동종 반월상 연골내 주입된 배양 연골 세포의 in vitro 생존에 관한 연구

동종 반월상 연골내 주입된 배양 연골 세포의 in vitro 생존에 관한 연구

-예비보고-

서울성심병원 정형외과, (주)BHK 세포치료연구소�

김지형∙이@송∙임형범�∙전영원

목 적: 동종 반월상 연골내 주입된 배양 연골 세포의 생존 가능성을 확인하고자 하였다.

대상 및 방법: 1명의 관절 연골로부터 관절 연골 조직을 채취하여 체외에서 연골세포를 배양 증식한 뒤, 3명의 각 기 다른 사람으로부터 채취된 반월상 연골을 3개월 이상 섭씨 -70도에 보관하여, 신선 냉동(fresh frozen) 상태 로 준비한 뒤, 각각 4조각으로 나누었고, 1조각은 세포 주입 없이(대조군), 나머지 조각(실험군)은 2×106개/ml 의 농도로 0.1 ml씩 주입하였다가 대조군은 1주 후, 실험군은 1주, 2주, 3주 후에 고정 후 광학 현미경에서 관찰 하였다. 고정 전까지 주당 3번에 걸쳐 배지를 교환하였다.

결 과: 대조군은 살아 있는 세포가 드물게 보였으며, 1주 실험군에서는 다량의 살아 있는 세포가 선상으로 무리지 어 배열되어 있고, 2주, 3주 실험군에서는 살아있는 세포가 거의 없었다.

결 론: 배양된 연골 세포가 주입된 동종 반월상 연골에서 주입된 연골 세포는 생체 외 일정 조건하에서 최소 1주 이상 생존하였으며, 생존율을 높이기 위한 조건에 대한 후속 연구와 임상 연구가 필요할 것으로 생각된다.

색인 단어: 배양된 연골 세포, 동종 반월상 연골, 동종 반월상 연골

In vitro Experiment of survival for

cultured chondrocytes injected into allogenic meniscus -Preliminary Report-

Jee-Hyoung Kim, M.D., Song Lee, M.D., Hyung-bum Lim

, M.D., Young-Won Jeon, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Seoul Sacred Heart General Hospital, BHK Inc., Cell Therapy Institute*, Seoul, Korea

Purpose: To see the possibility of survival for cultured chondrocytes injected into the allogenic meniscus.

Materials and Methods: We harvested chondrocytes of articular cartilage from one of the

� Address for Correspondence : Song Lee, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Seoul Sacred Heart General Hospital, 40-12 Cheongnyngni-dong Dongdaemun-gu, Seoul, Seoul Sacred Heart Hospital Tel : 82-2-966-1616, Fax : 82-2-968-2394, E-mail : [email protected]

� 본 논문은 특정 회사와 연관이 없으며, 연구비 지원 등을 받지 않았습니다.

서 론

슬관절에서 반월상 연골 이식술은 Milachowski 등에 의해 도입된 이후 여러 저자들에 의해 시행되고 있으며, 경험의 축척과 기술적인 발전이 있어왔다.

그러나, 이식된 반월상 연골에 자가 연골 세포가 성 공적으로 자라 들어가서 생존한다는 확실한 증거는 없으며 자가 연골 세포가 성공적으로 자라 들어가기 위해서 어떻게 해야 하는지도 알려져 있지 않다.또한 경과 관찰 중, 이식편의 위축, 탈구 및 아탈구, 파열

등과 같은 합병증이 발생되어 왔기에 이를 해결하기 위해서 수술 술기상의 발전은 있어 왔지만, 세포의 운명과 세포 차원에서의 연구는 없었다. 이에 저자 들은 이식될 동종 반월상 연골에 자가 또는 동종의 연골 세포를 주입하면, 연골 세포가 생존할 수 있을 지, 이식된 반월상 연골이 보다 빨리 자가 생체화되 어서, 결과적으로 동종 반월상 연골이식술의 성공률 을 높일 수 있을지 확인하기 위해 본 실험을 하였다.

subjects, cultured and multiplied them in vitro. We harvested menisci from 3 different subjects and kept them in -70 degrees Celsius for over 3 months. We divided each of fresh frozen menis- cuses into 4 pieces, 1 piece without chondrocyte injection (control group), 3 other pieces (experi- mental group) injected 2×106cells/ml concentrated by 0.1 ml. For control group, we observed the results after a week and for experimental group, observed the results after 1st, 2nd and 3rd week with optical microscope.

Results: We could barely find survived cells in controll group. A larger number of survived cells were arranged linearly after 1 week and mostly disappeared in experimental group after 2~3 weeks.

Conclusion: Injected chondrocytes in the allogenic meniscus survived in vitro over one week in certain conditions. Follow up study and clinical study should be continued to meet the best condition for increasing survival rate.

Key Words: Cultured chondrocytes, Allogenic meniscus, Allogenic meniscus

Fig. 1. Fresh frozen allogenic meniscus divided into 5 pieces. 1 for control group, 3 for experimental group and 1 for another experiment.

Fig. 2. For the 3 pieces of experimental group, 2× 10⁶cells/ml of chondrocyte cell concentrated which was soaked in 1cc syringe was injected by 0.1ml slowly.

대상 및 방법

1. 연구대상

인공 슬관절 전치환술에서 채취한 비교적 건강하 게 보이는 3명의 외측 반월상 연골을 무균적 방법으 로 섭씨 영하 70도에서 보관하였다. 대상은 모두 여 자로, 나이는 평균 62세였으며, 냉동기간은 최소 6 개월 이상이었다.

인공슬관절 전치환술에서 채취한 다른 한 사람,

71세의 여자 관절 연골 세포를 체외 배양 증식하여 2×10⁶개/ml의 농도로 3 ml 준비하였다.

2. 시술방법

냉동 상태의 반월상 연골을 상온의 생리 식염수에 담가 약 10분 정도 두어 해동시켰다. 약 5~7 mm정 도의 폭이 되도록 육안적으로 손상되지 않은 부분의 반월상 연골을 잘라 모두 5조각을 얻었으며, 이번 실험에서는 4조각만 사용하였고, 한 조각은 특수염 색 처리를 위해 보존하여 두었다(Fig. 1).

대조군에는 아무런 조치도 하지 않았고, 실험군에 대해서는 1 cc 주사기에 담긴 2×10⁶개/ml 농도의 연골 세포를 한 조각 당 0.1 ml씩 손으로 서서히 주 입하였다. 반월상 연골은 매우 치밀한 조직으로 주 입하기가 용이하지 않으므로 주사의 주입구는 동일 하되, 조직의 내부에서 바늘을 이리저리 움직이면서 주사하였다(Fig. 2).

동일한 방법으로 3개의 반월상 연골에 대해 반복하 였고, 대조군 3조각, 실험군 9조각을 획득할 수 있었다.

각각의 연골 조직은 6 well plate에 담고 연골 세 포 배양에 사용하였던 동일 배지, 즉, 10% 우태혈청 (fetal bovine serum, Gibco BRP, Grand Island, NY, USA)와 1% Penicillin and Fig. 3. Supplied culture media after placing the control

& experimental groups (culture media: DMEM +10% FBS).

Fig. 4. Overall experiment picture.

streptomycin이 첨가된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 well당 3 ml씩 처리하여 배 양하였다(Fig. 3).

3. 연구방법

대조군과 실험군은 주 3회, 2일 내지 3일 간격으 로 동일한 배지를 교환하여 주었으며, 5%의 이산화 탄소가 포함된 섭씨 37.5도의 인큐베이터 속에 보관 되었다. 대조군은 1주후, 실험군은 1주, 2주, 3주 후 에 채취하여 고정하였고, H&E 염색을 하여 광학 현미경에서 관찰하였다. 전체적인 모식도는 그림 4 와 같다(Fig. 4).

결 과

대조군에서는 3명 모두의 반월상 연골에서 전장 에 걸쳐 드물게 세포핵이 관찰되었으며, 전체적으로 비슷한 정도의 밀도로 분포되어 있었고 무리 지어

있는 양상은 보이지 않았다(Fig. 5A-C).

1주 실험군에서는 대조군에서 보이는 것과 같은 배경, 즉 전체적으로 세포들이 드물게 분포된 배경 에 강하게 염색되는 세포의 핵의 무리가 군데군데 밀집되어 보였으며, 어떤 곳은 원형이나 타원형 또 는 선형으로(Fig. 6A-B) 배치되어 있는 있음을 볼 수 있었다. 아마도 주사기의 바늘을 따라서 세포들 이 배치된 것으로 생각되었다. 간혹 어떤 부위는 전 체적으로 밀도가 높은 곳도 관찰되었는데(Fig. 6C) 이는 주사액이 틈을 따라서 일정부위에 퍼진 것으로 생각되었다.

2주 실험군에서 전체적으로 세포의 수가 급격히 줄어서 1주 실험군보다 적은 수를 보였으나(Fig.

7A), 군데 군데 세포가 남아 있으면서 이 세포의 주 위에는 배경과는 다르게 일관된 모양의 초자연골같 이 투명한 양상의 틈이 없는 세포의 기질이 있었다 (Fig. 7B-C). 이는 세포가 생존하면서 기질을 만들 어 내었을 것으로 추정해 볼 수 있었다. 3주 실험군 에서는 거의 모든 세포가 죽어 있었다(Fig. 8A-B).

Fig. 5A-C. Control group: We observed the result after one week; cells were barely found (X 40, H&E stain).

Fig. 6A-C. First week experimental group: In back ground cells were evenly and barely distributed as control group and a large number of cells were arranged in groups of round, oval or linear type (A) (B). Partially, the cells were arranged in large area in high density (C) (× 40, H&E stain).

A B C

A B C

전체적으로 요약할 때, 대조군에서는 적은 수의 세포가 일정한 비율로 분포되어 있었고, 1주 실험군 에서는 대조군과 같은 배경에 군데 군데 밀집된 세 포가 선상, 타원형 등을 이루고 배치되어 있어 주사 기로 주입된 세포군임을 추정하게 하였다. 2주 실험 군에서는 많은 수의 세포가 죽었고, 일부 남은 생존 한 세포는 세포 외 기질을 만들어 내었을 가능성이 있지만 확실하지 않았다. 3주 실험군에서는 거의 모 든 세포가 죽어 있었다.

고 찰

반월상 연골의 손상으로 반월상 연골 전절제술이 나 아전절제술을 시행 받은 슬관절은 향후 퇴행성 관절염이 진행될 가능성이 많다고 알려져 있으며,

1989년 Milachowski 등⁵⁾이 최초로 반월상 연골이 식술을 시행한 이후에 많은 저자들이 그 결과를 발 표하였다.

Rodeo⁸⁾는 반월상 연골 이식술 후 기존의 관절 연 골 손상은 그대로 유지되거나 오히려 더 악화되었다 고 하였다. Rath 등⁷⁾은 이식된 반월상 연골 자체가 정상에 비해 생역학적으로 부피가 감소하거나 변성 이 빨리 되는 경향이 있으며, 퇴행성 변화에 대한 효 과는 장기적 관점에서 더 관찰할 필요가 있다 하였 다. Verdonk 등¹¹⁾은 MRI 소견상 이식된 반월상 연 골의 변연부의 탈구 및 아탈구가 많이 발생한다고 하였고, Rodeo⁸⁾는 이러한 아탈구와 탈구가 관절연 골의 손상과 관련이 있으며, 임상적인 결과를 나쁘 게 한다고 하였다. Chen 등²⁾은 수술 당시의 단단한 고정이 되지 않아서 생기는 문제라고 했지만, 조와

Fig. 7A-C. Second week experimental group: cells were dramatically decreased, less than number of control group (A). Partially, cells were existing but in the different extracellular matrix. The matrix is a clear and high density matrix like a hyaline cartilage (B) (C) (×40, H&E stain).

Fig. 8A-B. Third week experimental group: most of cells died (× 40, H&E stain).

A B C

A B

김³⁾은 18 예 중 17 예가 단단한 고정에도 불구하고 탈구, 또는 아탈구를 보였다고 하였다.

Stollsteimer 등¹⁰⁾은 1년 내지 5년간의 MRI 추 적 관찰에서 반월상 연골이 63%(31%~100%)정도 로 위축되어 있다고 하였다. Noyes 등⁶⁾은 40 예의 관찰에서, 28%는 실패였으며, 30%는 변형되었다 고 하면서, 단기 추시로는 통증이 줄어들었지만, 장 기적으로는 어떤 결과일지 알 수 없다고 하였다.

Verdonk 등¹²⁾은 100 예로 평균 7.2년 관찰하였을 때, 내측 반월상 연골의 28%와 외측 반월상 연골의 16%가 실패하였다고 하였고, 생존율 분석에서는 약 10년 후 70%의 환자에서 도움이 되었다고 하였다.

그러나, 동시에 만일 이 시술을 받지 않은 사람들과 의 비교하였을 때 얼마나 더 우위에 있을지 객관적 인 연구가 필요하다고 언급하였다.

이상의 선행연구자들의 결과를 종합해 볼 때, 이식 된 반월상 연골은 수술적으로 단단히 봉합하였음에 도 불구하고, 재파열, 아탈구, 탈구, 위축 등이 많이 발생하고 있으며, 퇴행성 변화를 예방함에 있어서도 확실한 방법이라고 말할 수가 없는 것으로 보인다.

Rath 등⁷⁾은 22예를 2~8년 추시 관찰 중 8예 (36%)가 파열이 발생하여 6예는 부분 절제술을, 2예 는 전절제술이 필요하였다고 하였다. 그리고 이식된 반월상 연골은 정상에 비해 적은 수의 세포가 있는데, 이것이 파열의 원인중의 하나일 것으로 생각하였다.

Arnoczky 등¹⁾은 개를 이용한 동물 실험에서 이식된 반월상 연골의 변연부에서 세포가 자라 들어가게 되 는데, 가운데 부분으로 갈수록 세포의 수가 적음을 관 찰하였다. Rodeo 등⁹⁾은 실패한 반월상 연골의 조직 학적 소견에서 반월상 연골에 세포의 숫자가 적으면 서 특히 변연부보다는 중심부일수록 세포의 수가 적 었고, 세포는 섬유아세포, 섬유연골세포, 활막세포 등 다양한 세포로 구성되어 있었다라고 하였다.

이를 종합해 볼 때, 이식된 반월상 연골의 실패의 원인 중 하나로 자가 연골세포가 충분히 침식하여 들어가서 생존하지 못함으로써 적합한 기질을 만들 어 내지 못하기 때문임을 가정할 수 있다. 이식된 반 월상 연골은 이식될 당시 살아 있는 세포가 거의 없 을 것이므로 자기 몸 즉 변연부에서 일부의 연골 세 포나 그 전구 세포 또는 다른 세포들이 침식하여 동

종이식편에 생존할 것을 기대하게 되는데, 일반적으 로 성인에서는 연골세포 자체가 생체내에서 증식이 거의 없는 세포로 알려져 있어⁴⁾, 자기의 연골세포가 이식된 동종이식편에 변연부로부터 점차 침식되어 생존하리라 기대하기가 어렵다. 또한 반월상 연골 자체가 매우 조밀한 조직이고, 혈관이 없는 조직이 므로 세포가 자라 들어갈 수 있는 다른 경로가 부족 하다고 생각이 된다. 그러므로 이식된 반월상 연골 이 과연 생체내에서 살아 있는 것인지, 즉 살아있는 세포가 있을 것인지 의문이 있다. 또한 생존하고 있 다고 할 때, 이식된 반월상 연골 내부의 세포가 과연 연골 세포일지 혹은 다른 세포 즉 섬유 세포 등 연골 세포보다 반월상 연골에 적합하지 않은 다른 세포일 가능성도 충분히 생각해 볼 수 있다.

이에 저자들은 반월상 연골이 점차 위축되거나 또 는 탈구 또는 아탈구, 또는 파열이 잘 발생하는 것이 정상적인 연골세포가 자라서 들어가지 못하게 되기 때문이라고 가정하였고 생체외부에서 자가 연골 세 포를 배양 증식한 뒤에 반월상 연골 이식술을 시행 하는 직전 동종 반월상 연골에 자가 연골세포를 주 사하든지 혹은 이식직후 관절경하에서 바로 주사기 를 이용하여 주입하면 이식된 동종 반월상 연골에 자가 연골세포가 빨리 생존할 수 있을 것이라고 생 각하였다. 이렇게 연골세포가 빨리 생존하게 될 때, 반월상 연골의 생존이 좋아지며, 반월상 연골의 탈 구나 아탈구 현상과 파열, 위축을 예방하여 전체적 으로 장기적인 성공율을 높일 것으로 기대하였다.

또는 동종 반월상 연골에 연골 세포를 주입한 뒤, 생체 외에서 적절한 조건을 주어 연골세포가 충분한 기간 생존하고, 세포외 기질을 만들어 낼 수 있다면, 즉, 이미 체외에서 생존해있는 반월상 연골을 이식 하게 될 때, 반월상 연골 이식술의 성공율을 높일 수 있을 것으로 기대하였다.

본 실험으로 이식된 세포는 실험실 내의 적절한 환경에서 최소 1주 이상 생존하는 것이 확인되었다.

실험실 내의 환경은 반월상 연골 내부에 이식된 연 골 세포에 영양물질이 도달하기에 생체에 비해 불리 한 환경으로, 확산에 의해 영양분을 공급받는 것으 로 알려진 연골 세포의 경우 생체내에서는 관절운동 에 따라 적절히 흐르는 활막과 반월상 연골자체의

움직임으로 보다 더 영양 공급을 잘 받을 가능성이 있다. 그러므로 생체외에서 최소 1주이상 생존한 연 골 세포가 생체 내에서도 보다 더 오랜 기간 생존할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

그러나 생체내에서는 얼마나 생존할 수 있을지, 실험실에서 보다 더욱 잘 생존할지에 대한 답을 찾 기 위해 동물 실험 또는 임상적인 연구가 필요할 것 으로 생각된다. 또한 어떤 농도로, 얼마의 양을, 어 떤 방법으로 주입하는 것이 더 좋을지, 혹은 어떤 어 떤 물질을 첨가한 배지를 사용하는 것이 더 좋을지 등 후속 연구가 필요할 것이다.

또한 공여 세포에 대해서도 반월상 연골, 관절 연 골, 늑골 등 다른 공여부의 연골세포, 연골세포의 전 구세포, 자가 및 동종의 세포 등 여러 가능성 있는 세포 중 최적의 세포 조건에 대한 후속 연구가 필요 할 것이다.

만일 생체 외에서 충분히 연골 세포가 생존할 수 있는 화학적, 물리적, 생물학적 환경을 제공할 수 있 다면, 반월상 연골 이식 당시 이미 충분한 자기 연골 세포가 살아 있는 반월상 연골을 이식할 수 있을 것 으로 기대할 수 있다.

우리의 실험에서 사용한 H&E 염색 뿐 아니라, 세 포의 주위에 보이는 기질이 원래의 기질인지 새로 만들어진 기질인지 확인할 수 있는 특수 염색도 필 요할 것으로 생각된다. 세포의 농도를 변화시키면서 충분한 양의 세포가 투입될 수 있는 실험 방법 상의 개선도 필요할 것으로 생각된다.

결 론

주사기를 통해 동종 반월상 연골에 주입된 체외 배 양 연골 세포는 일정한 조건하에 최소 1주 이상 생존 하였다. 연골세포가 주입된 동종 반월상 연골 이식술 에서 연골세포가 보다 장기간 생존할 수 있는 조건을 확립할 때, 기존의 동종 반월상 연골 이식술보다 우 수할 것으로 기대되며, 이를 위해 추후 더 많은 실험 실 연구 및 임상 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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