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이학석사 학위논문
다발골수종세포에서 레인에 의한 세포자멸사 기전 연구
Rhein induces apoptosis in multiple myeloma cells
울 산 대 학 교 대 학 원 의 과 학 과
성 준 영
[UCI]I804:48009-200000332994 [UCI]I804:48009-200000332994
다발골수종세포에서 레인에 의한 세포자멸사 기전 연구
지 도 교 수 조 재 철
이 논문을 이학석사 학위 논문으로 제출함 2020 년 08 월
울 산 대 학 교 대 학 원 의 과 학 과
성 준 영
성준영의 이학석사 학위 논문을 인준함
심사위원 최 윤 숙 ( 인 ) 심사위원 조 재 철 ( 인 ) 심사위원 허 숙 경 ( 인 )
울 산 대 학 교 대 학 원
2020 년 08 월
i
국문요약
다발골수종은 백혈구의 한 종류인 B 림프구의 최종 성숙 단계인 형질세포에서 발생하는 혈액암이다. 그리고 형질세포가 비정상적으로 분화, 증식되어 M단백을 생성하여 골병변, 고칼슘혈증, 면역장애 등을 일으키는 질환이다. 이 질환은 다양한 치료 방법으로도 완치가 어렵고, 재발 위험성이 높아 치료 예후가 좋지 않다. 현재, 다발골수종은 기존 약물인 레날리도마이드 (Lenalidomide), 보르테조밉 (Bortezomib), 덱사메타손 (Dexamethasone)과 같이 일반적으로 잘 알려진 항암제에 의존하고 있지만 이 약물들에 대한 저항성이 나타나고 있다.
레인은 대황 및 호장근 뿌리에 많이 함유되어 있는 천연물로, 안트라퀴논 성분이다. 레인은 항암, 항균, 항산화, 항혈관신생, 항염증 등의 약리학적 효능이 있다고 알려져 있지만, 현재까지 다발골수종에서 레인의 효과는 전혀 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 다발골수종에서 레인이 치료제로서 가능성이 있는지 확인하기 위해 항암효과 평가 및 증식 억제 기전에 대해 연구하였다.
연구 방법으로는 세포 생존율 및 증식률을 확인하기 위해 MTS assay, BrdU assay 를 이용하였고, Annexin V 염색을 통해 세포자멸사 정도를 확인하였다.
세포자멸사의 경로를 확인하기 위해 Caspase 활성도 및 미토콘드리아 막 전위를 확인하였다. 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 Propidium iodide(PI)/RNase 염색을 통해 세포주기 분석 실험을 진행하였다. 세포자멸사 및 세포주기와 관련된 단백질의 변화를 Western blot으로 확인하였다.
다발골수종 세포에서 레인에 의해 세포 생존율 및 증식률이 감소하고 Annexin V 양성 세포가 증가하였다. 또한, Caspase 경로 활성화 및 미토콘드리아의 막 전위가 감소하여 세포질에 싸이토크롬 C 가 축적되는 것을 확인하였다. 또한, 레인이 다발골수종 세포의 세포주기 중 G0/G1 구간을 정지시키는 것을 확인하였다. 결론적으로 레인이 다발골수종 세포의 세포자멸사 및 증식 억제를 유도하는 것이 확인되어 다발골수종 치료약물로서 새로운 가능성을 제시하였다.
ii
목 차
국문요약 ··· i
목 차 ··· ii
List of Figures ··· iv
I. 서 론 ··· 1
II. 실험재료 및 방법 ··· 3
1. 시약 & 항체 ··· 3
2. 세포 배양··· 4
3. 세포 생존율 분석 ··· 4
4. 세포 증식률 분석 ··· 4
5. 세포자멸사 분석 ··· 5
6. Caspase 활성도 분석 ··· 5
7. 미토콘드리아 막 전위 (MMP) 분석 ··· 5
8. Cytochrome C 방출 분석 ··· 6
9. Western blot 분석을 위한 단백질 추출 ··· 6
10. 세포주기 분석 ··· 6
11. 통계 분석 ··· 7
iii
III. 결과 ··· 8
1. 레인은 다발골수종 세포에서 세포독성을 유도한다. ··· 8
2. 레인은 caspase 의 활성화를 통해 다발골수종 세포에서 세포독성을 일으킨다. ··· 11
3. 레인은 다발골수종 세포에서 미토콘드리아 막의 탈 분극화를 유도한다. · 13 4. 레인은 G0/G1 세포주기 정지를 통해 다발골수종 세포의 세포자멸사를 유발한다. ··· 17
IV. 고 찰 ··· 19
V. 참고문헌 ··· 21
영문요약 ··· 34
iv
List of Figures
Figure 1. 레인의 화학구조. ··· 9 Figure 2. 레인은 다발골수종 세포에서 세포독성을 유도한다. ··· 10 Figure 3. 레인은 caspase 의 활성화를 통해 다발골수종 세포에서 세포독성을 일으킨다.··· 12
Figure 4. 레인은 다발골수종 세포에서 미토콘드리아 막의 탈 분극화를 유도한다.
··· 14
Figure 5. 레인은 미토콘드리아 막 전위 손상을 통해 BCL-2 계열을 조절함으로써 세포자멸사를 유도한다. ··· 15
Figure 6. 레인은 G0/G1 세포주기 정지를 통해 다발골수종 세포의 세포자멸사를 유발한다. ··· 16 Figure 7. 다발골수종 세포에서 레인의 효과를 나타낸 매커니즘 모식도.··· 18
1
서 론
다발골수종은 전체 암 중에서 1%, 혈액암 중에서는 10%를 차지하며, 전 세계적으로 혈액암 관련 사망의 20%를 차지한다 [1-3].
다발골수종은 골수에서 형질세포가 비정상적으로 분화, 증식되어 나타나는 혈액질환으로 악성 형질세포에서 비정상적인 면역글로불린 M 단백을 과도하게 생성 및 축적하게 된다. M 단백은 특히 뼈를 침윤하는 것이 특징이며 그로 인해 골병변, 면역장애, 조혈장애 및 신장장애 등을 일으킨다 [4-7].
다발골수종의 5 년 생존율은 약 43%로 골수 형질세포의 난치성 암이며, 발생 위험도를 증가시키는 정확한 원인은 밝혀지지 않았지만, 환경적인 요인으로 노출된 방사선과 화학물질이 다발골수종의 위험 인자인 DNA 고두배수체, c-myc RNA 과발현, N-ras 돌연변이와 같은 염색체 이상 및 전좌 또는 사이토카인, 종양미세환경의 발달로 인한 발암유전자에 의해 생성된 단백질 때문에 발병된다 [8-17].
현재까지 다발골수종을 위해 확립된 치료법은 없으며 다양한 항암치료 약물이 시도되고 있다 [18-19]. 세포자멸사, 분화, 증식 등 악성세포의 다양한 주요 신호전달체계를 조절하기 위한 치료약물과 자가조혈줄기세포 이식의 도입으로 생존율이 향상되었다 [20-23].
다발골수종을 치료하기 위한 약물로 면역 조절 항암제인 레날리도마이드
(Lenalidomide), 스테로이드 호르몬의 당질코르티코이드계 약물인 덱사메타손
(Dexamethasone), 프로테아솜 억제제인 보르테조밉 (Bortezomib), 종양미세환경을 표적으로 하는 많은 치료 약물들이 개발되었고, 두가지 약물을 병용 투여로 치료하고 있다 [24-29]. 하지만, 이러한 방법으로도 재발 위험성이 높고 재발하게 되면 치료 예후가 좋지 않아 완치가 어려운 질환이다 [30-31].
2
다발골수종 치료율을 높이기 위해 기초연구와 중개연구의 발전을 이루어 발병기전에 대한 이해를 높여 새롭고 효과적인 치료제에 대한 연구와 개발이 필요하다 [32-33].
레인은 대황 및 호장근 뿌리에서 가장 중요한 활성 성분인 천연 단량체 안트라퀴논 유도체이다 [34]. 아시아 국가들 중 한국과 중국은 한의학에서 완화제 및 위약으로 사용되어 온 전통 약초성분이다 [35]. 레인은 간암, 폐암, 비인두암 등에서 세포자멸사를 유도한다고 알려져 있어 항암제로서의 잠재력이 높다 [36- 39]. 레인은 항암, 항균, 항산화, 항에스트로겐, 항혈관신생, 항염증, 간 보호 및 신장 보호 특성과 같은 광범위한 약리학적 효능이 있다고 알려져 있다 [40-44].
현재, 레인은 췌장암 [45], 유방암 [46], 난소암 [47], 자궁경부암 [48], 대장암 [49]
등 종양세포의 증식을 억제시킬 수 있다는 연구는 많이 진행 되어있지만 다발골수종 세포의 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도하는지는 알려진 바가 없다.
그러므로, 본 연구에서는 다발골수종 세포에 대한 레인의 효능 및 세포자멸사와 증식 억제 기전에 대해 연구하였다.
3
재료 및 연구방법
1. 시약 & 항체
◆ 시약
Rhein (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국) 은 구입하여, dimethylsulfoxide (Wak- chemie Medical GmbH)에 녹여 -20℃에 보관하였다. FITC-DEVD-FMK, FITC-LEHD- FMK는 eBioscience (Atlanta, GA, 미국)에서 구입하였다. Celltiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay는 promega (Madison, WI, 미국)에서 구입하였다.
DiOC6(3) (3,3’-Dihexyloxacarbocyanine Iodide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 미국)에서 구입하였고, Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents 는 Thermo fisher (Waltham, MA, 미국)에서 구입하였다. Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) kit 는 Roche Diagnostics (Mannheim, 독일)에서 구입하였고 Propidium iodide(PI)/RNase staining buffer 는 BD pharmingen (San Diego, CA, 미국)에서 구입하였고, FITC Mouse IgG-isotype control, Annexin V-FITC 는 BD Bioscience (San Diego, CA, 미국)에서 구입하였다. Western ECL substrates는 BIO- RAD (Hercules, CA, 미국)에서 구입하였다.
◆ 항체
Cell signaling technology (Beverly, MA, 미국)에서 Anti-cleaved caspase-3, anti- cleaved caspase-7, anti-cleaved caspase-9, anti-cleaved PARP-1, anti-BCL-xL, anti- Bax, anti-Bak, anti-MCL-1, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-Cyclin D3, anti-p21cip1, anti- p27kip1, anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP, anti-Mouse IgG(H+L)-HRP를 항체를 구입하였다.
Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, 미국)에서 Anti-β-actin, anti-CDK2, anti- cytochrome C, anti-Cyclin D1을 항체를 구입하였다.
4 2. 세포 배양
본 연구에서는 다발골수종 세포주인 U266B1을 사용하였다. U266B1 세포는 4.5g/L glucose, 2mM L-glutamine 이 포함된 RPMI1640 배지 및 소태아혈청, penicillin- streptomycin은 (GibcoBRL, Grand Island, NY, USA)서 구입하여, 소태아혈청15%와 penicillin-streptomycin 1%를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
세포가 75~80%정도 자랐을 때 계대배양 하였다.
3. 세포 생존율 분석
24 well plate 에 U266B1 세포를 5x104 cells/well 로 분주했다. 레인을 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후, 96 well plate에 옮긴 후, 각 well 마다 Celltiter 96® Aqueous One Solution promega (Madison, WI, 미국)을 처리하여 4시간 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 흡광도는 SpectraMax® ABS plus Microplate Reader (MOLECULAR DEVICES, San Jose, CA, 미국)를 사용하여 490 nm에서 측정하였다.
4. 세포 증식률 분석
24 well plate 에 U266B1 세포를 5x104 cells/well 로 분주했다. 레인을 농도 별로 처리하고 48 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Cell proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) kit (Roche Diagnostics, Mannheim, 독일)를 구입하여 사용하였다. 세포를 걷어내기 24 시간 전, BrdU labeling reagent 를 처리해준 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 72시간 지난 후, 세포를 걷어내어 Washing buffer로 2회 세척한다. 그 후, Fix Denat를 넣고 상온에서 30분 교반 하였다. α- BrdU-POD 를 넣어준 후, 상온에서 2 시간 교반한다. Washing buffer 로 2 회 세척한 후, Substrate solution 을 넣어 주고 96 well plate 에 옮긴다. 흡광도는 SpectraMax® ABS Plus Microplate Reader (MOLECULAR DEVICES, San Jose, CA, 미국)를 사용하여 370nm에서 측정하였다.
5 5. 세포자멸사 분석
U266B1 세포를 24 well plate 에 5x104 cells/well 로 분주했다. 레인을 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 이 후, 세포를 걷어내어 PBS로 2회 세척한다. Annexin V (BD pharmingen, San Diego, CA, 미국)를 실온에서 15분 동안 염색하여 FACSCalibur flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, 미국)를 이용하여 세포를 분석한다.
6. Caspase 활성도 분석
U266B1 세포를 24 well plate 에 5x104 cells/well 로 분주했다. 레인을 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 각 well 마다 FITC-DEVD-FMK, FITC-LEHD-FMK (Thermo fisher, Waltham, MA, 미국)를 처리하고 빛을 차단하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 염색하였다. 그 후, 세포를 걷어내어 PBS로 2회 세척하고, PBS에 부유시켜 FACSCalibur flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, 미국)를 이용하여 세포를 분석한다.
7. 미토콘드리아 막 전위 (MMP) 분석
DiOC6(3)는 Cell-permeable marker 로 미토콘드리아의 막 전위에 따라 미토콘드리아의 세포질에 축적된다. U266B1 세포를 24 well plate 에 5x104 cells/well 로 분주했다. 레인을 처리하고 72 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 각 well 마다 DiOC6(3) (3,3’-Dihexyloxacarbocyanine Iodide) Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, 미국)를 처리하고 빛을 차단하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 염색하였다. 그 후, 세포를 걷어내어 PBS로 2회 세척한 후, PBS에 부유시켜 FACSCalibur flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, 미국)를 사용하여 세포를 분석한다.
6 8. Cytochrome C 방출 분석
72 시간 동안 레인을 농도 별로 처리한 세포 샘플을 걷어낸 후 PBS 로 세척한다.
Cytoplasmic Extraction Reagent (Thermo fisher, Waltham, MA, 미국) CERⅠ과 protease inhibitor 를 혼합하여 처리한 후, 얼음에 10 분간 반응한다. 그리고 CERⅡ를 처리하고 얼음에 1 분간 반응한 후, 16,000g centrifuge 에 5 분 동안 돌린다. 상등액만 분리해, gel loading 한다. 이를 anti-cytochrome C 로 immunoblotting하여 확인한다.
9. Western blot 분석을 위한 단백질 추출
레인을 농도 별로 처리한 후 72 시간 동안 배양된 U266B1 세포를 걷어낸다.
U266B1 세포 샘플을 RIPA lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP- 40, 0.5% sodium deoxycholic acid, 0.1% SDS, 1mM PMSF), protease inhibitor cocktail (AEBSF 1mM, Arotinin 800mM, Bestatin 50μM, E64 15μM, Leupeptin 20μM, Pepstatin A 10μM)를 이용해 용해시킨다. 용해된 단백질은 Bicinchoninic acid (BCA) 단백질 분석 시약 (Thermo fisher, Waltham, MA, 미국)으로 정량 하였다. 정량한 단백질은 SDS-PAGE로 분리하여 Nitrocellulose membrane으로 옮겼다. 5% 무지방 탈지분유 (서울우유, 서울, 한국) in Phosphate buffered saline with tween20 (PBST) 로 상온에서 2 시간 이상 교반하여 항체와 단백질의 비 특이적인 결합을 억제시켰다.
1 차 항체를 5% 무지방 탈지분유 in PBST 에 희석시켜 4℃에 하루 동안 교반하였다. PBST 로 3 회 이상 세척한 후, 2 차 항체를 PBST 에 희석하여 상온에서 2 시간 교반하였다. 그 후, PBST로 세척하여 Western ECL blotting 기질 (Bio-Rad, Hercules, CA, 미국)로 탐지하였다.
10. 세포주기 분석
U266B1 세포를 5x104 24 well plate 에 cells/well 로 분주했다. 레인을 농도 별로 처리하고 72 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포를 걷어내어 PBS 로 2 회 세척한다. 4 °C 75% 에탄올을 이용해 하룻밤 동안 고정하였다. 이후, PBS 2 회 세척한 후, 세포에 Propidium iodide(PI)/RNase staining buffer (BD
7
pharmingen, San Diego, CA, 미국) 시약을 처리하고 37℃에서 15 분 동안 빛을 차단한 상태에서 염색하였다. 이어서, FACSCalibur flow cytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, 미국)를 사용하여 세포를 분석한다.
11. 통계 분석
모든 결과 자료는 최소 세 번 이상의 독립된 실험 결과에 대한 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표기하였다. GraphPad prism7.0 소프트웨어 (GraphPad, San Diego, CA, 미국)를 사용하여 모든 통계분석을 수행하였다. 또한, 결과 평균값은 Tukey:
Compare all pairs of columns 에 따른 일원 분산분석에 의해 분석되었다. ρ<0.05 {95% confidence intervals}는 통계적으로 유의한 차이를 반영함을 보여주었다.
8
결 과
1. 레인은 다발골수종 세포에서 세포독성을 유도한다.
레인이 다발골수종 세포에서 세포독성을 유도할 수 있는지 확인하기 위해 다발골수종 세포인 U266B1 세포에 레인을 처리하였다. 레인을 농도 별로 처리 후,
U266B1 세포의 생존율 및 증식률이 레인의 농도 의존적으로 감소하는 것을
확인할 수 있었다 (Fig. 2A, 2B). 또한, 세포독성이 세포자멸사와 관련 있는지 확인하기 위해 Annexin V 염색하여 유세포 분석기로 확인하였다. 그 결과, Annexin V 양성 세포가 레인 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰하였다 (Fig. 2C). 위의 결과를 통해 레인에 의한 세포독성은 다발골수종 세포에서 세포자멸사 경로의 활성화 및 세포 증식을 억제한다는 것을 확인하였다.
9 Figure 1. 레인의 화학구조
10
Figure 2. 레인은 다발골수종 세포에서 세포독성을 유도한다.
(A, B) U266B1 cell was treated with rhein 0, 10, 30, 50 μM for 72h, the cell viability, cell proliferation was analyzed by MTS, BrdU assay. (C) Flow cytometric analysis of the cell apoptosis after rhein 0, 10, 30, 50 μM treatment for 72h. Data are represented mean ±SEM.; ***,p<0.001. Significantly different from control cells.
11
2. 레인은 caspase의 활성화를 통해 다발골수종 세포에서 세포독성을 일으킨다.
다발골수종 세포에서 레인에 의한 세포독성이 세포자멸사 경로의 주요 단백질에 영향을 준다는 것을 Western blot 으로도 확인하였다. 그 결과, 레인의 농도 의존적으로 Cleaved caspase-3, -7, -9와 PARP-1의 단백질 발현이 증가하였다 (Fig.
3A). 또한, Caspase-3, -9 활성도를 측정하기 위해 FITC-DEVD-FMK 와 FITC-LEHD- FMK 를 염색하였을 때도, 레인의 농도 의존적으로 caspase 의 활성이 증가하였다 (Fig. 3B, 3C). 이를 통해 레인은 다발골수종 세포에서 caspase 활성화를 통해 세포독성을 일으키는 것을 확인하였다.
12
Figure 3. 레인은 caspase 활성화를 통해 다발골수종 세포에서 세포독성을
일으킨다.
(A) Whole cell extracts were probed by western blot for Cleaved caspase-3, -7, -9, and PARP-1. β-actin was shown as a loading control. (B, C) Caspase-3 and -9 enzymatic activity was measured in multiple myeloma cells by flow cytometry. The experiments were repeated three times and data are represented mean ±SEM.; ***, p<0.001. *Significantly different from control cells.
13
3. 레인은 다발골수종 세포에서 미토콘드리아 막의 탈 분극화를 유도한다.
레인에 의한 다발골수종의 세포자멸사가 미토콘드리아와 어떤 관련이 있는지를 확인하기 위해 미토콘드리아의 막 전위를 측정하였다. 레인을 농도 별로 처리한 다음, DiOC6(3)로 염색하였다. 이때, 레인의 농도 의존적으로 DiOC6(3) 양성 세포가 감소하는 것을 U266B1 세포에서 확인하였다 (Fig. 4A). 또한, 세포질로 방출된 싸이토크롬 C 의 단백질 발현 정도를 확인하였을 때도 레인의 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 4B). Western blot 을 통해 미토콘드리아 기능 및 투과성을 유지하는데 중요한 역할을 담당하고 있는 BCL-2 단백질 계열 중 anti- apoptotic 단백질인 BCL-xL, MCL-1의 발현이 레인의 농도 의존적으로 감소하였다.
그와 반대로, pro-apoptotic 단백질인 Bax, Bak 은 증가하는 것을 확인하였다 (Fig.
5). 위의 결과를 통해 레인은 다발골수종 세포의 미토콘드리아 막의 탈 분극화를 유도하여 세포자멸사를 일으키는 것을 하였다.
14
Figure 4. 레인은 다발골수종 세포에서 미토콘드리아 막의 탈 분극화를 유도한다.
(A) Decrease in the fluorescent intensity of DiOC6(3) is shown in cells with a loss of the mitochondrial membrane potential. Rhein-treatment induced depolarization of mitochondrial membrane in multiple myeloma cell. (B) The cytochrome C release from the mitochondria to the cytosol in MM cells after rhein treatment for 72h. The membrane was stripped and reprobed with anti-β-actin mAb to confirm equal loading. Data are represented mean ±SEM.; ***, p<0.001. *Significantly different from control cells.
15
Figure 5. 레인은 미토콘드리아 막 전위 손상을 통해 BCL-2 계열을 조절함으로써
세포자멸사를 유도한다.
BCL-2 family is a critical pro-, anti-apoptotic protein in the mitochondrial apoptosis pathway, the anti-apoptotic proteins, BCL-xL, MCL-1, were decreased and pro- apoptotic protein, Bax, Bak were increased dose-dependently. It evaluated by western blot. The membrane was stripped and reprobed with anti-β-actin mAb to confirm equal loading.
16
Figure 6. 레인은 G0/G1 세포주기 정지를 통해 다발골수종 세포의 세포자멸사를
유발한다.
(A) The indicated concentrations of Rhein were applied to U266B1 cells for 72h.
Representative graphs and quantitative cell cycle analysis after flow cytometry. (B, C) Expression levels of the G0/G1 phase related protein CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin D1, Cyclin D3, p21cip1, p27kip1 were detected by western blot. The membrane was stripped and reprobed with anti-β-actin mAb to confirm equal loading.
17
4. 레인은 G0/G1 세포주기 정지를 통해 다발골수종 세포의 세포자멸사를 유발한다.
다발골수종 세포에서 레인에 의한 증식 억제가 세포주기와 어떤 관련이 있는지를 확인하기 위해 세포주기 구간을 확인하였다. 레인을 농도 별로 처리한 후, Propidium iodide(PI)/RNase 로 염색하였다. 그 결과, 레인의 농도 의존적으로 G0/G1 구간이 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 6A). 또한, Western blot 을 통해 단백질 수준에서 확인한 결과 레인의 농도 의존적으로 세포주기 단백질인 CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin D1, Cyclin D3 는 감소하고, 사이클린 의존성 인산화효소 억제제인 p21cip1, p27kip1 은 단백질 발현이 증가하였다 (Fig. 6B, 6C). 위의 결과를 통해 다발골수종 세포에서 레인이 세포주기 구간 중 G0/G1 구간을 정지시켜 세포 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도한다는 것을 확인하였다.
18
Figure 7. 다발골수종 세포에서 레인의 효과를 나타낸 매커니즘 모식도.
Treatment of rhein on multiple myeloma cells affects caspase-dependent apoptosis by increasing cleaved caspase-3, -7, -9, PARP-1. In addition, it induces mitochondria- dependent apoptosis through decreasing BCL-xL, MCL-1 and increasing Bax, Bak. It inhibits the cell cycle by increasing p21cip1, p27kip1 and decreasing CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin D1, Cyclin D3. In summary, rhein induces apoptosis of multiple myeloma cells and inhibits proliferation through cell cycle inhibition.
19
고 찰
본 연구에서는 선행연구를 바탕으로 레인이 다발골수종에서 항암효과 및 증식 억제에 대해 연구하였다.
레인을 처리한 다발골수종 세포에서 세포자멸사 및 세포 증식 억제가 일어나는 것을 확인하였고, 레인의 농도가 증가할수록 세포자멸사와 세포 증식 억제가 증가하는 것을 확인하였다. 그리고 레인에 의한 다발골수종 세포의 세포자멸사는 caspase 경로에 의존적인 것을 알 수 있었고, 미토콘드리아 막 전위에도 밀접한 관련이 있다는 것을 확인하였다. 또한, 다발골수종 세포의 세포 증식은 세포주기와 관련이 있으며, 레인의 농도가 증가할수록 세포주기가 억제되는 것을 확인하였다.
결론적으로 다발골수종 세포에 레인을 처리하게 되면, Caspase-3, -7, -9, PARP- 1 의 활성이 증가하는 것으로 보아 caspase 경로에 의존적으로 세포자멸사가 일어나게 된다. 동시에 anti-apoptotic 단백질인 BCL-xL, MCL-1 이 감소하게 되고, pro-apoptotic 단백질인 Bax, Bak 은 증가하여 미토콘드리아 의존적 세포자멸사도 발생하는 것을 확인하였다. 그리고, 세포주기와 관련된 단백질인 CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin D1, Cyclin D3 가 감소하며, 사이클린 의존성 인산화효소 억제자 단백질인 p21cip1, p27kip1 이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 레인을 농도별로 처리한 후, 세포주기 구간을 확인했을 때, 세포자멸사 구간인 G0/G1 구간이 증가하는 것을 확인하였다.
실험의 한계점으로는 In vitro 의 결과를 바탕으로 다발골수종 이종이식모델에서의 레인의 효능을 검증하지 못한 것이다. 가슴샘을 제거하여 면역력이 저하된 생쥐에서 U266B1 세포가 종양을 형성하고 레인의 농도가 증가할수록 종양의 크기가 감소하여 In vitro 의 결과가 In vivo 에서 재연하여 생체내모델에서 안전성과 유효성을 검증하는 것이 필요하다. 또한, 다발골수종의 광범위한 기전을 밝히고 약물 안전을 보장하기 위한 추가 연구가 보장되어야 한다.
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현재, 다발골수종을 치료하기 위한 다양한 약물들이 존재하며, 지난 10 년 동안, 프로테아솜 억제제 (Bortezomib, Carfilzomib, Ixazomib) 및 면역조절제 (Thaliomide, lenalidomide, Pomalidomide) 약물로 치료되어 왔다 [50-51].
기존 치료제 중 특히, 최초의 단백질 억제제인 보르테조밉 (Bortezomib)은 다발골수종 환자의 치료에 효과적이었다 [52]. 보르테조밉은 특정 세포내 신호경로와 종양 미세환경 모두에 영향을 준다 [53-54]. 그러므로, 보르테조밉은 다발골수종에서 가장 일반적인 화학요법으로 사용하고 있다 [55-56]. 하지만, 현재 다양한 약물치료와 자가조혈줄기세포를 이식을 하는 방법에도 불구하고 약물에 대한 저항성이 나타남으로 재발에 시달리는 환자의 빈도가 높다 [57].
다발골수종은 재발하게 되면 치료 예후가 좋지 않기 때문에 재발 시 기존 약물들을 제외한 새로운 대체 약물에 대한 연구와 개발이 필요하다.
그러므로, 후속 연구에서는 레인과 보르테조밉의 상승효과와 다발골수종 세포에 보르테조밉을 이용하여 저항성 세포를 만드는 것을 진행하여 이후, 저항성 세포에서의 레인의 효과를 관찰할 것이다.
이 실험을 통해 얻은 결과를 바탕으로 레인과 현재 다발골수종 치료에 사용하는 치료제와 병행한다면, 더 높은 효과를 볼 수 있을 것이라 기대한다. 또한, 레인의 약리학적 효능을 이용해서 다발골수종의 치료에 임상응용 가능성 및 식물 성분을 이용한 약물 개발에 큰 도움이 될 것이라 생각한다.
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영문요약
Multiple myeloma (MM) is a blood disease that is caused by abnormal differentiation and proliferation of plasma cells in bone marrow. MM is characterized by infiltration of bone and cause immune disorders, hematopoietic disorders and kidney disorders. MM is difficult to cure with various treatment methods, and the risk of recurrence is high, so the prognosis is poor. Currently, it relies on commonly known anti-cancer drugs such as Lenalidomide, Bortezomib, and Dexamethasone and are showing resistance to the drug.
Rhein is a natural substance of Antra-quinone and is a traditional herb that is abundant in rhubarb and has been used as a laxative and stomach drug in Korea and China among Asian countries. rhein is known to have pharmacological efficacy such as anti-cancer, anti-bacterial, antioxidant, anti-inflammatory. however, the role of rhein in MM remains unknown.
As the concentration of rhein increased in MM cells, cell viability and proliferation were decreased and increased annexin V positive cells and caspase activity. In addition, the rhein reduced the membrane potential of mitochondria and increased the accumulation of cytochrome C in the cytoplasm of MM cells. it was confirmed that the cell cycle was inhibited by the rhein through Propidium iodide (PI)/RNase staining. In conclusion, rhein induces apoptosis in MM cells and inhibits cell proliferation.
Thus, rhein is a promising candidate for the treatment of multiple myeloma and this provides a new insight into the pharmacological effect of rhein, which would be beneficial for the development of this plant.
Key word : Multiple myeloma (MM), Rhein, Apoptosis, Caspase activation, Mitochondrial pathway, Proliferation, Cell cycle arrest
