Figure 15. Images of hematoxylin & eosin (H&E) staining of Tutoplast® cartilage (TC), undifferentiated adipose-derived stem cell on TC (ADSC-TC) and chondrogenic differentiated ADSC-TC at postoperative week 4. Scale bars = 50 μm.
Figure 16. Images of Safranin O staining of Tutoplast® cartilage (TC), undifferentiated adipose-derived stem cell on TC (ADSC-TC) and chondrogenic differentiated ADSC-TC at postoperative week 4.
Scale bars = 50 μm.
지만 미분화 연골군과 유의한 차이를 보이지 않았다. COL10A1과 ACAN은 세군 모두 유의한 차이 없이 비슷한 발현 정도를 보였다.
수술 4주 후 채취한 조직에 대해서 COL1A2의 발현은 분화 연골군
에서 가장 높았으며 대조군과의 차이는 유의하였다 (Fig. 18).
COL2A1은 미분화 연골군과 분화 연골군의 발현이 대조군에 비해 월 등히 높았으며 이는 통계학적으로 유의하였다. COL10A1과 ACAN은 분화 연골군의 발현이 나머지 두군에 비해 유의하게 높았으며 미분화 연골의 발현도 대조군에 비해 유의하게 높았다.
Figure 17. Quantitative real-time PCR analysis of COL1A2, COL2A1, COL10A1 and ACAN at postoperative week 2 among Tutoplast® cartilage (TC), undifferentiated adipose-derived stem cell on TC (ADSC-TC) and chondrogenic differentiated ADSC-TC. n = 5 per group. *, p < 0.05 versus Tutoplast® cartilage group.
Figure 18. Quantitative real-time PCR analysis of COL1A2, COL2A1, COL10A1 and ACAN at postoperative week 4 among Tutoplast® cartilage (TC), undifferentiated adipose-derived stem cell on TC (ADSC-TC) and chondrogenic differentiated ADSC-TC. n = 5 per group. *, p < 0.05 versus Tutoplast® cartilage group. #, p < 0.05 versus both Tutoplast® cartilage and undifferentiated ADSC-TC groups.
고찰
이번 연구에서 Tutoplast® 연골이 스캐폴드로서 지방유래 줄기세포 의 생착이 가능한지 그리고 생착된 지방유래 줄기세포가 연골로 분화 가 가능한 지 확인하였다. 이를 위해 인체에서 획득한 지방유래 줄기 세포를 in vitro 환경에서 2차원적 및 3차원적 배양을 통해 연골세포 로의 분화 과정을 확립하였다. 이어서 Tutoplast® 연골에 지방유래 줄 기세포가 생착될 수 있는 조직인지 전자현미경을 통해 확인하였고, 궁극적으로 지방유래 줄기세포가 처리된 Tutoplast® 연골을 실험동물 에 이식하였을 때 관찰기간동안 줄기세포가 유지되었을 뿐만 아니라 연골세포로 분화시킨 지방유래 줄기세포가 Tutoplast® 연골과 통합되 어있음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 Tutoplast® 연골에 지방유래 줄기세포를 처리하고 연골 신생을 유도하는 연구는 이번이 처음이다.
중간엽줄기세포는 연골세포뿐만 아니라 근육세포, 지방세포, 혈관내 피세포 등으로의 분화능이 있어 세포치료를 통한 재생의학의 주요 재 료로서 각광받고 있다.28 지방유래 줄기세포는 중간엽줄기세포의 하나 로서 지방조직의 결합조직 안에서 미세혈관에 둘러싸여 분포하고 있 다.29 지방조직은 피하층에 풍부하게 존재하므로 지방유래 줄기세포는 손쉽게 상당한 양을 획득할 수 있어 같은 중간엽줄기세포인 골수유래 줄기세포보다 선호도가 높다. 따라서 연골의 재생에 있어 중간엽줄기 세포로서 지방유래 줄기세포를 이용하는 연구는 다양하게 이뤄지고 있다.30
현재로서는 정형외과 영역에서 골관절염과 관련하여 연골재생을 위
가 있기 때문에 내재적인 재생능력이 낮다. 이로 인해 자가연골세포 를 직접 이식하는 시도가 있었지만, 공여부 연골이 필요하고, 이식된 연골세포가 미분화되는 한계를 보여 지금은 시행하고 있지 않다.31,32 대안으로 연골세포로의 분화능을 가진 지방유래 줄기세포를 이용하여 관절연골의 재생을 꾀하고 있으며 좋은 결과를 보고한 연구가 다수 존재한다.30
이번 연구는 넓은 의미에서 연골재생과 맥락을 같이 한다. 방사선 처리된 동종 늑연골은 면역성을 상실하였기 때문에 연골의 물리적 성 상을 지닌 이식물질로 간주할 수 있는데, 늑연골에 처리한 지방유래 줄기세포가 연골 신생 media에 의해 연골세포로 분화되어 이식 후 실험동물 체내에서 유지되고 있었기 때문이다. Safranin O 염색으로 구분이 되었지만 새롭게 분화된 연골층이 기존의 동종 늑연골과
H&E 염색으로 구분되지 않을 정도로 통합되어있는 점은 특기할만하
다. 하지만 Safranin O 염색으로 구분된 두 연골층이 기존의 동종 늑 연골과 신생 연골이 맞는지, 염색으로 구분되는 원리는 무엇인지에 대한 후속 연구가 필요하다.
이번에 사용한 Tutoplast® 연골은 정상 연골과 마찬가지로 연골세포, 수분, 프로테오글라이칸 등으로 동일하게 구성되어 있다.33 제조과정에 서 삼투, 산화, 용제 처리 및 감마선조사를 통해 각종 병원균과 바이 러스 등을 제거하여 감염성 질환으로부터 안전성을 확보하는 한편, 연골세포의 표면에 발현하는 주조직적합성 제1급 항원을 약화시켰 다.11 하지만 수술 중 Tutoplast® 연골을 조각하는 과정에서 노출되는 내부 구조물과 연골 파편들이 비록 강도는 약하더라도 면역거부반응 을 일으킬 수는 있다. 따라서 Tutoplast® 연골 표면에 이식 처리된 지 방유래 줄기세포 및 줄기세포에서 분화된 연골세포는 Tutoplast® 연
골의 표면 노출을 줄여 면역거부반응의 발생 가능성을 낮추는 부수적 인 효과도 얻게 되었다고 생각할 수 있다.
이번 연구의 임상적 가치는 환자의 체지방에서 획득한 지방유래 줄 기세포를 이식할 동종 늑연골에 처리하여 연골 신생을 유도한 후 원 하는 부위에 이식함으로써 동종 늑연골이 가진 단점과 한계를 극복할 수 있다는 점이다. 만약 자가 지방유래 줄기세포가 아닌 동종 지방유 래 줄기세포를 적용하여 유사한 결과를 얻게 된다면 연구의 임상적 가치는 더욱 높아진다. 지방유래 줄기세포는 면역성이 매우 낮아 면 역거부반응을 일으키지 않으며, 이와 함께 면역억제효과를 보인다는 연구들이 있는데 자가34 혹은 동종35,36 줄기세포뿐만 아니라 이종37 줄 기세포도 비슷한 효과를 보인다는 점이 흥미롭다. 따라서 건강한 기 증자로부터 획득한 지방유래 줄기세포를 동종 늑연골에 처리하여 연 골세포로 분화시킨 후 다른 환자에게 이식하는 방법도 이론적으로는 가능하다. 하지만 현행법상 기질혈관분획이 아닌 지방유래 줄기세포 를 이식하는 것은 법률에 위배되기 때문에 현재로서는 임상에 적용하 는 것은 불가능하다.
이번 연구에서 동종 늑연골에 처리한 지방유래 줄기세포가 추후 연 골세포로 분화하는 것에 대해 전자현미경으로 세포의 형태를 관찰하 고, 조직학적 소견과 연골 특이 유전자인 COL1A2, COL2A1, COL10A1 및 ACAN의 발현을 분석하였다.27,38 이전 연구들에서 연골 특이 유전자로 알려져 있는 다수의 유전자 중에서 흔히 사용되는 것 들로 선택하였으며, COL1A2, COL2A1, COL10A1 및 ACAN, 이 네 가 지 유전자의 발현 양상이 유사하게 나타난 점을 통해 이번 연구 결과 의 신뢰도를 높일 수 있었다.
세포의 일부가 연골세포로 분화된 것을 관찰하였고, 이식 4주 후 신 생 연골이 유지됨을 확인할 수 있었다. 실험동물을 이용한 이식술시 세 가지 군으로 나누어 실험을 진행하였는데, 2군의 미분화 연골군에 서 조직학적 소견상 동종 늑연골 표면에 두꺼운 세포층이 관찰되었으 나, 유전자발현 분석에서 연골 특이적 유전자발현이 3군인 분화 연골 군에 못지않게 통계학적으로 유의하게 높았던 점은 예상치 못한 결과 였다. 이는 비록 면역성이 사라진 동종 늑연골이라 하더라도 동종 늑 연골이 조성하는 체내 환경이 연골 특이적 유전자발현 및 이로 인한 연골로의 분화에 영향을 미쳤다고 볼 수 있다. 하지만 1군인 대조군 에서는 연골 특이적 유전자발현이 거의 없었던 점을 볼 때 섬유모세 포에 없는 지방유래 줄기세포의 연골분화능이 1군과 2군의 결과에 차 이를 보인 것이라 추정할 수 있다. 따라서 지방유래 줄기세포는 방사 선 처리된 동종 늑연골 표면에서 연골 신생의 유전자가 발현될 수 있 으나 실제로 연골로 분화하기 위해서는 연골 신생 media와 같은 외 부 자극이 필요하다고 결론지을 수 있다.
이번 연구는 몇 가지 한계를 가지고 있어 이를 보완하기 위한 후속 연구가 필요하다. 첫째, 지방유래 줄기세포를 처리한 동종 늑연골을 이식한 후 관찰 기간이 4주 밖에 되지 않았다. 누드마우스와 인체의 환경이 다르지만, 동종 늑연골에 대한 임상논문 중 추적기간이 길었 던 논문에서 합병증의 비율이 높았던 점을 고려하였을 때 추후 연구 에서 4주 이상의 장기 추적시 안정적 사용에 대한 신뢰도가 높은 결 과를 얻을 수 있으리라 판단된다. 둘째, 지방유래 줄기세포 처리가 동 종 늑연골의 물리적 성상에 미친 영향에 대한 평가가 부족했다. 비록 분주한 지방유래 줄기세포와 분화로 인해 신생된 연골이 기존의 동종 늑연골 표면에 위치하였지만 배양과정이나 신생 연골이 동종 늑연골
의 강도나 유연성에 변화를 일으켰는지에 대한 확인은 후속 연구에서 필요하다고 할 수 있다. 셋째, 궁극적으로 동종 늑연골에 처리한 자가 지방유래 줄기세포가 인체 내로 이식되었을 때 수혜부 조직과의 자연 스러운 유착에 어떠한 영향을 미치는지 확인되어야 한다. 인체유래 줄기세포를 체내에 이식하는 행위는 현행법상 불가능하다. 따라서 마 우스와 같은 실험동물에서 획득한 지방유래 줄기세포로 동종 늑연골 을 처리하고 실험동물에 이식함으로써 동종 늑연골이 가지고 있는 문 제점이 해결될 수 있는지 간접적으로 확인할 수 있겠다.
결론
이번 연구에서 인체에서 얻은 지방유래 줄기세포를 in vitro 환경에 서 2차원적 및 3차원적으로 배양과 연골세포로의 분화를 거쳐 성공적 으로 연골세포를 만들어 낼 수 있었다. 확립된 배양방법을 이용하여 방사선 처리된 동종 늑연골인 Tutoplast® 연골에 지방유래 줄기세포 를 분주하여 연골의 표면에 유착됨을 전자현미경 소견으로 확인하였 다. 뿐만 아니라 유착된 지방유래 줄기세포가 연골 신생 media 하에 서 연골세포로 분화함을 확인하였다. 연골 신생이 일어난 동종 늑연 골을 실험동물의 피하에 이식하여 2, 4주후 관찰한 결과 Tutoplast® 연골 표면에 유착된 신생 연골은 관찰 기간 동안 신생 연골이 유지되 었을 뿐만 아니라 기존의 Tutoplast® 연골에 통합되어있음을 확인할 수 있었다. 따라서 연골이 필요한 치료에 있어서 방사선 처리된 동종 늑연골을 보다 안정적으로 사용할 수 있는 실험적 근거를 제공하였다 는데 이번 연구에 의의가 있다고 할 수 있겠다.