본 연구에서 NUP62는 활액막 육종, 섬유 육종과 같은 기존의 방사 선 저항성 육종의 치료에서 방사선 민감제의 타겟으로써 잠재적 가능성 을 확인하였다. siRNA를 이용한 NUP62의 발현 억제 단독으로는 세포 성장 및 증식을 억제하지 않으나, 방사선 조사 후에는 세포 성장 및 증 식을 억제하였고, BCL-2 발현을 억제하는 기전으로 세포자멸사에도 영 향을 주었다. 또한 전리 방사선 치료 후 발생하는 DNA 이중 나선의 손 상을 증가시키고 그 회복 기전을 더디게 만들어 방사선 치료의 민감성 을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
NUP62는 Nuclear pore complex (NPC)를 구성하는 nucleoporin 중 하나로, NPC는 게놈의 안정성 유지와 전리 방사선 치료 후 발생하는 DNA 이중나선 손상의 민감도에 영향을 주는 것으로 최근 보고되고 있
다.11-16 Hashisume 등은 NUP62의 siRNA로 발현을 억제시킨 HeLA
세포주에서 다핵 세포(multinucleated cell)가 증가함을 발견하였는데 이는 G2/M phase arrest와 세포사가 증가한 것과 연관이 있다고 보고 하였다.14 이를 통해 NUP62가 중심체 분리 (centrosome segregation), 중심 소체 성숙(centriole maturation) 및 방추사 방향 (spindle orientation)을 조절하여 유사 분열 세포주기 진행 조절에 관여한다고 보고하였다. Rodriguez 등은 상피성 암종 세포주에서 NUP54의 발현 억제가 방사선 치료 후 세포사를 증가시키는데, 그 기전 중 하나로 DNA
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이중 나선 손상의 homologous recombination 회복 과정을 더디게 함 을 보고하였다.13
NUP62 발현 억제와 방사선 조사는 BCL-2 발현 억제를 통하여 활 액막 육종, 섬유 육종, 횡문근육종 세포주에서 세포자멸사를 증가시키 는 것을 확인하였다. BCL-2의 발현 억제의 경우, 세포주 별로 패턴의 차이가 있었는데, SW982의 경우 방사선 조사 없이 NUP62 발현 억제 만으로도 BCL-2의 발현 억제를 보여주었고, 방사선 조사 시에는 그 효 과가 더 커지는 것을 보여주었다. 반면 NUP62의 단독 발현 억제에서는 cleaved PARP는 발현되지 않고, 방사선 치료와 같이 처리하였을 경우 cleaved PARP의 발현이 더 커지면서 세포자멸사를 유도하였다. HT- 1080, RH30의 경우는 NUP62의 발현억제와 방사선 조사를 같이 했을 때 BLC-2의 발현 억제와 cleaved PARP의 발현이 증가됨을 보여주었 다. RH30의 경우는 MCL-1의 발현이 NUP62 발현 억제와 방사선 조 사를 같이 했을 때만 떨어지는 패턴을 보이나 SW982와 HT-1080에서 는 특별한 경향성이 없다. BCL-2와 MCL-1이 세포자멸사를 억제하는 비슷한 기능을 하고, 이를 각각 표적으로 하는 억제제들이 소아 육종이 나 흑색종 실험 연구에서 세포 자멸사를 빨리 유도하는 효과가 있을 수 있다고 알려져 있다.17,18 NUP62의 발현 억제와 방사선 조사는 일부의 세포에서는 BCL-2에 발현 억제 경로에 주로 작용하고, RH30과 같은 경우는 두가지의 경로에 모두 작용하는 것으로 보이며, 이는 육종의 아 형에 따라 NUP62의 발현 억제가 세포 자멸사에 미치는 하위 경로가 다
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를 수 있음을 시사한다. 반면 정상 세포주에서는 NUP62의 발현 억제와 방사선 치료의 처치에도 세포 자멸사를 유도 하지 않는 것을 확인할 수 있어 방사선 민감제의 표적으로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
방사선 민감도가 증가한 SW982, HT-1080에서 NUP62의 발현 억 제와 방사선조사는 DNA 이중 나선 손상의 증가를 증가시킴을 확인하 였다. DNA 이중 나선의 손상은 전리 방사선 치료 후 세포에서 나타나 는 직접적 효과 중의대표적인 기전이고, 손상된 DNA 이중 나선 부위에 γH2AX가 생겼다가 정상의 경우에는 빠르게 여러가지 회복 기전을 통 해 회복 된다.19-21 NUP54의 상피암종에서 방사선 민감제 효과를 보여 준 문헌에서는 homologous repair 기전에 작용함으로써 DNA 이중 나 선 손상의 회복을 더디게 하여 방사선 민감도를 증가한다고 보고 하였 다.13 본 연구의 소견도 기존의 보고와 비슷한 경향을 보였다. 특히 SW982 세포주에서는 증가된 γH2AX가 대조군에서는 발현의 양도 적 었으며, 빠른 시간 안에 회복되는 반면, NUP62를 발현 억제시킨 처치 군에서는 발현의 증가가 48시간까지도 지속되어 NUP62가 세포 자멸 사뿐 아니라 DNA 이중 나선 손상의 회복 기전에도 관여함을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 siRNA 스크리닝을 통해 얻은 후보군인 NUP62와 기 존에 보고된 NUP54의 siRNA를 이용하여 일부 육종 세포주에서 먼저 방사선 민감도의 증가 여부를 확인하였고, 그 결과 상피성 암종의 경향 과는 다르게 NUP62의 방사선 민감제로서의 가능성을 확인하였으며,
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NUP54는 육종에서의 방사선 민감제의 역할이 떨어지는 것을 확인하였 다. 13 임상적으로 RH30, A673은 기존의 방사선 치료에 잘 듣는 횡문 근 육종과 유잉 육종의 세포주인데, 이들에서는 NUP62의 방사선 민감 제로서의 추가적인 역할을 SW982나 HT1080에 비하여 크게 확인할 수 없었다. 육종안에는 수많은 조직학적 아형이 있으며, 같은 조직학적 아 형 안에도 아직 밝혀지지 않은 유전적 차이들이 존재하여, 일반화 하기 어렵겠으나, 본 연구에서는 방사선 저항성 육종 세포주에서 NUP62의 발현 억제로 방사선 치료의 민감성을 향상시킬 수 있음을 확인한 것에 의미가 있을 것으로 생각된다. 또한 기존의 문헌에서 NUP54가 제일 효 과적이었던 것에 비하여 NUP family를 이용한 방사선 민감제의 실험 에서 상피성 암종과는 다른 특성을 보임을 확인하였다.13 이는 상피성 암종의 방사선 민감제의 연구가 육종에서 그대로 적용되지 못할 수 있 음을 시사한다.
육종에서 종양 세포의 방사선 민감도를 증가시킬 수 있는 표적 물질 (molecular target)에 대한 미충족 수요가 매우 크지만, 육종 전반에 방 사선 민감제로 작용할 수 있는 후보 물질을 탐색하는 기존 선행연구는 거의 없는 상태이다. 상피성 암종에서는 여러가지 방사성 민감제에 대 한 임상 시험도 진행 중이고, 김 등은 최근 FES가 상피성 암종에서 새 로운 방사선 민감제의 타겟이 될 수 있음을 보고하였다.21,22 반면 육종 의 방사선 민감제 연구에서는 Ifosfamide, Gemcitabine 등일 비롯한 기 존의 항암제나 PDGF α 단클론 항체(Olartumumab), mTOR inhibitor
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(Rapamycin) 등을 이용하여 항암 방사선 요법(chemoradiation)에서 방사선 치료의 민감제로 사용하였던 일부의 임상 연구와 동물 실험들의 보고가 있으나, 대부분은 2-3개의 육종 세포주를 이용한 연구이고 아 직은 임상에 광범위하게 적용되지 못하고 있다.7-10 발생 빈도가 매우 드 물지만, 수십 개의 조직학적 아형을 가지고 있어 이질성이 매우 큰 육종 의 특성상, 한 개의 조직학적 아형에 대한 표적 물질을 스크리닝 하는 것은 매우 오랜 시간과 노력이 소요될 것으로 보인다. 그러므로, 암세포 에 방사선 치료 시에 일어나는 병리 기전에 공통적으로 작용할 수 있는 후보 물질에 대하여 탐색하고 검증해보는 것이 빠른 임상 적용의 가능 성을 높일 수 있는 방법이 될 수 있을 것이다. 예컨데, 활액막 육종에서 과발현되는 TLE1을 siRNA를 이용하여 발현 억제 시켰을 때, 항암제 민감성은 증가하나 방사선 민감도는 증가하지 않았던 예비 실험 결과를 고려하면, 특정 세포에서 과발현 되는 물질 타겟보다는 초기단계에서는 공통 기전에 작용하는 후보 물질을 찾는 것이 더 효과적일 수 있을 것이 다 (Supplementary figure 1.). NUP62는 정상 세포에서도 발현되며, 본 연구의 결과처럼 NUP62의 발현 억제가 육종 세포의 성장 및 사멸에 유의미한 악영향을 주지 않으면서, 방사선 치료 후에 민감도가 증가하 는 결과는 임상 적용 시 방사선 치료의 독성에 대한 염려를 줄일 수 있 는 가능성을 시사한다. 14-16
siRNA를 이용한 치료는 암을 비롯한 다양한 질병에서 시도되고 있으나, 효과적으로 안전하게 siRNA를 전달하는 전달체 (carrier)에 대
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한 미충족 수요가 여전히 매우 크다. Viral vector, non-viral vector 등 의 다양한 방식의 전달체 연구가 있으나 현재까지는 효과 및 생체 안정 성 문제로 실제 임상에 적용되는 경우가 많지 않다.23-26 다만, 현재 제 한점들을 극복하기 위한 여러가지 방식의 siRNA 전달체에 대한 많은 연구가 진행되고 있기 때문에, 안정적 전달체의 확보가 된 후에는 지금 까지 밝혀진 많은 siRNA 치료 후보군들을 빠른 임상으로 진입하게 해 줄 가능성이 있다. 따라서 육종에 대한 후보 물질 스크리닝의 결과는 후 속 연구 개발 및 안정적 전달체가 이용 가능 할 때 빠른 임상 적용 가능 성을 높일 수 있을 것으로 예상할 수 있어, 본 연구가 비록 예비 연구의 성격이 있으나 그 의의가 있을 것으로 생각된다.
본 연구의 제한점은, 첫째로 국내에서 상업적으로 구매 가능한 육종 세포주 중 집락 형성이 가능하였던 육종 세포주 5개를 대상으로 하였으므로 전체 육종의 방사선 민감도의 결과를 대표하지 못하는 측면 이 있다. 또한 세포주의 실험으로 실제 임상의 결과를 예측하는 것의 제 한점도 있다. 육종이 수십 가지의 조직학적 아형이 있는 것과 모든 육 종 세포주가 갖춰져 있지 않은 점을 고려하면, 현실적인 수준에서 피할 수 없는 제한점이 되겠다. 두번째로, 본 연구에서 후보물질의 스크리닝 과정에서 육종 세포주가 아닌 폐암 세포주 (A549) 를 사용하였다. 상업 적으로 구매가능한 siRNA library를 이용하여 후보 물질을 발굴하는 것 은 여러 방사선 민감제 연구에서 사용하는 방법론 중 하나이며 특히 kinase library를 사용하는 것은 추후 druggable target을 찾는데 더 유