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신선동결 반월상 연골 이식술에 연골세포를 증식시킬 수 있을까?

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신선동결 반월상 연골 이식술에 연골세포를 증식시킬 수 있을까?

서울성심병원 정형외과, 조직은행�, 진단검사의학과��

김지형∙이 송∙김경태∙안동기�∙김인자��∙김대근

목 적: 신선동결된 반월상 연골내 주입된 연골 절편 내의 연골 세포가 신선동결된 동종 연골내부로 침투 및 증식 하는지 확인하고자 하였다.

대상 및 방법: 1명의 반월상 연골조각을 2*2*10 mm3절편(이하 연골절편)으로 만든 뒤, 4분간 4% 콜라게네이즈 에 담구었다가 생리식염수로 씻었다. 섭씨 -70도 이하로 6개월 이상 신선동결된 반월상 연골의 내부에 3 mm 지름의 구멍을 뚫어서 공간을 만들어서, 앞서 만든 연골절편을 삽입하였다. 콜라게네이즈를 처리하지 않은 연골 절편을 삽입한 것을 대조군으로 하였다. 이후 조직 배양 후 1주 간격으로 3주간 관찰한 뒤 고정하여 H&E 염색 후 광학현미경하 관찰하였다. 고정 전까지 주당 2번에 걸쳐 배지를 교환하였다.

결 과: 1주, 2주, 3주 실험군에서는 동결연골 내부에 둥근 모양의 연골 덩어리에 국한된 세포의 증식상이 보이며, 시간이 경과할수록 세포의 밀도가 높아졌다. 주변의 동결연골 내부에는 전체적으로 세포가 희소하였으나 일부분 세포가 군집을 이루면서 모여있고, 2주, 3주군으로 갈수록 그 세포와 군집의 수가 증가하였다. 3주 대조군에서는 가운데의 연골덩어리가 둥글기 보다는 원래의 4각형 모양이 일부 남아 있으면서, 가운데 연골 절편에는 1주 실험 군보다 훨씬 낮은 밀도의 세포들이 보였으며, 주변의 동결연골 내부에도 전체적으로 세포가 거의 관찰되지 않았 으나 한 군데 세포의 군집이 관찰되었다.

결 론: 반월상연골이식술에 사용되는 신선동결 반월상연골 조각에 콜라게네이즈 처리한 반월상 연골 절편은 자체적으로 도 연골세포가 증식하는 3차원 배지의 역할을 하면서 동시에 연골세포의 공여자로서 가능성이 있을 것으로 생각된다.

색인 단어: 반월상연골이식술, 콜라게네이즈 처리된 연골 조각, 신선동결 반월상연골

Can Chondrocytes Invade Into and Proliferate in Allogenic Meniscus?

Jee Hyoung Kim, M.D., Song Lee, M.D., Kyung Tae Kim, M.D., Dong Ki Ahn, M.D.*, In Ja Kim, M.D.**, Dae Geun Kim, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, The Tissue Bank for Bone and Cartilage*, Department of Laboratory Medicine**, Seoul Sacred Heart General Hospital

Purpose: To examine whether chondrocytes in cartilage inserted into the fresh frozen meniscus

� Address for Correspondence: Song Lee, M.D.

Department of Orthopedic Surgery, Seoul Sacred Heart General Hospital 40-12 Chungryangri-dong, Dongdaemoon-gu, Seoul, Korea,

Tel : 82-2-966-1616, Fax : 82-2-968-2394, E-mail : songlee0903@hanmail.net

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서 론

반월상 연골의 손상으로 반월상 연골 전절제술이 나 아전절제술을 시행 받은 슬관절은 향후 퇴행성 관절염이 진행될 가능성이 많다고 알려져 있으며, 1989년 Milachowski 등1)이 최초로 반월상 연골이 식술을 시행한 이후에 많은 저자들이 그 결과를 발 표하였다.

그러나, 이식된 반월상 연골에 자가 연골세포가 성공적으로 자라 들어가서 생존한다는 확실한 증거 는 없으며 자가 연골세포가 성공적으로 자라 들어가 기 위해서 어떻게 해야 하는지도 알려져 있지 않다.

또한 경과 관찰 중, 이식편의 위축, 탈구 및 아탈 구, 파열 등과 같은 합병증이 발생되어 왔기에 이를 해결하기 위해서 수술 술기상의 발전은 있어 왔지만, 세포의 운명과 세포 차원에서의 연구는 빈약하였다.

본 저자들은 동종 반월상 연골이식술의 성공률을 높일 수 있기 위해서는 이식편에 연골세포 등 살아있 는 세포가 가능한 빨리 성장하여야 한다고 생각한다.

이식될 동결 건조된 반월상 연골에 살아있는 연골 조각을 collagenase로 처리한 상태로 주입하면, 동 결 건조된 반월상 연골에 연골세포를 제공하여 연골 세포가 증식할 것이라는 가설을 세우고 이를 실험적 으로 확인하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 연구 대상

인공슬관절 전치환술에서 채취한 비교적 건강한 57세 남자환자의 외측 반월상 연골을 무균적 방법으 로 섭씨 영하 70도에서 6개월 이상 보관하여 신선동 결 반월상 연골이식용 조직을 준비하였다.

인공슬관절 전치환술에서 채취한 다른 한 사람의 반월상 연골의 비교적 건강한 부분의 red-white 부위(반월상 연골의 변연부와 중심부 사이의 중심 부위)에서 표면에 해당하는 부분에서 2*2*10 mm 의 절편들을 만들었다.

would penetrate into the allogenic meniscus and proliferate.

Materials and Methods: The meniscus was made as size of 2*2*10 mm

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fragment and washed by normal saline after soaking in the 4% collagenase for 4 minutes. The meniscus frag- ment was inserted into a 3 mm-hole of fresh frozen meniscus stored for more than 6 months under -70 Celsius degrees. In the control group, the meniscus fragment was not treated by colla- genase. During 3 weeks of the culture process, we examined the histology under the light microscopy by using H&E stain every a week. We exchanged the culture media twice a week before histologic examination.

Results: We found proliferation of chondrocytes in the meniscus fragment and increasing den- sity of chondrocyte as time goes in experimental groups. There was a little chondrocyte in the fresh frozen meniscus as making small colonies, but number of chondrocytes and colonies was increasing as time goes. In the control group of 3 weeks, the mass in the middle of cartilage was remained as original rectangular shape rather than round shape and the section in the middle of cartilage had lower cell-density than the cell-density of cartilage in the experimental group of 1 week. Over all, the cells inside of the peripheral frozen-cartilage was few observed, but clusters of the cells were observed in only one place.

Conclusion: We think that collagenased fresh frozen meniscus used in meniscus transplanta- tion would be not only a 3-dimensional medium but also a donor of chondrocyte.

Key Words: Meniscus transplantation, Collagenased meniscus fragment, Fresh frozen meniscus

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모든 조작은 무균적으로 시행되었다.

2. 시술 방법

신선동결 연골조각 만들기: 냉동 상태의 반월상 연골을 상온의 생리 식염수에 담가 약 10분 정도 두 어 해동시켰다. 약 7 mm정도의 폭이 되도록 육안적 으로 손상되지 않은 부분의 반월상 연골을 잘라 조 각을 얻었으며, 가운데 부분을 꿰는 듯이 3 mm 두 께의 스테인레스 철사로 뚫어서 구멍을 만들고, 다 시 철사를 빼 주었다.

연골 절편 만들기: 2*2*10 mm3 의 절편으로 만 들어진 것에 비해 대조군인 1조각에는 아무런 조치 도 하지 않았고, 실험군인 3조각에 대해서는 4% 콜 라게네이즈에 4분간 담구었다가 생리식염수로 수차

례 씻어 주었다.

연골 조각과 연골 절편 결합하기: 연골 조각의 스 테인레스 철사로 뚫은 구멍으로 모기 겸자를 이용하 여 연골 절편을 끼워 넣었다.

배양하기: 각각은 24 well plate에 담았다. 10%

우태혈청(fetal bovine serum, Gibco BRP, Grand Island, NY, USA)와 1% Penicillin and streptomycin이 첨가된 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) 37.5 ml와 hyaluronic acid(신풍제약, 서울, 한국) 2.5 ml를 혼합하여 배 지를 만들어 배양하였다.

3. 연구 방법

대조군과 실험군은 주 2회 간격으로 동일한 배지

Fig. 1. Overall experiment diagram.

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를 교환하여 주었으며, 5% 의 이산화탄소가 포함된 섭씨 37.5도의 인큐베이터 속에 보관되었다.

대조군은 3주 후, 실험군은 1주, 2주, 3주 후에 채 취하여 고정하였고, H&E 염색을 하여 광학 현미경 하에서 관찰하였다. 전체적인 모식도는 Fig. 1과 같 다(Fig. 1).

결 과

1주 실험군에서는 중심부에 원형의 연골 조각에 는 많은 세포들이 관찰되었으나, 주변의 연골조각에 는 세포의 핵이 드물게 관찰되었다. 전체적으로 주 변부에서 세포가 증식했다고 할만한 소견은 없었다 (Fig. 2).

2주 실험군에서 중심부의 연골조각에서도 연골의 밀도가 증가하였고, 주변부에서도 부분적으로 세포 가 밀집되어 있고, 띠모양의 배열을 보이면서 모여 있는 세포군을 군데군데 관찰할 수 있었다. 중심부

와 주변부의 경계는 여전히 분명하였다(Fig. 2).

3주 실험군에서는 2주 실험군과 비슷한 양상이었 으며, 중심부의 연골조각에서 연골의 밀도가 더욱 증가하였다. 주변부의 세포들의 배열도 띠모양이었 고, 세포의 숫자 및 군집의 숫자가 2주 실험군에 비 해 증가하였다(Fig. 2, 3).

3주 대조군에서는 가운데 연골조직은 여전히 4각 형 모양의 흔적을 가지고 있었고, 세포는 관찰되었 으나 세포의 밀도는 1주 실험군보다 적었다. 주위의 신선동결 조직에서는 세포가 거의 관찰되지 않았으 나, 한 군데의 세포군집이 관찰되며, 이곳에는 여러 세포가 모여있었다(Fig. 2, 4).

전체적으로 요약할 때, 대조군에서는 3주에서도 중심부의 연골조각에서도 세포가 증식하지 않았으 나, 콜라게네이즈 처리를 한 실험군에서는 시간이 지날 수로 중심부 연골조각에서도 세포가 증식하며, 주변부에도 군집을 이루는 세포의 증식을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 2. Meniscus fragments of 1st, 2nd, 3rd week experimental groups and 3rd week control group in low power field: Density of chondrocytes is increasing as time goes in experimental groups. On the other hand, density of control groups was less than that of the 3rd week experimental group (×40, H&E stain).

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Fig. 4. The surrounding fresh frozen meniscus in control groups: There is little chondrocyte, but just one colony (× 100, H&E stain).

Fig. 3. The surrounding fresh frozen meniscus in experimental groups: In the background, there were a little cells, but many colonies which have lots of cells are observed (×100, H&E stain).

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고 찰

슬관절에서 반월상 연골 이식술은 Milachowski 1)에 의해 도입된 이후 여러 저자들에 의해 시행되 고 있으며, 경험의 축척과 기술적인 발전이 있어왔다.

Rodeo2)는 반월상 연골 이식술 후 기존의 관절 연 골 손상은 유지되거나 악화되었다고 하였다. Rath 3)은 이식된 반월상 연골 자체가 정상에 비해 부피 가 감소하거나 변성이 빨리 되는 경향이 있다고 하 였다. Verdonk 등4)은 MRI 소견상 이식된 반월상 연골의 변연부의 탈구 및 아탈구가 많이 발생한다고 하였고, Rodeo2)는 이러한 아탈구와 탈구가 관절연 골의 손상과 관련이 있으며, 임상적인 결과를 나쁘 게 한다고 하였다. Chen 등5)은 수술 당시의 단단한 고정이 되지 않아서 생기는 문제라고 했지만, Cho 와 Kim 등6)은 18 예 중 17 예가 단단한 고정에도 불구하고 탈구, 또는 아탈구를 보였다고 하였다.

Stollsteimer 등7)은 1년 내지 5년간의 MRI 추 적관찰에서 반월상 연골이 63%(31%~100%)정도 로 위축되었고, Noyes 등8)은 40 예의 관찰에서, 28%는 실패였으며, 30%는 변형되었다고 하면서, 단기 추시로는 통증이 줄어들었지만, 장기적으로는 어떤 결과일지 알 수 없다고 하였다. Verdonk 등9) 은 100 예로 평균 7.2년 관찰하였을 때, 내측 반월상 연골의 28%와 외측 반월상 연골의 16%가 실패하 였다고 하였고, 생존율 분석에서는 약 10년 후 70%

의 환자에서 도움이 되었지만, 만일 이 시술을 받지 않은 사람들과의 비교하였을 때 얼마나 더 우위에

있을지 객관적인 연구가 필요하다고 언급하였다.

이상의 선행연구자들의 결과를 종합해 볼 때, 이 식된 반월상 연골은 수술적으로 단단히 봉합하였음 에도 불구하고, 재파열, 아탈구, 탈구, 위축 등이 많 이 발생하고 있으며, 퇴행성 변화를 예방함에 있어 서도 분명한 대조군 연구가 필요하다고 생각된다.

세포적 차원에서의 연구도 제한적으로 시행되었 는데, Rath 등3)은 22예를 2~8년 추시 관찰 중 8예 (36%)가 파열이 발생하여 6예는 부분 절제술을, 2 예는 전절제술을 시행하였고, 이식된 반월상 연골은 정상에 비해 적은 수의 세포가 있는데, 이것이 파열 의 원인 중의 하나일 것으로 생각하였다.

Arnoczky 등10)은 개를 이용한 동물실험에서 이 식된 반월상연골의 변연부에서 가운데 부분으로 갈 수록 세포의 수가 적음을 관찰하였다.

Rodeo 등11)은 실패한 반월상 연골의 조직학적 소 견에서 반월상 연골에 세포의 숫자가 적으면서 특히 변연부보다는 중심부일수록 세포의 수가 적었고, 세 포는 섬유아세포, 섬유연골세포, 활막세포 등 다양 한 세포로 구성되어 있었다라고 하였다.

이를 종합해 볼 때, 이식된 반월상 연골의 실패의 원인 중 하나로 자가 연골세포가 충분히 침식하여 들어가서 생존하지 못함으로써 적합한 기질을 만들 어 내지 못하기 때문임을 가정할 수 있다.

이식된 반월상 연골은 이식될 당시 살아 있는 세 포가 거의 없을 것이므로 자기 몸 즉 변연부에서 일 부의 연골세포나 그 전구세포 또는 다른 세포들이 침식하여 동종이식편에 생존할 것을 기대하게 되는 Fig. 5. Meniscus fragments of 1st, 3rd week experimental groups and control groups in high power field: Density of chondrocytes is increasing as time goes in experimental groups. On the other hand, density of control groups was less than one of the 1st week experimental group (×100, H&E stain).

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데, 일반적으로 성인에서는 연골세포 자체가 생체내 에서 증식이 거의 없는 세포로 알려져 있어, 자기의 연골세포가 이식된 동종이식편의 변연부로부터 점 차 침식되어 생존하리라 기대하기가 어렵다고 생각 된다. 또한 반월상 연골 자체가 매우 조밀한 조직이 고, 혈관이 없는 조직이므로 세포가 자라 들어갈 수 있는 다른 경로가 부족하다고 생각이 된다.

그러므로 이식된 반월상 연골이 과연 생체내에서 살아 있는 것인지, 즉 살아있는 세포가 있을 것인지 의문이 있다. 또한 생존하고 있다고 할 때, 이식된 반월상 연골 내부의 세포가 과연 연골 세포일지 혹 은 다른 세포 즉 섬유 세포 등 연골 세포보다 반월상 연골에 적합하지 않은 다른 세포일 가능성도 충분히 생각해 볼 수 있다.

Kim 등12)은 동일한 가정하에 생체외부에서 자가 연골세포를 배양 증식한 뒤에 반월상연골 이식술을 시행하는 직전 동종 반월상 연골에 자가 연골세포를 주사하는 방법을 실험적으로 제시하였고, 이를 위한 생체외 실험(in vitro)에서 주입한 세포가 3주 정도 까지만 생존할 수 있다고 하였다. 그러나 Kim 등12) 은 실험실 내의 환경은 반월상 연골 내부에 이식된 연골 세포에 영양물질이 도달하기에 생체에 비해 불 리한 환경으로, 확산에 의해 영양분을 공급받는 것 으로 알려진 연골 세포의 경우 생체내에서는 관절운 동에 따라 적절히 흐르는 활막과 반월상 연골자체의 움직임으로 보다 더 영양 공급을 잘 받을 가능성이 있으므로 생체 내에서는 보다 더 오랜 기간 생존할 수 있을 것으로 기대하였지만, 실험적으로 증명하지 는 못했다.

또한 Kim 등12)이 제시한 방법은 실제 임상에 적 용하고자 할 때, 연골조직을 체취하여 생체외에서 연골세포를 분리 배양 증식한 뒤 다시 이식하는 2번 의 시술 또는 수술이 필요하다는 제한점이 있다.

본 저자들이 본 실험을 통해 이루고자 하는 임상 적인 방법은 동종 반월상연골이식술 당시에 남아있 는 본인의 반월상연골조각을 콜라게네이즈나 또는 그와 비슷한 역할을 할 수 있도록 적절한 생물학적 또는 화학적 처리를 한 뒤 동종 반월상연골이식편에 주입한 뒤에 수술할 수 있으므로, 한 번의 수술로 처 치가 가능할 것으로 기대된다.

또한 기존의 세포 수준에서의 처리가 없었던 반월 상연골이식술이 앞서 많은 저자들이 지적하였던 것 과 같이 연골 세포가 침투 및 증식이 보장되지 않으 나, 본 저자들이 제시하는 방법은 비록 생체외실험 (in vitro)이긴 하지만, 연골 세포가 침투 및 증식할 가능성을 본 실험으로 확인할 수 있었다.

한편 Kim 등13)은 콜라게네이즈를 처리한 연골조 직은 그 자체가 하나의 폴리머로서 연골세포가 증식 할 수 있다고 하였으며, 그들의 방법에 따라 동일한 콜라게네이즈를 동일한 농도로 적용하였을 때, 동일 하게 중심부의 연골조각에서 시간이 지남에 따라 본 저자들의 실험 결과에서도 연골세포의 밀도가 증가 하였으므로, Kim 등12)의 가설과 동일한 결과로 생 각된다.

콜라게네이즈는 연골세포를 단층세포배양하기 위 해 흔히 사용되는 효소로서 저자들을 포함하여 여러 실험자에게 익숙하여 본 실험에 적합할 것으로 판단 하였으나, 추가 실험을 통해 보다 적절한 물질이 가 능한지 등 다양한 조건에서 실험을 반복해야 할 것 이며 동물실험 및 임상시험 등을 통해 검증되어야 할 방법으로 생각된다.

본 실험의 한계로는 첫째 3주까지의 결과물로서 향후 장기추시가 필요한 점, 둘째 적은 숫자의 실험, 셋째 이미 퇴행성 변화가 있을 것으로 예상되는 인 공관절수술 대상 환자에서 얻어진 조직으로 실험을 진행한 것, 마지막으로 생체외 실험으로서 임상적 결과를 유추하기에는 부족한 점들이다.

결 론

4% 콜라게네이즈에 담가 두었다가 생리식염수로 씻어낸 반월상연골 조각(연골 절편)은 신선동결된 반월상연골에 주입되었을 때, 3주간 동결연골 내부 세포의 증식상이 보이며, 시간이 경과할수록 세포의 밀도가 높아졌다. 또한 주변의 신선 동결연골 내부 에는 전체적으로 세포가 희소하였으나 일부분 세포 가 군집을 이루면서 모여있고, 시간이 갈수록 그 세 포와 군집의 수가 증가하였다.

따라서 연골 절편 내부에도 연골세포가 시간에 따 라 증식하며, 시간이 지나면서 주위 조직에 연골세포

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로 보이는 세포들의 증식을 일으키므로, 동종반월상 연골이식술 시 이식편에 연골세포를 제공할 수 있는 공급체로서의 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.

참고문헌

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