인제대학교 의과대학 일산백병원 소아과학교실, 임상연구센터

Vol. 20, No. 3, September, 2012

어린 생쥐에서 Pilocarpine-유발 발작 후 해마의 신경발생 및 표현형 분화

인제대학교 의과대학 일산백병원 소아과학교실, 임상연구센터

박지원ㆍ유나영ㆍ김동욱

= Abstract =

Hippocampal Neurogenesis and Phenotypic Differentiation after Pilocarpine-Induced Seizures in Young Mice

Jiwon Park, M.D., Na-Yung Ryu, M.D. and Dong Wook Kim, M.D., Ph.D.

Department of Pediatrics, Clinical Research Center, Ilsan Paik Hospital, Inje University College of Medicine, Goyang, Korea

Purpose : Proliferation, differentiation, and survival of hippocampal dentate granule cells have been reported to be influenced by epileptic seizures in rodent epilepsy models. However, most studies have been done in adult rat models. This study was designed to investigate hippocampal dentate granule cell neurogenesis after pilocarpine-induced seizures in young mice.

Methods : Fifteen male ICR mice at postnatal day 21 were divided into pilocarpine-treated (n=7) and control (n=8) groups. Seizures were chemically induced by intraperitoneal injec- tion of pilocarpine (300 mg/kg). Bromodeoxyuridine (BrdU, 50 mg/kg) was subsequently administered once a day for 6 consecutive days, starting at 24 hours after pilocarpine or saline treatment. We then examined BrdU-positive cells in the hippocampal dentate gyrus by immunohistochemistry and by double-labeled immunofluorescence with confocal microscopy.

Results : After pilocarpine administration, every seizure behavior was grade 3 or more.

Quantitative analysis revealed that BrdU-positive cells were significantly increased in the pilocarpine-treated group compared to control (230.5±59.5 vs. 148.6±40.0,

P

Conclusion : Our results indicated that mitotic activity in the hippocampal dentate gyrus was enhanced after pilocarpine-induced seizures in young mice, and the majority of BrdU- positive cells showed the phenotypic differentiation to neuronal cells.

Key Words : Pilocarpine, Neurogenesis, Dentate gyrus, BrdU, Seizure

1)

서 론

한때 중추신경계에서는 대뇌에서의 새로운 신경 세포(neuron)의 발생이 태아기 동안에만 일어나고

접수 : 2012년 8월 28일, 수정 : 2012년 10월 23일 승인 : 2012년 11월 1일

책임저자 : 김동욱, 인제대학교 일산백병원 소아청소년과 Tel : 031)910-7106 Fax : 031)910-7108 E-mail : [email protected]

성체의 대뇌에서 신경세포는 재생되지 않는 것으로 생각하였으나 최근에는 태아기 뿐만 아니라 성체의 신경계에도 신경줄기세포가 존재하여 새로운 신경발 생(neurogenesis)이 가능함이 알려졌다. 신경줄기 세포는 측뇌실의 뇌실하 영역(subventricular zone;

SVZ)과 해마의 과립세포하 구역(subgranular

zone; SGZ)에서 존재하며, 이곳에서 계속 증식하면

서 후각망울(olfactory bulb) 및 치아이랑(dentate

gyrus)의 과립세포 구역(granular zone)으로 이주 하여 새로운 신경세포를 생성한다

.

간질발작(epileptic seizure)은 일생 어느 시기보 다 아동기에 좀더 자주 많이 발생한다

. 게다가 간 질의 발생은 성년기에 발생하였을 때 보다 유년기에 발생하였을 때 그 위험성이 더 크다

. 동물을 이용 한 연구는 발생중인 어린 뇌의 발작에 의한 병태생 리학적인 결과들이 성숙한 뇌와는 다르다는 것을 입 증하였다. 성체 동물은 간질중첩증을 경험한 후 해 마에서 신경세포의 손실

, 변위 이끼섬유 시냅스 재 구성(aberrant mossy fiber synaptic reorgani- zation)

, 인지능력결함과 행동장애

등이 나타난 다. 그러나 어린 쥐에서는 발작 후 뚜렷한 세포손실

9)

, 이끼섬유 발아(mossy fiber sprouting)

, 학습 능력의 손상 및 행동장애

등이 나타나지 않는다고 보고되었다. 뚜렷한 세포 손상이 없음에도, 어린 동 물들이 발작에 의한 상해가 없는 것은 아니다. 발작 은 세포 사멸과는 다른 기전에 의해 뇌를 변화시킨 다는 보고가 있으며

, 동물실험에서 영아기 발작 과 유아기 발작 유발은 뇌 세포 수를 줄여주는 것으 로 보고되었다

. 태아기 발작 후 신경발생이 감소 되었다는 보고도 있다

.

최근에는 성체에서 간질발작이 신경세포의 소실 뿐 아니라 신경발생의 증가를 유발한다는 연구들이 보고되면서 관심이 높아지고 있다

. 발작 후 성체 설치류의 치아이랑

과 뇌실하 영역

에서의 신경발생의 증가는 이미 많은 보고에서 입증 되었지만 증가된 신경발생이 어떤 역할을 하는지는 아직 분명하지 않다. 하지만 새로 생성된 과립세포 가 기능적이고 해마의 회로(hippocampal circui- try)에 통합된다는 증거는 있다

. 그러므로 신경발 생의 변화와 간질 발생 기전의 연관성을 파악하기 위해서는 신경발생의 증가 유무뿐 아니라 새로운 세 포가 어떤 방향으로 분화되는지 연구하는 것이 중요 할 것이다. 또한 영유아기나 성년기에 해당하는 동 물의 발작 유발 후 신경발생에 대한 보고는 있어왔 으나 아동기에 해당하는 간질 모델에서의 동물실험 연구는 미미하다.

따라서 본 연구는 3주령의 어린 ICR 생쥐에서

pilocarpine-유발 발작 후 해마에서의 신경발생이 증가하는지 및 이 때 새로 생성된 세포가 신경세포 로 분화하는지를 조사하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 실험 동물

21일된 어린 수컷 ICR 생쥐(Koatech, Korea) 15마리를 공급 받아 실험에 사용하였는데, 실험 기 간 동안 22.0±3.0℃로 유지하고 12시간 주기로 조 명을 켜고 끄는 조건에서 사육하였다. 사료와 수분 은 제한을 두지 않고 자유롭게 섭취하도록 하였다.

2. 발작 유발

실험동물을 pilocarpine 처리군(n=7)과 대조군 (n=8)으로 나누어, pilocarpine 처리군에는 peri- pheral cholinergic effect를 줄이기 위해 scopola- mine methylbromide를 체중 kg당 1 mg의 용량으 로 복강 내로 주사하고 30분 뒤 pilocarpine(Sigma, USA)을 체중 kg 당 300 mg의 용량으로 복강 내로 주사하여 발작을 유발하였으며 대조군에는 동일 용 량의 생리식염수를 주사하였다. 발작 행동 등급 (seizure behavior grade)의 산정은 해당 실험동물 에게 pilocarpine을 투여한 후 2시간 동안 발작 행 동을 관찰하였고 Racine 등

의 방법을 준용하여5 단계로 분류하였다. 발작 행동 등급의 산정은 해당 실험동물에게 pilocarpine을 투여한 후 2시간 동안 출현한 발작 행동 중 가장 심한 것으로 하였다. 발작 을 중단하는 처치는 하지 않았다.

3. Bromodeoxyuridine (BrdU) 표지

새로이 생성되는 세포를 표지하기 위해 BrdU (Sigma, USA)를 발작 유발 다음날부터 24시간 간 격으로 하루 1회씩 6일 동안 체중 kg당 50 mg의 용량으로 복강 내에 주사하였다.

4. 조직 고정과 BrdU 면역조직염색

Pilocarpine 주사 후 7일이 경과한 시점에, 1%

케타민(30 mg/kg, Ketara; Yuhan Yanghang, Seoul, Korea)과 염산 자일라진(4 mg/kg, Rom- pun; Bayer Korea, Seoul, Korea)으로 마취하여 개흉술을 한 뒤 차가운 생리식염수로 관류하고 이어 서 4% paraformaldehyde로 관류-고정하였다. 뇌 를 분리해서 4% paraformaldehyde가 담긴 통에 24시간, 다시 30% sucrose가 담긴 통으로 옮겨서 24시간이 경과한 후에 isopentane에 급속 냉동한 후 보관하였다. 전체 해마 부위를 30 μm 간격으로 관상면을 따라 연속적으로 절편하여 phosphate- buffered saline (PBS, PH 7.4)에 보관하였다.

DNA 변성 과정으로 2 M HCl (37℃, 30분)에 반응 시킨 후 뇌조직은 PBS에 각 10분씩 3회 수세하고 endogenous peroxidase를 차단하기 위해 3%

H

O

에 15분 처리했다. PBS에 각 10분씩 3회 수 세하고 배경 염색을 줄이기 위해 blocking solution (10% normal goat serum and 0.5% BSA/0.3%

Triton X-100 in PBS)에 3시간 동안 반응시켰다.

1차 항체 BrdU (mouse IgG, 1:300; Pharmingen, USA)는 하룻밤 동안 4℃에 반응시켰으며 PBS에 각 10분씩 3회 수세하고 2차 항체(ChemMate Envision kit, HRP rabbit/mouse, DAKO Corpo- ration, USA)로 상온에서 30분 반응시켰다. PBS로 각 10분씩 3회 수세하고, 3,3′-diaminobenzidine- tetrahydrochloride (DAB, DAKO Corporation, USA) 용액으로 발색을 확인한 후 젤라틴으로 처리 한 슬라이드에 뇌조직을 올렸다.

5. 이중면역형광염색

새로이 생성된 BrdU 표지세포가 신경세포로 분 화하는지 별아교세포(astrocyte)로 분화하는지 확 인하기 위하여 마지막 BrdU가 주입된 이후 28일째 동물을 희생하여 이중면역형광염색을 하였다. 전체 해마 부위를 30 μm 간격으로 관상면을 따라 연속적 으로 절편하여 PBS (PH 7.4)에 보관하였다. DNA 변성 과정은 앞에서 언급한 방법으로 하였다. 뇌조 직은 그 뒤 PBS에 3회 수세하고 배경 염색을 줄이 기 위해 blocking solution (10 % normal rabbit serum/0.3% Triton X-100 in PBS)에 3시간 동

안 반응시켰다. 1차 항체 BrdU (sheep IgG, 1:

300; Biodesign, USA)는 하룻밤 동안4℃에서 반응 시켰다. 그 다음날 PBS에 각 10분씩 3회 수세하고, 뇌조직은 이차항체 FITC-conjugated anti-sheep IgG (1:100; Biodesign, USA)로 2시간 반응시켰 다. PBS에 10분씩 3회 수세 후에 뇌조직은 block- ing solution (10 % normal goat serum/0.5 % BSA in PBS)에 3시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 anti -neuronal nuclear antigen (NeuN, mouse IgG, 1:200; Chemicon, USA) 또는 anti-glial fibrilla- ry antigen (GFAP, mouse IgG, 1:1000; Sigma, USA) 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음날, 뇌조직을 PBS에 각 10분씩 3회 수세하고, 이차항체 Cy3-conjugated anti-mouse IgG (1:

300; Biodesign, USA)로 2시간 반응시켰다. PBS 로 각 10분씩 3회 수세하고, 젤라틴으로 처리한 슬 라이드에 뇌조직을 올렸다.

6. BrdU-양성세포의 수

해마의 치아이랑과 문(hilus) 부위에서의 BrdU- 양성 세포를 계수하기 위해 전체 해마 부위를 관상 면을 따라 30 μm 간격으로 매 7단면마다 1단면(한 동물마다 총 6단면)을 선택하여 염색하였다. 실험 그룹에 대해 알지 못하는 상태의 실험자에 의해 해 마 부위의 염색된 핵을 현미경 ×400 렌즈를 이용하 여 계수하였다. 결과들은 단면당 BrdU-양성 세포 들의 평균수(평균값±표준편차)로 표시하였다.

7. 공초점 현미경(confocal microscopy)을

사용한 BrdU-양성 세포의 표현형 분석

해마의 치아이랑과 문 부위에서의 BrdU-양성 세

포를 계수하여 BrdU와 NeuN (신경세포의 표현형)

에 양성인 세포수의 수를 공초점 현미경(laser

scanning confocal microscopy, Carl Zeiss)을 사

용하여 계수하였다. 각 동물에서 얻어진 단면의

BrdU-양성 세포의 수에 대한 BrdU-양성세포와

NeuN이 같이 발현되는 세포의 수를 백분율[BrdU

(+) + NeuN(+)/total BrdU(+) (%)]로 표시하였

다.

Table 1. Seizure Behavior Grades after Pilocarpine (300 mg/kg) Administration in Mice

Seizure behavior Grade Animal No. (n) Induction rate (%)

Mouth and facial movements Head nodding

Forelimb clonus Rearing

Rearing and falling

1 2 3 4 5

0 0 3 1 3

0%

0%

43%

14%

43%

Fig. 1. Baseline mitotic activity in the hippocampal dentate gyrus identified by BrdU labeling and immunohistochemistry. In the pilocarpine treated mice (B), BrdU-positive cells increased significantly after pilocarpine administration compared to the saline- treated control (A). Scale bars: 200 μm.

Fig. 2. The number of BrdU-positive cells after pilocarpine or saline treatment. BrdU-positive cells increased significantly after pilocarpine administration compared to the control. Bars represent mean±SD. Asterisks(*) indicate stati- stically significant differences from the control (

P

t

8. 통계 처리 방법

이 실험에서의 모든 결과치는 평균값±표준편차로 표시하였다. 개체 당 BrdU-양성 세포의 수 및 분율 의 비교 분석에는Student’s t -test를 사용하였고 P <0.05일 경우 퉁계적으로 유의한 것으로 판정하였 다.

결 과

1. Pilocarpine-유발 발작 행동 등급

Pilocarpine을 체중 kg당 300 mg의 용량으로 복 강 내에 주사하여 발작을 유발한 후 pilocarpine-유 발 발작 행동 등급을 측정하였는데, pilocarpine 처 리군 모두 grade 3 이상의 발작을 나타냈다(Table 1).

2. Pilocarpine-유발 발작 후 해마에서의 신경발생 증가

새로 증식한 세포를 확인하기 위하여 BrdU를 사

Fig. 3. The phenotype of proliferating cells in the hippocampal dentate gyrus after pilocarpine treatment. BrdU was adminis- tered once daily 6 days after pilocarpine administration. Mice were sacrificed 28 days after the last day of BrdU treatment, and brain sections are stained for BrdU (A and B, green) and cell-specific markers (NeuN for C and GFAP for D, red).

Colocaliztion of BrdU with NeuN is shown by yellow nuclei (E). BrdU rarely colocalizes with the astrocytic marker GFAP (F). High-power photograph of (E) is shown in (G). High- power photograph of (F) is shown in (H). Scale bars: (A-F) 200 μm; (G) 20 μm; (H) 25 μm.

용하여 시행한 해마에서의 면역조직화학염색 소견을 보면, 대조군에서 BrdU로 표지된 세포는 불규칙한 형태로 해마의 문 부위와 과립세포하 구역에 따라 퍼져 있었다(Fig. 1A). Pilocarpine 처리군에서 BrdU 표지 세포는 대다수가 문과 과립세포층 사이 의 경계면을 따라 형성되었으며 그 수가 증가하였다 (Fig.1B). 해마 치아이랑에서 BrdU로 표지된 세포 의 수는 대조군(n=4)과 비교하여 pilocarpine 처리 군(n=4)에서 현저히 증가하였는데, pilocarpine 처

리군 동물에서 BrdU로 표지된 세포들의 평균 수가 단면 당 230.5±59.5으로 대조군의 148.6±40.0과 비교하여 유의하게 많았다( P <0.001, Fig. 2).

3. 발작유발 후 치아이랑에서 신경발생의 표현형

새롭게 증식한 세포들의 표현형을 확인하기 위하

여 신경세포의 표지자인 NeuN과 교세포의 표지자

인 GFAP를 사용하여 이중면역형광염색을 시행한

Fig. 4. Alterations in the percentages of BrdU- positive cells that were neurons (NeuN) or

‘other’ classification of cells in the control and pilocarpine-treated mice with 28 days incu- bation. There are no significant differences between respective groups in the cellular pheno- type (percentages) of BrdU-positive cells (

P

t

소견을 살펴보면, 세포핵에 발현되는 BrdU와 NeuN 은 동일한 세포에서 중첩되어 발현하지만(Fig. 3E, G), 세포질에 발현되는 GFAP와는 중첩되어 발현되 지 않았다(Fig. 3F, H). Pilocarpine-유발발작 후 해마의 치아이랑에서 BrdU로 표지된 세포가 NeuN 과 동일한 세포에서 중첩되어 발현되는 비율을 백분 율로 표현하였다. BrdU-양성 세포이지만 NeuN과 중첩되어 발현하지 않는 세포들은 기타(‘other’)로 분류하였다. Pilocarpine 처리(n=3) 후 BrdU-양 성 세포는 대부분 신경세포로 분화하였고 대조군 (n=4)과 비교하여 표현형 분율의 차이는 없었다 ( P =0.20, Fig. 4).

고 찰

발작이 성체 설치류 해마에서 신경발생의 증가를 초래하고 kainic acid(KA)

, pentylenetetrazole (PTZ)

, flurothyl

등의 발작 유발 약물을 사용 한 간질중첩증과 kindling

동물 모델에서 해마 부 위의 신경발생이 증가함이 보고되었다. 본 연구에서 는 3주령의 어린 생쥐를 사용하여 pilocarpine-유 발 발작 후 1주일째 신경발생 증가를 확인하였다.

또한 설치류의 치아이랑에서 신경 전구 세포들이 무 리를 지어 치아이랑 과립세포층과 문 사이 안쪽을 따라 퍼져 있고, 과립세포하 구역에서 발작 후 생성 된 많은 수의 세포는 퍼져서 성숙한 신경세포가 위 치하는 곳인 치아이랑의 과립세포층으로 이동함을 확인하였다

. 발작 유발 후 증가된 세포들의 대 부분은 신경세포로 분화하였으며 대조군과 비교하였 을 때 신경세포로 분화한 비율은 차이가 없었다.

본 연구 결과를 통하여, pilocarpine으로 처리한 ICR 생쥐의 해마 치아이랑에서의 BrdU-양성 세포 의 수는 생리식염수를 주사한 대조군보다 증가함을 확인할 수 있었다. 성체 쥐를 사용한 다른 pilocar- pine-유발 발작 모델에서는 대조군과 비교하여 6-8배 신경발생이 증가했다는 연구 보고도 있었다

19)

. 또한 C57BL/6J 생쥐를 이용한 flurothyl-유발 발작 kindling 모델에서는 신경발생이 3배 증가함이 보고되었다

. KA-유발 발작 동물 모델의 경우도 Wistar 쥐를 이용하여 뇌실에 KA를 투여했을 때 신 경발생이 6배 증가한다고 보고되었다

. 이처럼 신 경발생의 정도는 발작 유발 약물의 종류, 발작 유발 후 동물 희생 시간, 실험동물의 나이 및 종류, 투여 방법 등의 다양한 요인에 따라 차이가 나는 것으로 생각된다. 발작 유발 후 신경발생은 대조군에 비해 증가하지만, 실험 설계에 따라 증가하는 신경발생의 양은 일정하지 않고 2배에서 10배까지 차이가 난다

5, 14, 15, 18, 19, 23)

.

발작 유발 후 생기는 신경발생의 의미는 무엇인 가? 세포분열을 차단하는 cytosine arabinofurano- side (Ara-C)를 간질발작 후에 연속 주입하여 해 마 부위의 신경발생을 차단하면 간질발작 횟수가 현 저히 줄어든다는 보고가 있다

. 이는 간질발작 후 신경발생이 향후 간질발작에 나쁜 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 하지만 해마에서의 증가된 신경발 생이 인지기능 향상에 유익한 역할을 할 것이라는 연구 결과도 알려져 있다. 그러므로 간질발작 후의 신경발생은 유해할 수도 유익할 수도 있는 양면의 결과를 초래할 수 있을 것이라고 추측할 수 있겠다.

NeuN은 성숙한 신경세포에 존재하고 세포핵에서

강하게 발현되며 세포질에서는 약하게 발현된다. 본

연구에서는 발작 유발 후 대부분의 BrdU-양성 세 포가 NeuN- 양성이었으며, 이 결과는 새로 생성된 세포가 신경세포로 대부분 분화함을 의미한다. 따라 서 발작은 해마에서의 신경발생을 유발할 뿐만 아니 라 새로 생성된 세포가 신경세포로 분화하도록 유도 하는 것으로 생각된다

. 아마도 발작 후 손상된 세포의 회복 기전과 신경세포가 다시 생성되 는 현상이 연관되어 있을 가능성이 있다고 추측된다.

한편, 신경영양인자인 Brain-derived neurotro- phic factor (BDNF)가 신경발생을 조절하는지에 대한 여러 시도가 보고되어 왔는데

. 이러한 신 경영양인자에 의해 조절된 신경발생은 발작 후의 회 복에 도움을 줄 가능성도 있는 것이다. 현재로서는 발작

, 운동

또는 뇌졸중

등의 생리학적ㆍ병리학적 자극에 의해 증가하는 신경발생 의 기능 및 역할에 대해 정확히 알려진 바가 없으므 로, 이러한 증가된 신경발생이 어떻게 분화해 나가 는지와 이러한 신경발생에 영향을 미치는 뇌의 신경 영양인자 등에 대한 좀더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.

결론적으로, 본 연구는 3주령의 어린 ICR 생쥐에 서 pilocarpine-유발 발작 후 1주일째 해마의 신경 발생이 현저하게 증가함을 관찰하였다. 또한 발작 유발 후 생성된 세포의 대부분이 신경세포로 분화함 을 확인하였다. 새로이 생성된 세포들이 주로 신경 세포로 분화한다는 본 연구 결과를 통해 추측하건대, 새로 생성된 세포가 발작에 의해 손상된 세포의 기 능적 회복에 관여할 가능성이 있으며 향후 간질발작 이 신경발생에 미치는 영향을 조사하는데 기초적인 자료로 활용될 수 있을 것이다.

요 약

목 적 : 본 연구는 3주령의 어린 ICR 생쥐에서 pilocarpine-유발 발작 후 해마에서의 신경발생이 증가하는지 및 이 때 새로 생성된 세포가 신경세포 로 분화하는지를 조사하고자 하였다.

방 법 : 3주령의 어린 ICR 생쥐에서 pilocarpine을 투여하여 발작을 유발한 후 BrdU를 사용하여 새로

이 생성되는 세포를 표지하고 동물을 희생하여 얻은 뇌조직으로 면역조직염색을 시행하였다. 새로이 생 성된 BrdU 표지세포가 신경세포로 분화하는지 혹은 별아교세포로 분화하는지 확인하기 위하여 마지막 BrdU가 주입된 이후 28일째 동물을 희생하여 얻은 뇌조직으로 이중면역형광염색을 하였다.

결 과 : 해마 치아이랑에서 BrdU로 표지된 세포의 수는 pilocarpine 처리군 동물에서 단면당 230.5±

59.5으로 대조군의 148.6±40.0보다 유의하게 많았 다( P <0.001). Pilocarpine 처리 후 BrdU-양성 세 포는 대부분 신경세포로 분화하였고 대조군과 비교 할 때 표현형 분율의 차이는 없었다( P =0.20).

결 론 : 본 연구 결과를 통하여, 해마 치아이랑에서 BrdU-양성 세포의 수는 대조군과 비교하여 pilo- carpine 처리군에서 현저하게 증가하였으며 새로이 생성된 세포의 대부분이 신경세포로 분화함을 확인 할 수 있었다.

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