사람 치수세포분화에 대한 영향 및 신호전달경로
Ⅲ-1. 서론
천연 식물추출물인 flavonoid와 terpenoid와 같은 저분자 물질들은 의학 적인 용도로서 골다공증을 치료하거나 뼈를 생성하기 위해 다양하게 연구 되어 왔다. 이러한 물질들은, 골 생성반응을 촉진시키므로 상아모세포 분 화에도 관련 가능성이 높고, 단백질계 생리 활성 물질보다 취급이 용이한 저분자 물질이라는 점에서, 치수복조술식의 성공률을 높이기 위한 MTA 의 보조약제 및 전처리약제로서 조명할 만한 가치가 있다.
가장 대표적인 플라보노이드인 quercetin과 kaempferol은 MG-63 hu- man osteoblasts의 ALP 활성을 촉진하는 것으로 알려졌고 (34), 쥐를 이용한 실험에서 kaempferol은 새로운 골형성을 유도한다고 보고되었다 (35). 또한 genistein은 골을 형성하고 사람의 골수 유래 줄기세포의 지 방분화를 촉진하는 것으로 보고되었다 (36). 더욱이 quercetin은 조골세 포에 대하여 NF-κB를 억제하면서 smad 활성을 촉진하는 것으로 보인다 (37). 또한 위에서 언급한 플라보노이드와 부분적으로 구조적 차이점을 갖는 baicalin과 baicalein도 조골세포의 분화를 촉진하는 것으로 보고되 었다 (38,39).
Quercetin과 kaempferol은 extracellular regulated kinase (ERK) 경로 와 estrogen receptor (ER) 경로를 통하여 조골세포의 분화를 증진시키 는 반면 (34), baicalin은 Wnt/β‐catenin 신호체계를 통하여 골형성에 관
여하는 것으로 알려져 있는데, 이는 플라보노이드간의 구조가 다르면 골 형성을 일으키는 기전도 다르다는 것을 제시하고 있다.
플라보노이드 외에 retinoid와 amiloride같은 다른 종류의 저분자 물질 도 조골세포의 분화를 촉진하는 것으로 보고된 바 있다 (40,41). 나트륨 채널 억제제로 알려진, amiloride의 일종인 phenamil은 조골세포의 분화 와 광화를 유도하는 것으로 나타났다 (41). Phenamil은 또한 poly (lactide-co-glycolide acid) (PLGA) scaffold에 첨가되어 골형성 촉진에 기여하는데, 이는 골 조직공학에서 유용하게 쓰일 가능성을 시사한다 (42).
위에 언급된 골형성능을 가진 저분자 물질들과 관련하여 조골세포의 분 화나 광화 등에 대한 연구는 있었으나 치수세포와 상아모세포에 대해서는 연구가 활발하게 진행되지 않았다. Retinoic acid가 쥐의 치수세포에서 osteopontin 발현을 증가시키고 (43),
Drynaria fortunei
에서 추출한 전 체 플라보노이드가 calcified nodule 형성 및 ALP 활성을 증가시킨다고 보고되었지만 (44), 순수 플라보노이드가 치수세포 분화에 미치는 영향은 아직 연구되지 않았다.본 논문에서는 사람의 치수세포를 서로 다른 3개의 플라보노이드 (gen- istein, baicalin, quercetin) 및 phenamil과 배양하여 ALP 활성, OCN과 DSPP의 mRNA 발현, 광화정도를 알아보았다. Quercetin, genistein, b- aicalin, phenamil의 화학구조는 Figure 5에 있다.
또한 플라보노이드의 상아질 형성효과에 관여하는 신호전달경로를 알아 보기 위하여 quercetin과 함께 ER 경로 억제제 또는 ERK 경로 억제제를 첨가하여 사람 치수세포를 배양한 후, ALP 활성을 측정해 보았다.
Figure 5. Chemical structures of quercetin, genistein, baicalin, and phenamil.
Ⅲ-2. 실험 방법 시약
세포배양에 사용된 배지 및 시약은 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 특별히 언급되지 않은 시약은 Sigma-Aldrich Co. (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
사람 치수세포 추출 및 배양
사람 치수세포는 서울대학교 치과병원 기관윤리위원회 (IRB)의 승인을 받 아 교정 목적으로 발거된 치아를 사용하였다. 치아는 70% ethanol로 닦 아내고 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)으로 수세한 후 무균 적인 방법으로 치근단을 잘라서 치수를 추출하였다. 분리된 치수세포는 20% FBS와 항생 물질용액 (100 U/mL penicillin-g, 100µg/mL strept- omycin)을 포함한 minimal essential medium (MEM)에 담근 후 조각을 내어 95% 공기, 5% CO2가 공급되는 37℃에서 배양하였다. 배지는 3일 마다 교환하였다. 배양 20일째 trypsin으로 세포를 취하고 새로운 MEM 에 재배양하여 second passage를 얻었다. 본 실험에서 사용된 세포는 f- ifth passage이다.
세포독성시험
세포독성은 Cell Counting Kit-8 (WST-8; Dojindo Laboratories, Gu- mamoto, Japan)으로 측정하였다. MEM 배지에서 플라보노이드와 phen-
amil의 농도를 다양하게 하여 (1-50µM) 24시간 동안 사람 치수세포에 적용한 후, 치수세포를 PBS에서 세척하고 WST-8 10%가 포함된 신선한 MEM에서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 배양 1시간 후, plate reader 기 (Sunrise, TECAN, Salzburg, Austria)로 450nm에서 흡광도를 측정 하였다.
ALP 활성 측정
사람 치수세포의 ALP 활성 측정은 4-nitrophenyl phosphate 비색측정 법으로 평가하였다. 간단히 기술하면, MEM에서 confluent까지 배양한 후, 분화배지 (MEM including 50µg/mL ascorbic acid, 10-8M dexam- ethasone, 2mM β–glycerophosphate)에서 6일간 재배양했다. 처리된 세 포를 PBS에서 세척한 후, 1.5M MgCl2 10µl와 alkaline buffer solution (67mM 4-nitrophenyl phosphate; Fluka, Buchs, Switzerland) 140µL 를 각 well에 주입했다. 37℃에서 30분 후, 0.5M NaOH를 첨가하여 반 응을 종료시키고, 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. ALP 활성은 총 세포단백질 1mg당 효소 활성으로 나타내었다. 단백질 함량은 bicincho- ninic acid (BCA) 단백질 측정 kit (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 측 정하였다.
Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)을
이용한 유전자 발현 측정
Quercetin과 phenamil의 DSPP, OCN의 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 사람 치수세포를 quercetin 및 phenamil과 10일간 처리하였 다. RNA extraction reagent (WelPrep Total RNA Isolation Reagent;
Welgene Inc., Daegu, Korea)로 total RNA를 추출하고 cDNA synthe- sis kit (Poer cDNA Synthesis kit; iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)로 cDNA를 합성하였다 (29). RT-PCR은 10µL SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Japan), 0.4µL ROX Reference Dye II (T- akara Bio), cDNA 및 primer가 포함된 혼합물 (20µL)에서 진행되었으 며, primer는 ABI PRISM 7500 Sequence Detection System Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 열순 환 처리하였다. 사용된 primer의 sequence와 열순환 처리조건은 이전에 기술하였다. DSPP와 OCN 유전자 발현은 CT값을 바탕으로 표현하였고, GAPDH의 CT값에 대한 비로 나타내었다.
광화측정
Alizarin red S로 염색하여 세포외기질의 광화를 관찰하였다 (45). 분화 배지에서 사람 치수세포를 quercetin과 phenamil에 25일간 처리하였다.
Paraformaldehyde로 1일 동안 고정한 후, 증류수로 세척하고 alizarin red S 용액으로 10분간 염색하였다. 그 후, 수도물로 세척하고 실온에서 건조하였다. Alizarin red S의 정량방법은 modified cetylpyridinium m- ethod에 의거하였다 (45).
Western blot
Quercetin의 ERK 인산화 및 DSPP와 OCN 발현에 대한 영향을 western blot으로 분석하였다. ERK 인산화 분석실험을 위해서 사람 치수세포를 PD98059 (ERK1/2 inhibitor)와 함께 2.5µM quercetin에 6시간 동안 노 출시켰고, DSPP와 OCN 발현실험을 위해서는 사람 치수세포를 10일 동 안 quercetin으로 처리하였다.
Western blot 분석을 위하여 4℃에서 15분간 세포를 cold NP-40 lysis buffer (pH 7.6) (50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 10% glycerol, 1%
NP-40, 1µg/ml pepstatin, 1µg/ml leupeptin, 1µg/ml aprotinin, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)에 용해시켰다. 세포 용해물을 수집하여 10분간 원심분리 (14,000 × G)하였다. 용해물의 단백질 농도는 protein measurement kit (Pro-Measure; iNtRON Biotechnology)로 측정하였 고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 적용하였다. 전기영동 후 단백질은 polyvinylidene difluoride transfer membrane (Hybond-P;
Amersham Biosciences, Bucks, England)으로 옮겨져서 PBST (PBS containing 6% low-fat milk and 0.1% Tween 20)로 처리하였다.
Blot은 monoclonal mouse anti-pERK1/2 Ig, monoclonal mouse ant- i-DSPP Ig 혹은 polyclonal rabbit anti-OCN Ig과 함께 PBST에서 1시 간동안 배양하고 PBST로 두 번 수세한 후, goat anti-mouse Ig 혹은 goat anti-rabbit secondary Ig conjugated to horseradish peroxidase 로 탐침하였다. Chemiluminescence kit (WEST-ZOL plus Western Bl- ot Detection System; iNtRON Biotechnology)와 luminescent image
analyzer (LAS 1000 plus; Fuji PhotoFilm, Tokyo, Japan)로 단백질 밴 드를 관찰하였다. Polyclonal rabbit anti-GAPDH Ig로 blot을 재탐침하 였다. 실험에 사용된 모든 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa C- ruz, CA, USA)에서 구입하였다.
통계처리
모든 실험값은 각각 독립적인 3번의 실험 결과의 평균이며, 통계 처리가 필요한 경우 실험군과 대조군간의 값을 Student’s t-test로 비교하였으 며, p<0.05일 때 혹은 p<0.01 일 때 유의한 것으로 정의하였다.
Ⅲ-3. 실험 결과
세 종류의 플라보노이드와 phenamil이 사람 치수세포의 viability와 ALP 활성에 미치는 영향
ALP 활성측정을 위한 최적의 농도를 결정하기 위하여 quercetin, gen- istein, baicalin, phenamil의 독성을 평가하였다. 상기 시료들의 농도를 달리하면서 24시간 동안 사람 치수세포에 노출시켰다 (농도: 1-50µM).
Figure 6A에서 보는 바와 같이 quercetin과 phenamil은 높은 농도에서 독성을 보이는 반면 genistein과 baicalin은 실험 조건의 어떠한 농도에서 도 세포의 활성에 영향을 주지 않았다. 50µM 농도에서 quercetin과 ph- enamil은 세포 활성을 각각 대조군 대비 57.3%, 23.4% 감소시켰다. 이 에 따라 ALP 활성을 평가하기 위한 실험에서는 시약의 농도를 1-25µM 로 하기로 하였다.
분화유도배지 (DM)에 플라보노이드와 phenamil를 첨가하면 치수세포의 ALP 활성이 증가하였다 (Figure 6B). 플라보노이드 중에서는 quercetin 이 ALP 활성을 가장 많이 유도하였다. 1-10µM 사이의 농도에서 통계적 으로 유의할 만한 ALP 활성증가를 보였는데 2.5µM 농도에서 최대치를 보였다. 반면에 genistein과 baicalin에서는 ALP 활성이 단일 농도에서만 증가되는데 (각각 2.5µM, 5µM), 이는 ALP 활성을 촉진하는 농도의 범위 가 quercetin보다 좁다는 것을 의미한다.
플라보노이드와 비교해서 phenamil의 효과는 더 두드러졌으며 상대적으 로 더 높은 농도 (5-25µM)에서 효과적이었다. 10µM에서 phenamil은 약 4배의 ALP 활성 증가를 보였다. 각 시료에서 보인 ALP 활성 최대치에
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Figure 6. Effects of small chemicals on cell viability (A) and ALP activity (B) in HDP cells. For the cytotoxicity assay, the cells were treated with the chemicals at various concentrations for 24 h. Cell viability was expressed as a percentage relative to the untreated control cells. For the ALP activity assay, HDP cells were incubated in normal growth media (GM) and differentiation-inducing media
(DM) with or without the test chemicals for 6 days. The ALP act- ivities of the test groups were compared with that of untreated c- ells cultured in DM. Each value represents the mean ± SD obtai- ned from the triplicate experiments. In the ALP activity results, * and ** indicate significant differences between the DM control gr- oup and the test groups at
p
< 0.05 andp
< 0.01, respectively.근거하면 phenamil이 가장 효과적이었으며 quercetin, baicalin, genist- ein의 순이다.
Baicalin과 genistein의 효과는 미비했으므로 이후에 진행된 실험에서는 quercetin과 phenamil만을 사용하였다.
Quercetin과 phenamil이 DSPP와 OCN mRNA 발현에 미치는 영향
사람 치수세포에 quercetin 또는 phenamil를 첨가한 실험군과 시료를 첨 가하지 않은 대조군으로 나누어 10일간 성장배지 (GM)와 분화배지 (DM) 에 각각 배양한 후, quercetin과 phenamil이 사람 치수세포의 상아질 분 화에 미치는 영향을 조사하기 위해 RT-PCR로 DSPP와 OCN mRNA를 측정하였다. Figure 6B에서 ALP 최대 활성을 보인 농도에서 최종 농도 를 정했다 (quercetin 2.5µM, phenamil 10µM).
mRNA 수치는 분화배지 (DM)의 mRNA를 기준으로 비교하였다. Figure 7에서 보는 바와 같이 quercetin과 phenamil에 의해 DSPP와 OCN mRNA 발현이 모두 상승하였다. DSPP mRNA 발현의 경우, quercetin과 phenamil에 의해 각각 4.2배, 2.6배의 발현 증가를 보였고, OCN mRNA 의 경우, quercetin과 phenamil은 비슷한 수준 (약 2.5배)으로 발현을 증 가시켰다.
본 실험에 사용된 농도에서 상아질 광화에 필수적인 DSPP에 대한 효과 만을 고려했을 때, 상아질 분화를 유도하는 효과에 있어서는 quercetin이 phenamil 보다 더욱 효과적인 것으로 보인다.