Mutagenicity Tests of Human Interferon-${alpha}$ produced by Recombinant Escherichia coli

(1)

!\or. J. App/. Micrvbio/. Hivcng Vv/. 15

,

I\

‘

0.1

,

39-42 19871

유전자 조작된 Escherichia coli 에서 생산된 사람 인터페론-(1 주사제의 변이원성에 관한 연구

조남진정인환·정재경·복혜숙·김제학·김현수·유무영 저 1 일제당 (주) 증힐연구소

Mutagenicity Tests pf Human Interferon-a produced by Recombinan t Escherichia coli

Cho ‘ Nam Jin *, In Whoan Jung , Jae Kyung Jung , Hae Suk Bok , Je Hak Kim , Hyun Su Kim and Moo Yung Yoo

Clzνi!

S

lI

!{or R & D

CνJl hγ，

Dokþyong

^,

IcJwn 172-75 , Korea

Human interferon-a (Hu rIFN-a )produced by recombinant Escherichia coli was studied for mutagenicity using the Ames method and in vivo cytogenotics. Hu rI FN- a had no mutagenic effect on S. typhimurium(TA 1535 , TA 1537 , TA 1538 , TA 98 and TA 100) at concentrations of 30 , 3000 or 300000 IUjplate. In the cytogenetic study , Hu rIFN-a had no cI astogenic effect on rat ’ s bone marrow cells at concentrations of 1 X 10

⁶_‘

3 X 1 0

⁶

or 3 X 10

⁷

IU. These resu It s suggest that Hu rI FN -a has no mutagenic potentia l.

인터퍼1 론이 바이라스에 디|한 저항성을 유발시 킨다는 사설(l)이 발견턴 이후 디1 양 생산볍에 관한 많은 연구가 진행되어 왔으며 (2， 3， 4， 5) 현재는 유전 자 조작법에 의해 대장권 등의 셔l 균에서도 인간의 인터페론을 생산한 수 있게 도 l 였다. 그더나 이와같 이 재조합

DNA

공볍을 이용하여 생산된 인터퍼1 론 (이하

Hu rI F N- a

호 칭한)등의 물질을 인체에 샤 용 가능한 제제로 개발하기 위해서는 안전성 시험을 실시하여야 한다.

본 연구에서는 대장닫에서 생산된

Hu rI FN-a

의 돌연변이원성 맺 생체내 염색처l 이상 시험을 실시하 여， 변이원성 여부를 조사하였다.

재료 및 망법

시료 및 사용용량

유전자 조작된 대장균에서 생산， 정제된

Hu rI FN - a

주사제를

vial

당

3X 10

⁶

international units(IU)

(국제표준 시료

code #

G←023-901-527에 비교한 정량 단위)를 동결깐조시킨 후 -20⁰C 에 보관하였으며， 사

Key words

‘

Human Interferon-a , l\1 utagenicity

* Corresponding author

39

용시 주/、L용 증류수에 용해시켜 평요한 농도로 희석，

샤용하였다. 또한 본 사험에 사용한

Hu rI FN

•0 의 용로본

ß -IFN 3X 10

⁶

I. U

를 사람에 게 정맥주사한 직 후의 혈중농도가

320IU j m !

인 정 (6) 을 고려하여

Ames

시험의 갱우

plate

당

30- 3x 10

⁵I. U의 농도을 사용하였으여， 영세내 염씩셰 이상시험의 경우 Sprague-Da、、 ley 웅성 렛트에 복강 투여한 결과 LDso 치가

3X 10'

I. U인 것으로 관명되어

3X

10'과 인 체 사용 예정 농도인

3X 10

⁶ 및

1X 10'

I. U의

3

가지 농도를 사용하였다.

대조시료

음성 대조 사료늠

Hu rIFN - a

주사제에서 인터페론 성분을 제외한 것을 사용하였다 Ames 시험의 경우 양 성 대 조 시 료로 서

2-aminoanth racene(Wako) , 2 - ni trofl

uorene(Aldrich)은

dimeth ylsulfox ide

에，

N - methy l- N I- nitro- N -nitro sogu an idin e( N TG ,

Sigma}은 증류수에 용해시켜 사용하였다

(

6

) .

체내 염

색체 이 상시험에서는 양성 대조 사료로 간에서 대사릉 받지 않고 영썩처1

01

^oL을 유발시키는 것으로 알려진(7)

ethylmethane sulfonate (E MS)

빚

EMS

와 동일한，

(2)

40

염색체 이 ÃJ-을 유발시키는 NTG 를 열 jE 증류수에 용

해시 켜 사용하였으며 , 사용 용량은 Sprague- Dawley

웅성 랫트에 복강 투여하여 독성을 나타내는 농도로 하

였다.

사용균주

제일제당(주)에서 보관중인 Salmo ηella t)φhimur.

IIμn 의

histidine

영양 요구주를 유전형질 확인 시험 (8) 을 통하여 선별한 후 사용하였a며

,

종류 및 유전적

특성은 Table 1에 나타내었다.

S-9 Mix

조제 (8)

포유동물의 체내대사 상태에 밀접하게 연관시키기 위 해

rat

의 간

homogenate

을 균주에 가하게 되는데 그 제조 방법은 다음과 같다.

Aroclor 1254(Analab)

200mg 을 1ml 의

corn

oil 에 녹인 다응 그

0.5ml

을 체중

205g Sprague-Dawley

웅성 랫트의 복%에 주사하여 발암 물질에 대한 간의 효소를 활성화 시켰

다. 5 일후 척추분리로

도살시킨

후 간을 적출하여 O.

15M KCl

용액으로 혈액 성분을 충분히 씻어내고， 간

무 게 g 당 3 배 의 0.15M KCl 용 액 을 가 하 여 homogenizer

로

homogenize

시 켰 다 Sorval

centrifuge SS- 34

rotor 로

8700 rpm(9 ,

OOoxg)에서 1 0-분간 원심분리 시켜서 상등액 (S-9) 을 얻은 후

S-9

Table 1. Salmonella strains (8).

S trains Genotype

TA 1535 his G 46 rfa uvrB TA 1537 his C 3076 rfa uvrB TA 1538 his 0 3052 rfa uvrB

TA 98 his 0 3052 rfa uvrB pkM 101 TA 100 his G 46 rfa uvrB

Table 2. Preparation of 8-9 Mix(8).

Component

S -9

Mg Cl ,

KCl

Glucose-6- phosphate (S igma) NADP (Sigma)

s 。이um

phosphate buffer (pH 7.4)

contains per ml 0.04 ml

8mM 33 mM 5mM 4 mM 100 mM

Kor. J. Appl. Microbio l. Bioeng.

Mix를 조제하였으며， 그 조성은

Table 2

와 같다.

돌연변이 복귀 시힘 (8)

Nutrient broth(Oxoid

No.2) 에서 12시간 암소배양 한 균현탁액

0.1ml ,

각 시료 용액

O. 1ml , S-9 Mix

0.5ml 을 45"C 로 유지된 2ml 의

top

agar 를 넣은 시 험관에 넣고 흔합한 후

minimal glucose plate

에 부 어 고루 퍼지게 하여 굳혔다. 굳은 plate 은 3TC 에서 48시간 배양한 후 군집수을 세었다. 이때

S-9

Mix 를

넣지않고 증류수를 사용한 대조 실험도 병행하였다.

생체내 염색체 이상시험

1)

시료의 투여

Sprague- Dawley

웅성 빛 자성

랫트 각 3 마리씩을 1 개군으로 하여 음성 대조군 양성

대조군 및 시험물질 처리군의

3

개군으로 나누어， 처리 농도 별로

1

회 또는 수회 복강 투여하였다.

2)

염색체 표본 제작

:

척추 분리로 도살하기

2

시간 전에

colcemid(Sigma) 0.8 mg

을 복강 투여하였다

(7).

대퇴부를 절단하여 골수에

26-gauge

주사 바능

을 삽입한 후 생리식염액을 주입하여 원심관에 골수 세 포를 수거하였다. 800rpm 으후

5

분간 원심분려하여 상등액은

벼라고 침전된 세포에 O. 075M KCl 용액 3

ml을 첨가하여 부유시키고 3TC 로 미리 조절된 항온 수조에서 15분간 정치시켰냐. 다시 원심분리한 후 새롭 게 안은 고정액 (glacial

acetic acid:methanol , 1 : 3)

을 첨가하였다. 얼음 상에서 15분간 정치시킨 후 원심 분리를 하였다. 고정은 고정액을

3

번 정도 갈아주었으 며， 마지약 고정에서는 침전된 세포의 %벼! 따라 고정

액의 %L을 변화시켰다. 세포흔 고정시킨 후 20-30cm

의 높이에서 깨끗한 슬라이드에 부유시킨 세포들을 떨 어뜨린 후 공기 건조법에 의해 자연건조 시켰다.

3)

염색체의 염색

:

슬라이드플 2-3일간 상온에 방

치 시 킨 후 0.15 M N aCl(pH 7. 0) 에 용해시 킨 0.025%

트링신 용액에

넣였다 (9)

. 트럽신 처리 시간은 4 분을

전후하여 슬라이드의 상태에 따라 다르게 하였다.

2%

Gurr Giemsa(pH 6.

8) 로 20-분간 염색하였고 증류수로 씻어내었다. 현미갱 하에서， 낮은 배율에서 중기 염색 체가 잘 퍼져있고 높은 배율에서 염색체들이 서로 잘 구분되는 세포안을 선멸하여 사진 촬영후 현상， 인화하 였다.

염 색체 이상은 인화된 사진 -^J(에서

Evans

등 (10) 의

정의에 따라 본 실험 조건 하에서 판별 가능한 gap ,

breakage, ring formation, dicentric and fragment

맞 숫적 이상의 유무을 조사하였다.

(3)

VoL .15 , No . l , 4 1

Table 3. Rever se Mutation Assay of rHU IFN-a A.

T est compounds Conc. S-9 Number of revertants per p!ate'

T A 1535/ T A 1537/ T A 1538/ T A 98/ T A 100

- contro ! 24 8 18 28 187

rHu

IFN-α

30I. U/p!ate 24 8 10 27 194

3000I. U/p!ate 21 9 12 20 2 14

3X lO ' I. U/p!ate 26 10 13 36 187

2- Aminoanth racene

5μg/p!ate

24 14 17 34 19 1

2- Nitro fluorene

_2μg/p!ate^1μg/p!ate

₂₄ * ₄₈ * ₂₅₇ * ⁶⁸⁴ *

* ²⁹⁷

NTG

^2μg/p!ate_5μg/p!ate

12 17 * * ^ND ⁷³ ¹

* ⁵² ^ND * *

- contro! + ¹⁹ ⁸ ²⁰ ³³ ¹⁸²

rHu IFN-a 30 I. U/p!ate + ²² ⁶ ²¹ ³⁷ 185

3000 1. U/p!ate + ¹⁹ ⁷ ²³ ²⁶ 188

3 x 10' 1. U/plate + ²⁴ ¹¹ ²⁴ ²⁸ 194

2- Am inoanthracene

5μg/p!ate

+ ¹⁷³ ²¹⁷ ¹⁷³² ⁶⁷⁶ 698

a; Mean of 3 p!ates

* ; not tested ND: N ot determined

Ta ble 4. Effec ts of Hu rI FN- m o n the chromoso mes of r at ’ s bone ma rrow celIs.

concen- No.of No.of No.of chromosome aberration No. of l' compounds

cell sex chromo

tratlon

¹ⁿ

jectlon Gaos Ereaks Ring Dicentric and

examined aps creaKS formation fragment some

contro! 50 F 3 0 0 0 4 1. 5

50 M 0 1 0 0 42

Hu rIFN - a 1 X lQ' I. U 50 F 2 0 0 0 41. 7

50 5 F 1 0 0 41. 3

3X lO'I. U 50 l F 0 2 0 0 42. 4

50 2 F 2 0 0 42. 2

3 x 10' I. U 50 1 F 0 0 0 0 43

50 2 F 0 1 0 0 42.4

50 5 F 2 0 0 0 41. 8

50 2 M 0 0 42

50 5 M 0 0 0 43

NTG 2 mg 50 F 12 4 0 42.8

EMS 0. 1 ml 50 F 10 5 1 40. 8

1) average number of chromosomes in 50 cells tested.

(4)

42

결과 및 고찰

돌연변이 복귀 시험

Ames

의 방엽

(8)

에 따라

S.

typhimμη;um

his-

tidine

영양 요구주의 복귀 시험을 실시한 결과

Table

3에 서 볼 수 있듯이

S-9 Mix

의 첨 가 유무에 관계없이 음성 대조군과

IFN

처리군 간의 통계학적 인 차이가 없응을 알 수 있었다.

2- aminoanthracene

처 리 군에 서 는

S-9 Mix

비 첨 가시 돌연변이성이 관찰되지 않았지만，

S-9 Mix

처

리 후에는 돌연변이 유말성을 나타내었다. 그러냐 다른 양성 대조 시료의 경우에는 S-9 Mix 를 처리

하지 않았을 때에도 몇몇 균주에서 돌연변이 유발성 을 나타내 였 다 Spontaneous

mutation frequency

를 시험하기 위한

S-9 Mix

비처리 음성 대조군의

revertant colony

수는 운헌상의

s.

tyφhimμrium

5

개 균주의

spontaneous revertant

수 범 위

(6, 8)

내 에 있는 것으로 판명되었다. 따라서

Hu rI FN-a

는

s.

l)φhimurium

T A 1535, T A 1537, T A 1538, T A 98

빛 TA100의

5

개 균주에 대해 돌연변이 유발성 을 나타내지 않는 것으로 사료되었다.

생체내 염색체 이상 시험

랫트의 골수 (bone

marrow)

세포을 이용하여 iη

vzvo

에서 엽색처1 이상을 유말시키는 지의 여부를 시 험 한 결과

Table

4에서 보듯이

Hu rI FN-a

주사제 처리군은 읍성 대조군에 비교하여 이상 염색체의 갯 수에 통계학적 유의치를 보이지 않았으며， 처리 농 도에 비려l 하여 증가하지도 않았다. 유발된 염색처}

이상은 gaps 과

breaks

등 실험조건 (10) 에 따라 발

생될 수 있는 종류의 이상이고 양성 대조군에서와

같이

ring formation , dicentric and fragment

의 이 상은 관찰되지 않았다.

이상의 결과로 본 실험 조건하에서

Hu rI FN - a

주사제는 염색체 이상을 유발시키지 않음을 알 수

。 10<r l

λλ λ人「

요 ^{。 t}-,

S.

l)φhiη2μ rium 과 랫트의 골수 세포를 이용하여

Kor. J. App/. Microbio/. Bioeng

유전자 조작된

E. coli

에서 생 산된

Hu rI FN- a

를

이용하여 제조된

주사제의 변。1 원성을

조사하였다.

s.

l)φhimμrium

T A 1535, T A 1537, T A 1538, TA98

빛 TA100의

5

개 균주는

30-3X10

⁵

I.U/

plate 의 인터페론 농도에서 돌연변이성을 나타내지 않았으며 ，

zn vzvo

실험으로 랫트의 골수 세포를 이 용한 염색처l 이상 시험에서는 처리된

Hu rI FN- a

의 농도차에 대한 이상 염색체 유말성이 나타나지

않았고， 성에 관계없이 웅성과 자성 랫트에서 유의 성 있는 양성 반응도 나타나지 않았다.

이상의 실험 결과로

HurIFN-a

주사제는 변이원 성을 갖지않는 것으로 판병되었다.

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κ1aureen