PFOA의 장기노출 영향에 대해서는 더욱 부족한 실정이다.
현재까지 경제협력개발기구(OECD)의 어류 내분비계장애 시험법 전문가 회의에서 화학물질의 어류 장기노출에 관해 합의된 관찰항목은 ① 외부 형태적 변화(gross morphology), ② 비텔로제닌(vitellogenin, VTG) 측정 그리고 ③ 생식소의 조직학적 변화(gonadal histology) 등을 포함하고 있다12,13. 형태학적 지표변화에 포함된 항목으로는 생식소중량지수(gonadosomatic index, GSI), 생식소의 외형적 관찰, 성체에서의 2 차 성징 및 간중량지수(hepatosomatic index, HSI), 비만도지수(condition index, CI) 등이 있다.
또한 이러한 다양한 화학물질과 농약류 등에 대한 영향과 원인기작에 대한 연구를 위해서 최근에는 대사체(metabolite) 분석 연구가 활용되고 있다14-16. 대사체 연구는 세포 또는 조직 내 대사체의 거동, 분비 변화 등을 체계적으로 확인․정량하고, 그 결과로부터 대사체군을 다양한 생리․병리적 상태와 연관 지어 대사체 네트워크를 다시 해석하는 방식이다17. 최근에는 진단, 신약개발, 신규 작용점 도출, 약물의 효능과 독성평가 및 생명공학 분야에서 많이 사용되고 있으며, 특히 조기진단을 위한 목적으로 많이 사용되고 있다18.
본 연구에서는 송사리(Oryzias latipes, medaka)를 대상으로 저농도의 PFOA에 2 세대 동안 노출시켰을 때 생식율, 생존율, 성장률, 조직학적 병변 및 내분비계장애 영향 등의 변화를 확인하고 대사체 분석을 이용하여 체내 대사물질의 변화를 확인함으로써 저농도 장기노출에 의한 수생태독성 영향을 파악하고자 하였다
Ⅱ. 연구내용 및 방법
1. 다세대 및 장기노출 시험방법 검토
어류 생식율과 성 발달 관련 OECD 시험지침서의 각 단계별 시험조건 및 미국, 일본의 다세대 노출시험 절차(안)를 비교하여 국내에서 적합한 시험방법을 도출 하고자 하였다. OECD 시험지침서 229 번(Fish short-term reproduction assay)과 234 번(Fish sexual development test)을 비교 분석에 활용하였다.
2. 다세대 장기노출
가. 대상물질 및 노출농도
대상물질은 과불화화합물 중 PFOA (Perfluorooctanoic acid, C7F15COOH, CAS No. 335-67-1)이며, 국내 하천수 중 최대 36 ng/L(남강, 함안, ’12), 폐수처리장에서 최대 200 ng/L(대구, ’12)까지 검출되는 것으로 보고되었다18. 본 연구의 노출농도는 대조군, 0.3, 3, 30 mg/L이며, 농도당 4개의 반복구를 두었다. 노출은 연속노출장치(Sibata Co., Japan)를 이용하여 유수식으로 진행하였다. 노출농도의 수준은 예비시험에서 얻어진 PFOA 60 mg/L에서 치사율 17 %, 부화율 83 %의 결과로부터 결정하였다(최대 노출농도 30 mg/L).
나. 각 세대별 노출 시험조건 (1) 송사리 사육조건
시험어종으로 사용된 송사리(Oryzias latipes, Medaka, Orange-red type)는 국립환경과학원 공시어류 사육실에서 수온 25 ℃ ± 1 ℃, pH 7.5 ± 0.2, 용존산소 7 mg/L ~ 8 mg/L, 광주기 16 시간/8 시간(명/암)의 조건으로 사육하였으며, 갓 부화된 알테미아를 1 일 1 회씩 먹이로 공급하였다.
(2) 2 세대 독성시험 절차
노출농도가 설정된 후 초기 부모세대(Filial 0, F0)의 노출은 각 농도의 반복구당
암·수 4 쌍(8 마리)씩 8 L 유리수조에 4 반복으로 노출시켰으며, 시험은 사육조건과 동일한 조건에서 수행하였다. 연속노출장치는 시험용액이 1 일 2 회 교환되도록 설정하였다. 3 주간 노출 후 1 주일간 채란을 진행하여 대조군 대비 노출군의 산란율을 비교하였다. 노출이 끝난 부모세대는 대사체 분석시료로 사용되었다. 채란된 개체는 6-well plates에 1-well 당 10 개체씩 옮긴 후 1 일 1 회씩 농도별 시험용액을 교환해주며 부화율 및 이상개체 등을 확인하였다.
부화가 완료된 F1 세대(F0의 자손 1 세대)는 8 L 수조로 옮겨 연속노출을 진행하였으며, 자어의 치사 유무를 관찰하였다.
개체의 성별이 육안으로 용이하게 구분이 되는 13 주경에 생물의 성비를 확인하였으며, 암·수 8 쌍(16 마리)씩 채란수조를 마련하여 17 주까지 노출을 지속하며 산란율을 확인하였다. 채란한 알을 이용하여 F2 세대(F0의 자손 2 세대)를 생산하였으며, 18 주에 F1 세대의 시험을 종료하여 전장, 전중 등 개체 특성을 확인하고, 간 등 생체조직을 채취하였다.
F2 세대 역시 초기발생단계에서는 6-well plates에 옮긴 후 1 일 1 회씩 노출용액을 교환하였으며 부화율, 이상 개체 등을 확인하였다. 부화가 완료된 후, 다시 8 L 수조로 옮겨 노출을 진행하며 자어의 치사율을 관찰하였다. 노출 13 주경에 한 수조 당 암·수 8 쌍으로 구성된 채란수조를 마련하였다. 노출 17 주경에 일주일간 채란하여 산란율을 구하고 노출을 종료하였다. 노출이 종료된 개체는 성비를 확인하고 전장, 전중 등 개체 특성을 확인한 후, 해부하여 간 등 조직을 채취, 관찰 및 분석하였다. 노출 후 종말점은 Table 1과 같이 각 세대와 시기별로 확인하였다.
<Table 1> Exposure period and endpoints of multi-generation toxicity tests Exposure Period(weeks)
Endpoint
F0 F1 F2
1
F0 : Abnormal, Survival rate, Reproduction 2
3
4 1 F1 : Hatching rate
5 2 F0 : Metabolite, Total weight & length F1 : Hatching rate
3 ~ 13 F1 : Abnormal, Survival rate, Hatching rate 14 ~ 16 F1 : Reproduction
17 1 F1 : Reproduction F2 : Hatching rate
18 2
F1 : Total weight & length, Sex ratio, Vitellogenin (VTG), Histopathology
F2 : Hatching rate 3 ~ 18
F2 : Abnormal, Survival rate, Hatching rate, Reproduction, Total weight & length, Sex ratio, VTG, Histopathology
다. 시료의 전처리 및 기기분석 (1) 시료의 전처리
본 연구에서는 PFOA를 대조군, 0.3, 3, 30 mg/L의 농도단계로 나누어 노출시험에 사용하였으며 각 단계별 노출농도를 확인하기 위하여 다음의 과정에 따라 분석하였다. 시료의 전처리는 각 노출군의 농도별 시료 1 mL에 내부표준물질인 13C4-PFOA (50 μg/L)를 100 μL씩 첨가한 후 고상카트리지인 HLB(Waters Oasis® HLB 3 cc, 60 mg, USA)에 포집하였다. 고상카트리지는 시료를 주입하기 전에 메탄올 6 mL로 활성화시키고 초순수 6 mL를 흘려 남아있는 메탄올을 씻어낸 후 사용하였다. 분석물질이 포집된 고상카트리지는 40 % 메탄올을 흘려보내 분석대상 이외의 물질을 제거한 다음 진공펌프를 이용하여 약 10 분 동안 남아있 는 수분을 제거하였다. 건조된 카트리지는 메탄올 6 mL를 흘려보내면서 분석성분을 용출시킨 다음 15 mL 폴리프로필렌
(Falcon, USA) 원심관에 용출액을 모아 진공원심농축기(Genevec EZ-2, UK)를 이용하여 건조시켰다. 건조된 원심관내 시료에 메탄올 1 mL를 넣어 재용해 시킨 후 회전식진탕기로 1 분간 혼합하였다. 혼합이 끝난 시료는 주사기(Henke sass wolf, luer 3 mL, Germany)를 결합한 나일론 필터(Teknokroma, Germany, 0.22 μm)로 여과하여 1.5 mL 바이알(Waters, USA)에 담아 분석시료로 사용하였다.
(2) 기기분석
분석에 사용한 장비는 고성능액체크로마토그래프(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)와 질량분석기를 연결한 형태의 HPLC-MS/MS를 사용하였다. 1 회 주입하는 시료의 양은 10 μL이었으며, 분석컬럼은 100 mm × 2.1 mm(5 μm) BetasilⓇ C18(Thermo, USA)을 사용하였다. 분석컬럼의 오염을 방지하기 위하여 보호용 컬럼(Zorbax Eclipse XDB-C8 2.1 mm × 12.5 mm(5 μm), Agillent, USA)을 분석컬럼 앞에 설치하였다.
이동상은 2 mM 아세트산암모늄(Ammonium acetate)과 메탄올을 이용하여 시간에 따라 비율을 변화시켜 사용하였다. 메탄올의 비율이 0 ~ 3 분까지는 50 % 이었으며, 3 분 후에 100 %로 증가시킨 후 0.5 분 유지, 다시 1.5 분 후에 50 %로 낮추어 최종 8 분까지 유지시켰다. 이동상의 전개속도는 300 μL/min이었으며, 컬럼의 오븐 온도는 35 ℃로 고정하였다.
시료 중 PFOA의 확인을 위하여 표준물질을 이용하여 머무름 시간과 이온 질량을 비교하였다. 물질의 검출은 특정 이온만을 선택하여 검출하는 다중반응 모니터링방법(multiple reaction monitoring mode, MRM)을 음이온화 전자분무식 이온화방법으로 실시하였다. PFOA의 MRM 및 MS/MS 조건을 Table 2에 나타내었다.
또한, 시료의 정량은 표준물질의 농도와 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 후, 측정용 시료 중 분석대상물질과의 피크 면적을 계산하였다(Figure 1).
검량선은 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 ng/mL의 농도로 제조된 표준용액을 분석한 다음, 각 성분의 농도별 피크 면적과 내부표준물질의 면적비를 이용하여 1 차 직선식으로 작성하였다. 각 성분별 검량선의 결정계수(r2)는 각 물질별로 0.999 이상의 높은 상관관계를 보였다. 질량분석기는 음이온화 전자분무식이온화 방법을 사용하여 측정하였다.
<Table 2> Analysis conditions of LC/MS/MS for PFOA
parent(m/z) product(m/z) Retention time
(min) cone(V) Coll(eV)
PFOA 413 369 5.25 15 10
13C4-PFOA 417 372 5.25 15 10
LC Aliance 2695(Waters, USA)
Column Agillent ZORBAX Eclipse XDB-C18 RRHT 600 Bar, 4.6 mm × 50 mm, 1.8 Micron
Injection volume 10 μL
Mobile phase A : 2 mM ammonium acetate in water B : Methanol
Oven temperature 35 ℃
Flow rate 0.3 mL/min
Gradient
Time(min) B(%)
0 50
0.2 50
3 100
3.5 100
5 50
8 50
Total run time 8 min
MS/MS Quattro micro API(Micromass, USA) Ion source ESI, Electrospray ionization
Polarity Negative
Detection mode MRM, Multiple reaction monitoring
<Figure 1> Standard curve for PFOA by LC/MS/MS.
3. PFOA 영향분석
가. 생식호르몬 영향 분석
내분비계장애 영향을 확인하기 위한 비텔로제닌(vitellogenin, VTG)은 난황 단백질의 전구체로써 에스트로겐의 작용에 의해서 간에서 합성된다. 송사리의 비텔로제닌 측정을 위하여 비텔로제닌 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA (Enzyme -linked immunosorbent assay)법인 EnBio Medaka Vitellogenin ELISA system(FUJIKURA KASEI CO., Japan)을 사용하였다. 노출이 종료된 F1, F2 세대의 VTG 분석용 개체로부터 간을 채취하여 250 μL의 assay buffer가 분주되어 있는 1.5 mL 마이크로튜브에 넣는다. 균질기로 분쇄한 후 4 ℃, 8,000 g 에서 10 분간 원심분리 하여 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 ELISA 시험 전까지 –20 ℃에서 보관하였다. ELISA 시험은, 96-well plates를 세척액(washing buffer) 200 μL로 3 회 세척한 후, 세척액을 완전히 제거하고 비텔로제닌 표준용액 및 assay buffer로 희석한 시료를 각 well 당 50 μL씩 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 각 well의 첨가액을 제거하고 well 당 200 μL의 세척액을 사용하여 3 차례 씻어낸 후 horse radish peroxidase-conjugated antibody 50 μL를 각 well에 분주하고 실온에서 1 시간 동안 진탕 배양하였다.
용액을 제거하고 well 당 200 μL의 washing solution을 사용하여 3차례 세척 후, TMB (3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine)가 첨가된 기질용액 50 μL를 각 well에
첨가하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. 마지막으로 50 μL의 반응정지액을 첨가한 후 15 분 이내에 Infinite® 200(TECAN, Switzerland)을 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
나. 조직학적 병변관찰
광학현미경 관찰용 표본 제작을 위해 송사리의 간, 생식소를 절취하였다. 그리고 갑상선은 송사리 눈 뒤부터 아가미 뚜껑 앞부분을 전체 절취하여 조직표본을 제작하였다(Figure 2). 고정액에서 24 시간 동안 고정한 후 흐르는 물에 24 시간
~ 48 시간 동안 세척한 후, 70 % ~ 100 %까지 단계별 에탄올로 탈수하고, 자일렌에 의한 치환 과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 포매된 시료는 조직 절편기를 이용하여 4 μm ~ 5 μm 두께 설정 후, 생식소와 갑상선 관찰을 위해 시료 전체를 연속절편하여 시료 당 3 장씩 유리 슬라이드에 부착하였다.
그리고 조직 표본은 기관계의 구조 변화 및 이성생식세포 발달 등을 관찰하기 위해 헤마톡실린-에오진(haematoxylin-eosin, H-E) 염색을 실시하였다.
완성된 표본은 광학현미경(Axio M2, Zeiss, Germany)으로 관찰하였으며, 이미지저장 프로그램(Axio Imager, Zeiss, Germany)을 이용하여 그림 파일로 저장하였다.
<Figure 2> Histological observation of the thyroid gland in the medaka.
다. 조직 중량지수
시험개체의 해부과정에서 측정한 값들로 다음과 같은 조직 중량지수를 구하였다.
(1) 생식소중량지수(Gonadosomatic index: GSI)는 G SI 체중 g
생식소무게 g
×
(2) 간중량지수(Hepatosomatic index: HSI)는 HSI 체중 g
간무게 g
×
(3) 비만도지수(Condition index: CI)는 CI 전장cm
전중 g
×
라. 생식소 발달단계
생식소 발달단계는 암․수 각각의 생식세포 발달단계에 따라 구분하였다20,21. 암컷의 생식세포발달은 난원세포기(oogonial stage), 난황형성 전기(previtellogenic stage), 난황형성 개시기(initial vitellogenic stage), 난황형성 활성전기(early active vitellogenic stage), 난황형성 활성후기(lately active vitellogenic stage), 성숙기(mature stage)와 완숙기(ripe stage)로 구분하였다. 수컷의 생식세포발달은 정원세포기(spermatogonia stage), 정모세포기(spermatocyte stage), 정세포기 (spermatid stage)와 정자(sperm stage)의 4 단계로 구분하였다.
이를 토대로 암컷의 생식소 발달단계를 각 발달단계에 속한 생식세포들의 우점 정도에 따라 암컷을 성장기(growing stage), 성숙기(mature stage), 완숙기(ripe stage), 회복 및 휴지기(recovery and resting stage)로 구성하였다(Figure 3a).
수컷의 생식소 발달단계는 휴지기(resting stage), 성장기(growing stage), 성숙기(mature stage), 완숙 및 방정기(ripe and spent stage)로 구성하여 4 단계의 발달단계로 나누었다(Figure 3b, Table 3).
Germ cell stage Gonad developmental stage
Female
Oogonial stage
Previtellogenic stage Recovery and resting stage Initial vitellogenic stage
Early active vitellogenic stage lately active vitellogenic stage
Growing stage
Mature stage Mature stage Ripe stage Ripe stage
Male
Spermatogonia stage Resting stage Spermatogonia stage
< Spermatocyte stage Growing stage Spermatocyte stage
< Spermatid stage Mature stage Sperm stage Ripe and spent stage
<Table 3> Gonad developmental stage of the medaka
(a) (b)
<Figure 3> Ovarian(a) and testis(b) development stage of the medaka(Oc, oocyte;
Sc, spermatocyte; Sg, spermatogonia; St, spermatid; Sz, spermatozoa).
마. 성비변화 분석 (1) 표현형 분석법
PFOA에 노출된 송사리의 암수성비를 F1, F2 세대에서 조사하였다. 표현형 암수 구분은 등지느러미, 뒷지느러미, 항문의 형태로 구분이 가능하며, 본 연구에서는 등지느러미와 뒷지느러미의 형태적 차이를 이용하여 암수를 구분하였다.
Figure 4의 A와 F는 각각 암컷, 수컷 송사리의 측면 사진이다. 암컷의 등지느러미(B)와 뒷지느러미(C)는 그 말단이 연속적으로 이어지며, 수컷의 경우 말단이 갈라진 형태를 띤다. 특히 수컷의 등지느러미(G)의 중간 부는 크게 갈라져 있으며, 뒷지느러미(H)는 암컷보다 대체적으로 길고 말단이 톱니처럼 갈라져 있다. 또한, 수컷의 경우 뒷지느러미의 항문에 가까운 쪽부터 유두상 돌기(papillary processes, P.P)라 불리는 수컷의 2 차 성징이 형성된 것을 현미경 아래에서 확인할 수 있다(J). D·E와 K·L는 각각 암컷과 수컷의 비뇨 생식공이며 암컷이 수컷보다 돌출된 형태를 나타낸다22.
<Figure 4> Classification of female and male of the medaka.
4. PFOA 노출에 의한 대사체 분석
가. 대사체 검사용 시료 준비
대조군과 0.3, 3, 30 mg/L의 각 시험군에서 암수 각각 15 마리씩 총 120 마리의 동결 건조된 송사리 성체를 이용하였고, 평균 체중이 0.3 g이 되도록 3 마리씩 묶어 전체 시료 40 개로 분류하였다.
나. 송사리 시료 추출
송사리 시료를 동결 건조한 후 3 마리씩 막자사발에 넣고 분쇄하였다. 분쇄한 송사리 분말에 1.6 mL 메탄올과 0.6 mL 증류수를 첨가하고, 5 분간 잘 섞은 후(vortexing), 15 분간 초음파로 분쇄하였다. 여기에 0.8 mL의 클로로포름을 첨가하고, 10 분간 얼음에서 방치한 후 0.8 mL 클로로포름과 0.8 mL 증류수를 각각 첨가하였다. 다시 5 분간 잘 섞은 후, 15 분간 얼음에 두었다. 원심분리(4 ℃, 10 분, 3,000 rpm) 후 층 분리된 수층을 깔때기 튜브에 옮기고, 액체 질소에 급속 냉각 시킨 후, 동결건조기를 이용하여 수분을 제거하였다.
다. NMR (Nuclear magnetic resonance)용 시료 준비
완전 건조 된 시료를 중수(D2O, 기준물질 TSP-d4 2 mM 첨가) 700 μL로 녹여서 5 mm NMR용 튜브로 옮긴 후 측정 전까지 4 ℃에서 냉장 보관하였다.
라. 시료 측정
600 MHz NMR 분광기의 자동 시료채취기 7600-AS Autosampler(Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 수층의 경우, 남아있는 물과 고분자를 제거하기 위하여 CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)의 적절한 펄스 파형을 측정하였다.
측정 온도는 299.1 K, 포착시간은 3 초, 안정화시간(relaxation delay)는 1 초, 스캔횟수는 128 회로 측정시간은 약 12 분 소요되었다.
마. 데이터 분석
정량 및 정성 분석을 위해서 Chenomx NMR suite 7.1 소프트웨어(Chenomx Inc., Canada)를 이용하였다. 1 차원 양성자 NMR 스펙트럼은 푸리에 변환하고 바탕선과 위상을 조정하여 정량 오차를 최소화시켰다. Chenomx를 이용하여 기준물질(3-(trimethylsilyl) propionic-2,2,3,3-d4 acid, TSP-d4) 2 mM를 기준으로 δ를 0 mg/L로 맞추고, 상대농도를 결정하였다. 본 실험에서는 Chenomx의 600 MHz 라이브러리를 이용하여 대사체들을 확인하고 정량하였다.
바. 통계분석
통계분석을 위하여 SIMCA P+ 12.0(Umetrics, Sweden) 소프트웨어를 이용하였다.
0.5 mg/L ~ 10 mg/L 사이의 스펙트럼을 0.01 mg/L 간격으로 구분하고 물 피크가 포함된 4.7 mg/L ~ 4.9 mg/L는 제외시켰다. 구분 자료는 SIMCA를 이용하여, 주성분 분석(Principal component analysis, PCA), 부분최소자승판별 분석(Partial least square-discriminant analysis, PLS-DA), 또한 직교부분 최소 자승판별 분석(Orthogonal partial least square-discriminant analysis, OPLS-DA) 방법으로 분석하였다. 이들 분석법은 모두 스펙트럼의 유사성을 비교하여 그룹화 하였다.
Items TG 229(Fish Short Term Repoduction Assay)
TG 234(Fish Sexual Development Test) Recommended species Medaka (Oryzias latipes)
Test type Flow-through Flow-through or semi-static Water temperature 25 ℃ ± 2 ℃
Illumination quality Fluorescent bulbs
Light intensity 10 μE/M2/s ~ 20 μE/M2/s, 540 lux ~ 1000 lux Photoperiod 12 h ~ 16 h light,
12 h ~ 8 h dark Loading rate < 5 g per L
Test chamber size 2 L(minimum) 7 L(minimum) Test solution volume 1.5 L(minimum)
Volume exchanges of
test solutions Minimum of 5 times daily
Age 16(± 2) weeks Early blastula stage Wet weight of adult
fish (g)
Females: 0.35 ± 20 %, Males: 0.35 ± 20 %
Ⅲ. 연구결과 및 고찰
1. 다세대 및 장기노출 시험방법(안) 제안
가. 어류 생식율과 성 발달 관련 OECD 시험지침서
OECD 시험지침서 229 번과 234 번의 시험과정을 검토하여 다세대 노출 시험 절차의 적용성을 확인하였다. 시험지침서 229 번은 단기간 노출 후 산란율의 변화를 확인하고, 시험지침서 234 번은 알부터 성체까지의 노출영향을 관찰하는 시험법이다. 두 시험법은 서로 다른 연령의 어류를 이용한 시험이지만 시험조건 중 수온, 광주기, 먹이, 노출용액 교환주기 등에 대해서는 동일하였다. 반면 방법간 차이가 있는 생물의 연령, 반복구수, 암수비율, 수조크기 등에 대해서는 각 시험법의 특성이 반영되어 있다(Table 4).
<Table 4> Comparison of OECD test guideline No. 229 and No. 234
<Table 4> Comparison of OECD test guideline No. 229 and No. 234(Continued)
Items TG 229(Fish Short Term Reproduction Assay)
TG 234(Fish Sexual Development Test)
No. of eggs Minimum 120
No. of fish
(test vessel) 6(3 males and 3 females)
No. of treatments 3(plus controls) Minimum 3(plus controls) No. of replicates Minimum 4
No. of fish per test concentration
12 males and 12 females (3 males and 3 females/test vessel) Feeding regime Brine shrimp nauplii two or
three times daily(ad libitum)
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc. feed twice daily Aeration > 60 % air saturation
Dilution water Clean surface, well or dechlorinated tap water Pre-exposure period 7 d ~ 14 d recommended
Test substance
exposure duration 60-dph (days post-hatch) Chemical exposure
duration 21 d
Biological endpoints
Survival, behaviour, fecundity, 2nd sex characteristics, VTG, optionally gonadal histopathology
Hatching success, survival, gross morphology, VTG, gonadal histology, genetic sex, sex ratio
Test acceptability
Dissolved oxygen > 60 % of saturation;
mean temperature of 25 ℃ ± 2 ℃;
90 % survival of fish in the controls;
measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
나. 미국 환경청(EPA)과 일본 국립환경연구소(NIES)의 다세대 노출시험 절차
미국과 일본의 다세대 노출시험 절차를 검토한 결과, 종말점은 산란수, 성비 (표현형/유전형), 부화율, 생존율, 조직분석으로 동일하였다. 단, 시험개체 및 반복구의 차이가 있었다. 시험반복구의 경우, 미국과 일본이 각각 6 반복구와
4 반복구를 사용하였으며, 미국방법을 본 연구에 적용시 공간과 시설적 제약이 수반되었기 때문에, 본 연구에서는 일본과 동일하게 4 반복구를 적용하였다 (Figure 5).
<Figure 5> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in USA and Japan.
다. 다세대 장기노출 시험절차(안) 도출
각 대조군과 노출군의 F0 세대는 건강한 개체를 선택하여 4 개의 수조에 암수 8 쌍으로 나누어 노출시켰다. 3 주간 노출시킨 후 각각의 수조에서 산란율을 파악하고, 4 주차부터 각 수조에서 알을 채란하여 발생을 확인하였다. 채란은 다음 세대 노출에 필요한 개체 수의 세 배수 이상을 채울 때까지 진행하였다.
일주일간 채란한 알은 동일한 농도군을 모두 섞은 후 F1 세대의 치사율을
고려하여 각 농도군당 노출개체수의 3 배인 192 개체(16 마리 × 4 반복 × 3 배)를 각각 배양하였다. 노출이 끝난 F0 세대의 성체는 동결건조하여 대사체분석을 진행하였다. F1 세대는 암수 구별이 될 때까지 사육 후 반복구 당 암수 각각 8 마리씩 남기고 나머지는 폐기하였다. 9 주 ~ 14 주 사이에 비텔로제닌과 조직학적인 변화를 확인하기 위하여 암수 2 쌍을 채취하여 분석하였다. 14 주 이후 F1 세대에서와 동일한 개체수 만큼의 알을 채란한 후 F2 세대 노출을 진행하였고, 노출이 끝난 F1 세대는 유전학적 성별확인과 체내 축적량 측정을 위해 처리하였다. F2 세대 역시 최종 노출 개체수는 F1 세대와 동일하며 산란율을 확인할 수 있는 시기까지 노출을 진행하였다. F2 세대의 경우 체내축적량 확인을 하지 않았기 때문에 비텔로제닌과 조직관찰용 시료를 한 쌍씩 늘려 채취하였다(Figure 6).
<Figure 6> Diagram of fish multi-generation toxicity tests in this study.
2. 과불화화합물의 노출농도
가. 노출용액 농도분석
PFOA의 노출 설정농도는 0, 0.3, 3, 30 mg/L로 하였고, 매주 노출 시료를 채취하여 LC/MS/MS에 의해 실측농도 값을 측정하여 비교하였다(Figure 7).
각 노출농도 실측값(평균값 ± 표준편차)은 각각 0.28 mg/L ± 0.01 mg/L, 2.84 mg/L ± 0.15 mg/L, 28.45 mg/L ± 1.38 mg/L로 노출기간 동안 모든 농도에서 설정농도대비 80% 이상으로 비교적 안정적으로 유지되었다.
<Figure 7> Exposure concentration of PFOA during test periods.
나. 송사리 체내 PFOA 농도
PFOA에 노출된 송사리 중 F1 세대의 체내 축적량은 Figure 8에 도식화 하였으며 암수에 따른 유의한 차이는 없었다. 체내 축적농도를 노출농도로 나눈 값인 체내농축지수(bioconcentration factors, BCFs) 평균값은 0.3 mg/L 농도군의 암수 각각에서 2.2 L/Kg과 1.8 L/Kg로, 3 mg/L의 암수 모두에서 1.7 L/Kg, 30 mg/L에서 1.4 L/Kg, 1.3 L/Kg으로 확인되었다. EPA에서는 BCFs 값이 1,000 L/Kg 이상일 때 , EU에서는 2,000 L/Kg 이상일 때 생물축적성이 있는
것으로 판단하고 있다23,24. 또한 사례연구 결과에서도 PFOA의 BCFs 값은 PFOS를 포함한 다른 과불화화합물보다 작은 값을 보이는 것으로 보고되었다25,26. 따라서 PFOA는 생물축적성이 없는 것으로 보인다. 그러나 본 연구에서는 F1 세대의 BCFs 값만을 산출하여 다음 세대로의 전이성 확인은 할 수 없었기 때문에 추후 연구에서는 보다 장기간에 거친 다세대 생물축적성 연구가 필요할 것으로 판단된다.
<Figure 8> Cumulative concentration of PFOA in the F1 generation medaka.
3. PFOA 다세대 장기노출 영향
가. F0, F1 및 F2 세대의 산란율 변화
Figure 9a는 각 세대별로 하루에 한 마리의 암컷이 생산하는 평균 산란수를 비교한 그래프이며, Figure 9b는 각 세대별로 대조군 대비 노출농도에 따른 산란율을 비교한 그래프이다. 각 세대에서 대조군을 포함한 모든 노출군의 산란율이 저조하여, 세대에 따른 산란율 변화에 대한 통계적 유의성 확인은 어려울 것으로 판단된다. 그러나 모든 세대의 최고농도 30 mg/L에서 각 세대별 대조군 대비 산란율이 약 50 % 감소하였으며 통계적으로도 유의하였다(p < 0.05).
따라서 고농도의 PFOA가 송사리의 생식능력을 저하시키는 것으로 판단되나 30 mg/L는 환경 중 농도보다 훨씬 높은 수준이며27,28,29 PFOA의 앞의 BCFs
측정 결과에 따르면 생물축적성이 없는 것으로 확인되었기 때문에 일반 수계환경 중에서 PFOA가 어류 생식능력에 미치는 영향은 적을 것으로 사료된다.
한편, 본 연구에서는 다양한 종말점 확인을 위해 노출 개체수를 늘려 한 수조에 개체밀도가 높아졌는데, 이로 인해 개체간 스트레스 증가하여 저조한 산란율을 야기하였을 것으로 보인다. 따라서 추후 연구에서는 개체간의 스트레스를 줄이고 보다 정확한 산란율 산출을 위해 각 수조마다 산란에 필요한 최소 개체의 노출이 필요할 것으로 판단된다.
<Figure 9> Reproductivity of the multi-generation medaka exposed to PFOA.
(a) Average number of eggs per fish a day. (b) Reproductivity compared to control group in each generation.
나. F1과 F2 세대의 부화율 및 치사율 변화
부화율에 있어서 F1, F2 각 세대별 대조군과 각 노출군은 통계학적으로 서로 유의한 차이가 나타나지 않았으며, F1과 F2 세대 간의 유의성 역시 확인되지 않았다(p < 0.05).
자어 생존율의 경우, F1 세대는 대조군과 노출군 간에 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, F2 세대는 농도 증가에 따라 통계적으로 유의한 감소추이를 보였다. 세대간 비교결과 F1 세대에 비해 F2 세대의 자어 생존율이 전반적으로 증가하였으나, 최고농도인 30 mg/L에서는 감소하였다(p < 0.05)(Figure 10).
<Figure 10> Hatchability and sac-fry survival rate of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA.
다. F1과 F2 세대의 암수 성비 및 수컷의 2차 성징
F1 세대는 대조군과 3 mg/L 노출군의 암컷 비율이 수컷에 비해 약 24 ~ 25 % 낮았고, F2 세대에서는 최고농도에서 암컷 비율이 38 % 가량 낮았으나, 통계적 유의성은 없었다(p < 0.05)(Table 5). 또한 16 주차 수컷에서 확인한 2차 성징인 유두상 돌기형성에서도 각 세대에서 대조군 대비 유의한 차이는 없었으며, 세대간 차이 역시 통계적으로 차이가 없었다(p < 0.05)(Figure 11).
<Table 5> Sex ratio of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA Exposure
concentration F1(M:F) F2(M:F) Control 1 : 0.74 1 : 1.00 0.3 mg/L 1 : 1.31 1 : 1.09 3 mg/L 1 : 0.75 1 : 1.16 30 mg/L 1 : 1.33 1 : 0.62
<Figure 11> Second characteristic of the male medaka exposed to PFOA. Number of joint plates with papillary processes(Left). Papillary processes of the male medaka(PP, papillary processes; AF, anal fin)(Right).
라. 비텔로제닌(VTG) 발현량 평가
수컷의 간을 이용한 VTG 발현량은 F1 세대의 대조군에서 13.5 ng/μL로 가장 높게 관찰되었으나, 보통 수컷에서도 일반적으로 확인되는 농도였다.
그밖에 농도 의존적 또는 세대에 따른 유의한 영향이 나타나지 않았다(Figure 12).
<Figure 12> VTG concentrations of the male medaka exposed to PFOA.
마. F1과 F2 세대의 생식소중량지수(GSI), 간중량지수(HSI), 비만도지수(CI) 생식소중량지수, 간중량지수, 비만도지수는 성별 및 노출농도에 따른 통계적 유의성이나 경향성은 확인되지 않았다(p < 0.05)(Figure 13).
<Figure 13> Gonadosomatic index(a,b), hepatosomatic index(c,d), and condition index(e,f) of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA.
바. PFOA 노출에 의한 생식소 조직 영향
송사리 생식소 내 이성생식세포 발생 여부를 조직학적 방법으로 확인한 결과 대조군을 포함한 모든 노출군에서 이성생식세포가 관찰되지 않았다(Figure 14).
즉, 위에서 언급한 표현형적 암수 성비와 VTG 발현량 및 이성생식세포 여부 확인결과 PFOA의 어류 다세대 노출에 따른 내분비계장애 영향은 나타나지 않는 것으로 판단된다.
<Figure 14> Light microscope of female and male gonad in the medaka of control group.
사. PFOA 노출에 의한 생식소 발달단계 영향
송사리 생식소의 발달단계를 각각 4 단계로 구분하여 관찰하였다. 그 결과, F1 세대 암컷 대조군은 성장기 및 성숙기가 분포하고 있었으나, 노출농도가 높아질수록 성숙기로 발달단계가 빨라졌다. F1 세대 수컷 대조군에서는 성숙기가 관찰 되었으나, 노출군에서는 성장기, 성숙기, 완숙 및 방정기 등 다양한 발달단계가 나타났다. F2 세대 암컷의 경우, 대조군에서는 성숙기와 완숙기가 나타났으며, 성숙기가 차지하는 비중이 높았다. 하지만 노출농도가 높아질수록 성숙기보다 완숙기의 발달단계가 더 많은 비중을 차지하였다. F2 세대 수컷 대조군은 성장기가 주로 나타났지만, 농도가 높아질수록 성숙기 발달이 빠르게 나타났다 (Figure 15). 앞서 언급된 세대에 따른 산란율 영향에서 F1 세대의 3 mg/L 노출군과 F2 세대의 0.3 mg/L 및 3 mg/L 노출군의 산란율이 대조군 보다 높게 나타난 원인이 발달단계의 변화와 연관되어 있는 것으로 판단된다.
그러나 발달단계의 변화가 생식능력과 부화율 등에 미칠 수 있는 영향에 대한 기작은 명확하지 않으며30, 이에 대한 지속적인 연구가 필요하다.
(a) (b)
(c) (d)
<Figure 15> Gonad development stage of the F1 and F2 generation medaka exposed to PFOA. (a)F1 female; (b)F1 male; (c)F2 female; (d)F2 male.
아. PFOA 노출에 의한 갑상선 조직 영향
갑상선의 해부학적 위치는 눈 뒤부터 아가미 뚜껑 앞부분에 위치하며, 식도의 외부 상피 조직을 따라 분포한다. 하지만 육안으로 외형적인 관찰은 어렵다.
정상적인 갑상선세포는 입방형 세포가 원형을 이루고 있으며, 세포의 핵을 뚜렷하게 관찰할 수 있다. 그리고 갑상선 호르몬이 분비되는 샘(gland)이 에오진에 염색되어 붉은색으로 나타났다31.
수컷의 갑상선 변화를 조직학적 방법으로 조사한 결과, 대조군과 비교하여 F1 세대와 F2 세대 모두 30 mg/L 농도에서 갑상선 소낭 세포(thyroid follicle cell)의 구조가 불명확한 세포변성(➡)이 나타났다(Figure 16). 그리고 암컷의 경우 대조군과 비교하여 F1 세대와 F2 세대 모두 30 mg/L 농도에서 핵(➡)의 위축이 나타났다(Figure 17). 이러한 변화는 저농도보다 고농도에서 더욱 뚜렷하였으며, 갑상선 소낭의 분포 수도 감소하는 경향을 보였다.
<Figure 16> Light microscope of thyroid follicle cell of male on the medaka and pathological change in exposed to 30 mg/L PFOA(➡, degeneration of follicle cell).
<Figure 17> Light microscope of thyroid follicle cell of female on the medaka and pathological change in exposed to 30 mg/L PFOA(➡, atrophy of follicle cell).
4. PFOA 노출에 의한 대사체 분석 결과
4 주 동안 노출된 F0 세대 개체에서 대사체를 추출하여 NMR(Chenomx 600 MHz)분석으로 대사체를 확인하였다. PFOA 노출에 따라 대사체의 변화경향 및 영향을 비교분석하고 새로운 종말점을 도출하고자 하였다. 대사체 정량분석 결과 에너지대사, 아미노산, 핵산 관련 대사체 등 총 46 종의 농도변화를 확인할 수 있었다. 농도별로 암컷(C-F, 0.3-F, 3-F, 30-F)과 수컷(C-M, 0.3-M, 3-M, 30-M)을 통합하여 PLS-DA 분석한 결과를 나타냈다(Figure 18). 고농도군(30 mg/L)은 암컷과 수컷 모두 대조군과 다른 노출군과 대사체의 검출 경향이 다르게 분포하여 영향이 뚜렷하게 나타났으며, 그 외 나머지 농도군(대조군, 0.3, 3 mg/L)에서는 암수에 따라 분포가 다르게 나타났다.
<Figure 18> Spectral analysis of metabolomic pattern according to gender and concentration using PLS-DA on the medaka exposed to PFOA.
가. 에너지 관련 대사체
에너지 대사에 관련된 대사체들의 변화를 관찰할 수 있었다(Figure 19). 3- Hydroxybutyrate는 케톤체(ketone body) 경로와 관련되며, 글루코스(glucose), 피루빈산염(pyruvate), 젖산(lactate)은 해당과정 관련물질이다32. 푸마르산염(fumarate), 옥살아세트산염(oxalacetate), 호박산염(succinate)은 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle) 중간물질이며, 아세테이트(acetate)와 포름산염(formate)은 미토콘드리아의 전자전달과정과 관련이 있다. 이들의 송사리 체내 함량이 변화했다는 것은 에너지 대사경로가 영향을 받은 것으로 추정된다. 이전의 PFOA 독성 관련 연구에 의하면 PFOA가 미토콘드리아의 내막형성을 방해하여 에너지 대사 과정에 문제를 일으키는 것으로 보고되었으며 쥐와 사람에 관한 연구에서는 PFOA가 칼빈회로 관련효소의 유전자 발현에도 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다31.
<Figure 19> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to energy of the medaka exposed to PFOA.
나. 아미노산 농도
아미노산의 경우 여러 종류에서 농도변화가 관찰되었다(Figure 20). 아미노산은 TCA 회로 중간물질 형성에 관련되어 있으므로, 아미노산들의 농도 변화도 에너지대사 회로과정에 PFOA가 영향을 끼친 결과로 볼 수 있다33(Figure 21).
또한 PFOA가 지방산과 구조가 유사하여 지방산의 베타산화(β-oxidation)에 관여하는 효소를 활성화시켜 이 효소의 합성에 많은 아미노산이 사용되므로 아미노산 농도가 변한 것으로 판단된다.
<Figure 20> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related in amino acid concentration of the medaka exposed to PFOA.
<Figure 21> Various amino acids related to TCA cycle.
다. 핵산 관련 대사체
핵산 관련 대사체인 구아노신(guanosine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 이노신 (inosine)은 유전물질 대사와 연관이 있으며, 알려진 PFOA의 독성으로 DNA 대사과정에 영향을 미치는 연구가 있었다34. 그리고 대사체 분석결과 핵산 관련 대사체들의 변화를 확인할 수 있었으나, 농도 의존성은 나타나지 않았다 (Figure 22).
<Figure 22> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to nucleic acid of the medaka exposed to PFOA.
라. 지질과 삼투압 조절 대사체
PFOA는 지질과 유사한 구조에 계면활성 성질을 가지고 있어 생체막에 끼어 들어가 생체막 형성을 방해하게 된다. 생체막의 유동성과 투과성에 장애를 일으켜 생체막의 파괴를 유도하여 삼투압 유지에 영향을 미친다35. 대사체 분석 결과 송사리 체내에 생체막 형성에 관여하는 대사체인 콜린(choline), 시티딘 (cytidine), 오르토-인산콜린(o-phosphocholine), 글리세로포스포콜린(GPC, sn- glycero-3-phosphocholine)과 삼투압 관련 대사체인 베타인(betaine), 타우린 (taurine), 미오-이노시톨(myo-inositol)의 변화를 확인할 수 있었다(Figure 23).
<Figure 23> Percentage change in metabolite concentrations quantified from NMR integration related to lipid and osmotic pressure of the medaka exposed to PFOA.
Ⅳ. 결 론
일부 화학물질은 저농도에서 장기간 생체 내 축적을 통하여 내분비계 교란이나 형태적 기형을 일으키므로 장기간 노출에 의한 영향파악이 매우 중요하다. 본 연구에서는 과불화화합물(PFOA)의 저농도 장기 노출에 의한 어류의 생식능, 내분비계장애영향을 관찰하기 위한 다세대 독성영향평가 시험방법을 새롭게 정립하고 새로운 종말점을 탐색하였으며 그 주요 결과는 다음과 같다.
1. 어류 다세대 독성시험과 관련된 노출방법, 통계적 유의성 확보를 위한 시험개체수, 종말점 등을 포함한 시험방법(안)을 제안하였다.
2. 본 시험방법에서 확인가능한 종말점으로 내분비계장애 영향을 나타내는 산란율, 성장율, 성비(표현형/유전형), 부화율, 치사율, 비텔로제닌, 생식소중량지수, 간중량지수, 조직학적 병변, 갑상선 및 생물농축지수 등을 선정하였다.
3. 본 연구에서 제안한 시험법으로 PFOA를 노출한 결과 PFOA는 생물농축성과 내분비계장애 영향은 없는 것으로 확인되었다. 그러나 노출군에서 생식소 발달단계가 대조군보다 빠르게 진행되었으며, 최고농도 30 mg/L에서 산란율 및 갑상선 세포핵 크기의 감소가 나타났다.
4. 새로운 종말점 탐색 연구를 위한 대사체 분석결과, 에너지 대사경로, 아미노산, 지질·삼투압 관련, 유전물질 대사과정에 관련된 대사체가 영향을 받는 것으로 확인되었다.
새로운 어류 다세대 독성시험 시험방법(안)은 연속노출장치를 이용하여 시험기간 중 노출농도가 잘 유지되었으나, 생물유지를 위한 최적 사육조건의 조정이 필요할 것으로 보인다. 또한 과불화화합물로 인한 대사과정 및 갑상선 손상 등 어류 성장의 잠정적 영향이 확인됨으로써 이들 종말점과 어류의 장기적 영향평가 간의 명확한 상관관계를 규명하기 위한 추후 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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