실험재료 및 방법
시약 & 항체
FITC-DEVD-FMK는 eBioscience(Atlanta, GA, USA)에서 구입했습니다. Celltiter 96® 단일 용액 수성 세포 증식 분석은 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입했습니다. 세포 증식 ELISA 및 BrdU 테스트 키트는 Roche Diagnostics(독일 만하임)에서 구입했습니다.
BCA 단백질 분석 키트는 Thermo fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다.
세포 배양
세포 생존율 분석
세포 증식률 분석
분화 표지분자
인산염 완충 식염수로 두 번 세척하고 인산염 완충 식염수로 재현탁한 다음 FACSCalibur 유세포 분석기(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포를 분석합니다.
세포자멸사에 대한 유세포 분석기
Caspase-3 활성도에 대한 유세포 분석기
미토콘드리아 막전위에 대한 유세포 분석기
그런 다음 세포를 수확하고 인산염 완충 식염수로 두 번 세척하고 인산염 완충 식염수로 재현 탁한 다음 FACSCalibur 유세포 분석기 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분석했습니다.
세포주기에 대한 유세포 분석기
Western blot
통계처리
상기 결과는 이소플라본인 바이오카닌 A와 제니스테인 모두 맨틀세포 림프종 세포주의 세포생존율과 세포증식을 감소시키는 데 효과가 있음을 시사한다. 또한, 세포주기 분석을 통해 Biochanin-A에 의해 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다. Biochanin A 처리 후 JeKo-1 세포의 세포생존율이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고(Fig. 3A, 3B), 유세포 분석을 통해 세포사멸을 확인하였다.
그 결과, 바이오카닌 A의 농도 의존적으로 Annexin V 염색의 세기가 증가하는 것을 확인하였고, 이는 바이오카닌 A에 의해 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 7A, 7B). 또한 Biochanin A에 의한 맨틀세포 림프종 세포의 세포독성이 세포사멸 기전으로 발생한다는 사실도 단백질 분석을 통해 확인되었습니다. 위의 결과는 바이오카닌 A에 의한 맨틀 세포 림프종 세포 사멸이 세포사멸 메커니즘을 통해 발생하고 카스파제 경로에 의존하는 것으로 보인다는 것을 보여줍니다.
biochanin-A에 의한 맨틀 세포 림프종 세포 사멸이 외인성 경로인지 내인성 경로인지 확인하기 위해 미토콘드리아 막 전위를 측정했습니다. 반대로, 세포사멸 촉진 단백질인 Bax와 Bak의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 9C). 즉, 바이오카닌 A에 의한 맨틀세포 림프종의 세포사멸이 내인성 경로를 통해 일어난다는 것을 보여준다.
이러한 선행연구를 토대로 천연물인 바이오카닌 A가 맨틀세포 림프종 세포주인 JeKo-1의 세포생존율 및 증식률 감소를 유도할 수 있을 것으로 기대되었다. 먼저, 맨틀세포 림프종 JeKo-1 세포에 바이오카닌 A를 농도별로 처리한 결과, 세포 생존율과 세포 증식이 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로 Biochanin A는 농도 의존적으로 세포사멸을 유도할 수 있었다.
바이오카닌 A는 맨틀세포 림프종에서 세포 증식과 세포 생존을 억제하고 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었습니다. 바이오카닌 A의 효과는 맨틀 세포 림프종 세포주에서 확인되었으며, 더 나아가서는 다음과 같습니다. 그러나 맨틀 세포 림프종에서 STAT3 인자와 바이오카닌 A의 관계가 확인되지 않았기 때문에 추가 실험이 필요합니다.
결과
Biochanin A inhibits viability and proliferation of mantle cell lymphoma cells
Biochanin A delays cell cycle and reduces proliferation related protein
그 결과, 바이오카닌-A 농도가 높을수록 G0/G1 단계가 높아지는 것을 확인하였다. 이는 Biochanin A에 의한 세포 증식 억제가 세포주기의 G0/G1 단계 지연과 세포 증식과 관련된 단백질의 감소에 의해 유도된다는 것을 보여줍니다.
Biochanin A induces apoptosis by activating caspase-3 in mantle cell
Biochanin A induces apoptosis of mantle cell lymphoma cells via the intrinsic
미토콘드리아 표적 경로를 통한 바이오카닌 A 유발 G0/G1 정지 및 맨틀 세포 림프종 세포의 세포사멸 메커니즘에 대한 제안된 모델. Biochanin A는 맨틀 세포 림프종 세포에서 G0/G1 단계 세포 주기를 정지시켜 항증식 및 항세포 생존을 가속화했습니다. 기존에 맨틀세포림프종에 사용된 항암제인 R-CHOP(리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손)와 다발성 골수종에 사용되는 보르테조밉의 복합효과에 대한 실험이 진행되고 있다[27].
위암 세포주 MGC-803에서 biochanin A는 demethylase 억제제로 작용하여 세포 콜로니 형성과 세포 성장을 억제하고 세포 사멸 유도에 관여하는 것으로 알려져 있습니다 [31]. 또한, 대장암 세포주 Caco2에서 바이오카닌 A는 전사 인자 조절자인 아릴 탄화수소 수용체의 길항제로 작용하여 세포 증식 억제에 참여합니다[32]. Annexin V, caspase-3 활성 및 Dioc6(3)을 검사하여 세포사멸을 확인했습니다.
천연물질의 사용이 증가하고 있는 만큼, 인체에 대한 안전성 확인을 통해 천연물질의 인체 내 사용량을 판단하고, 약물 상호작용의 메커니즘을 규명하는 것이 필요하다. Biocanin A는 또한 이소플라본 계열에 속하는 식물 기반 천연 제품입니다. 또한, 기존 항암제와의 병용효과를 검증하고, 세포증식의 주요 신호인자인 PI3K/AKT/mTOR 신호인자의 변화도 확인해야 한다.
이번 연구를 통해 바이오카닌A는 맨틀세포림프종의 새로운 천연치료제로서의 활용 가능성을 입증했으며, 기존 항암제의 한계를 극복할 수 있는 새로운 솔루션을 제시한다. 새로 진단된 맨틀 세포 림프종 환자의 R-CHOP, 시타라빈 및 자가 줄기 세포 이식 후 보르테조밉 유지 관리, 무작위 배정 결과. 제한기 외투세포림프종의 임상적 특성 및 치료 결과: 림프종 생존율 향상을 위한 컨소시엄 보고서.
한방화장품의 세계화와 명품브랜드의 전략에 관한 연구.
고 찰
참고문헌
