II. 실험재료 및 방법
8. 목별자 추출물의 분석법 밸리데이션 연구
목별자의 지표성분을 정량하고자 할 때 이에 대한 시험법을 통해 얻어진 데이터가 신뢰할 수 있음을 증명하고자 분석법 밸리데이션 연구를 실시하였다.
밸리데이션을 위해 사용되는 용어의 정의는 아래와 같다.
1) 정확성 (accuracy/trueness) : 시험방법으로 얻어진 시험결과(실측치)와 진실의 수치(참값)와 일치하는 정도를 나타내는 것이다. 정확성은 종종 기지량을 첨가한 검체의 분석에 의한 회수율로 나타내며 시험법의 정확도를 재는 척도이다.
2) 정밀성 (precision) : 균일한 재료로부터 다수의 검체를 시험했을 때 시험결과 간에 일치(재현성)하는 정도를 나타내는 것을 말한다.
일반적으로 시험법의 정도는 표준편차 또는 상대적 표준편차(변동계수)로 나타낸다.
3) 특이성 (specificity) : 특이성이란 공존이 예측되는 불순물, 분해물, 배합성분 등의 존재 하에서 이 성분들의 영향을 받지 않고 분석 대상물을 정확하고 특이적으로 측정할 수 있는 능력을 말한다.
4) 직선성 (linearity) : 시험법에 있어서의 직선성이란 검체 중에 함유되어 있는 분석대상물의 양 또는 농도에 대하여 직선적인 비례관계를 나타내는 능력을 말한다.
분석법 밸리데이션을 위한 분석기기 및 조건은 아래 Table 7와 같다.
Table 7. Instruments and condition for analytical method validation
Instrument Model
UPLC sample manager Acquity sample manager Sample loop Partial loop with needle overfill Wash Solvent Strong solvent: acetonitrile
Weak solvent: H2O-Acetonitrile, 90:10 (v/v)
Temperature Column: 30℃ ± 1℃
Sample manager: 25℃ ± 3℃
Detector Tunable UV detector (210 nm)
PDA UV detector
Manager S/W Empower
Analytical column ACQUITY UPLC® BEH C18, 1.7 μm Mobile phase 0.2% phosphoric acid-acetonitrile 60:40 (v/v) Injection volume 2.0 μL
Flow rate 0.5 mL/min
분석법 밸리데이션 시험 항목별 시험방법은 아래와 같다.
1) 특이성 (specificity), 분리능 (resolution), 대칭성 (symmetry) : 표준액 및 검액을 HPLC로 분석하였을 때 다른 모든 피크와 주성분의 피크가 겹치지 않음을 확인한다.
2) 정밀성 (precision)
- Repeatability : 동일 검체를 최소 6회 이상 반복 조제하여 조제 간의 상대표준편차를 구하고자 한다.
- Reproducibility : 다른 날, 다른 실험실, 다른 기기에서 동일 검체를 최소 6회 이상 반복 조제하여 조제 간의 상대준편차를 구한다.
3) 직선성과 범위 (linearity and range): 함량 분석 농도의 300% 이상의 표준액을 이동상으로 희석 제조하여 UPLC 분석하여 직선성을 확인한다.
4) 정확성 (accuracy)
- 표준액 정확성 : 약 60%, 100%, 140% 양에 해당하는 표준품을 취하여 희석액에 녹여 샘플을 제조하여 분석 후, 첨가한 표준품과 계산된 표준품의 회수량을 비교하여 회수율을 평가한다.
- 검액 정확성 : 약 60%, 100%, 140% 양에 해당하는 검체를 취하여 희석액에 녹여 샘플을 제조한 후, 제조된 샘플을 계산된 표준액에
spiking 하거나, 샘플에 계산된 표준품을 추가한 후에 각각 첨가한
표준품과 계산된 표준품의 회수량을 비교하여 회수율을 평가한다.