반응표면분석법을 이용한 오디액의 유산발효 조건 최적화 엄인주

반응표면분석법을 이용한 오디액의 유산발효 조건 최적화

엄인주․김성호 대구대학교 식품공학과

Optimization of Lactic Acid Fermentation Condition of Mulberry Juice Using Response Surface Methodology

In-Ju Eom and Seong-Ho Kim

Department of Food Engineering, Daegu University

ABSTRACT The conditions for the lactic acid fermentation of mulberry juice were optimized using a response surface methodology (RSM). The properties and content of the major components of mulberry juice fermented by isolated Lactobacillus plantarum DUIJ-1612 (KCTC 13170BP) were analyzed. A central composite design was applied to exam- ine the effects of three independent variables: fermentation time (12∼60 hours; X

), mulberry concentration (5∼9°Brix;

X

), and fermentation temperature (30

42°C; X

). The fermentation conditions were optimized with the characteristics and major component content of mulberry juice ferments as a dependent variable. As a result, the viable cell counts were 11.02∼14.31 log CFU/mL and the coefficient (R

) of the derived equation from the response surface regression for the viable cell count was 0.8069. The total anthocyanin content as the major component in all fermentation samples was 47.92∼101.17 mg/100 mL with a R

value of 0.9132 and were within the 1% significance level. The resveratrol content as a major component in all fermentation samples was 0.11∼0.65 mg/100 mL with a R

value of 0.9082, which was within the 1% significance level. The optimal conditions determined by superimposing the four-dimensional RSM on the viable cell count, total anthocyanin and resveratrol contents under various fermentation conditions were established as follows: fermentation time, 42 hours; mulberry concentration, 8.0°Brix; and fermentation temperature, 33°C.

Key words: mulberry, lactic acid fermentation, fermentation condition, response surface methodology

Received 1 April 2019; Accepted 16 April 2019

Corresponding author: Seong-Ho Kim, Department of Food Engin- eering, Daegu University, Gyeongbuk 38453, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-53-850-6536

Author information: In-Ju Eom (Graduate student), Seong-Ho Kim (Professor)

서 론

다양한 발효 식품과 프로바이오틱스를 이용한 발효액의 면역기능 강화, 장 기능 개선, 생리조절 작용과 새로운 항균 물질의 생성 등과 관련된 유익한 효능에 많은 관심을 받고 있는 추세이다(Aureli 등, 2011). 유산균 등의 프로바이오틱 스는 인간이나 동물의 장관에 상존하여 건강유지에 큰 역할 을 담당하는 것으로 알려져 있으며(Sanders, 2003), 사람의 장내 pH를 낮추어 장내부패세균의 증식을 억제하는 등의 효과를 가지는 미생물로 알려져 있다(Marteau 등, 2001).

유산균에 의해 생성된 대사산물은 설사를 일으키는 병원성 미생물과 장내 유해균을 사멸 또는 증식을 억제하는 등의 건강증진 효과를 보여준다(Floch와 Hong-Curtiss, 2001).

또한 유산균은 혈청콜레스테롤의 감소(Gilland, 1989), 유

해균에 대한 항균성(Klaenhammer, 1988), 항종양 활성 (Hirayama와 Rafter, 2000), 항돌연변이 효과(Tavan 등, 2002) 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

오디(

Morus alba

Morus

영양성분은 일반과실보다 전반적으로 높고, 특히 Ca, K, 비 타민 B1, 비타민 C의 함량과 glucose와 fructose와 같은 유 리당 및 oxalic acid와 citric acid 등의 유기산 함량이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2004). 또한 오 디에는 cyanidin-3-glucoside(C3G)와 cyanidin-3-ruti- noside(C3R) 등의 anthocyanin 색소를 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(Ishikura, 1975). 오디의 효능성분으로 알려진 stilbenoids에는 polydatin(trans-piceid), resver- atrol(trans-3,5,4’-trihydroxystilbene), piceatanol, rha- pontigenin, astringin, pterostilbene, rhaponticin, vitsin A 등이 함유되어 있다고 보고되었다(Kim 등, 2008a). 그중 resveratrol은 다양한 식물에서도 존재하고 있으며, 인체의 혈소판 응집억제(Pace-Asciak, 1995), 지질대사 제어(Ahn

등, 2008), 지방 과산화 억제 및 free radical 소거 기능과 같은 항산화 작용(Frémont 등, 1999), cyclooxygenase 저 해 등의 항염증 작용(Maccarrone 등, 1999; Subbaramai- ah 등, 1999), 암세포 성장 억제 효능(Opipari 등, 2004;

Bishayee, 2009) 등 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려 져 있다(Frémont, 2000).

현재까지 오디를 이용한 발효와 관련된 연구로는 오디와 인의 최적 발효 조건 연구(Kim 등, 2008b), 오디 첨가 막걸 리 발효의 이화학적 및 미생물학적 연구(Kim 등, 2013), 토 종 발효미생물을 이용한 오디 발효주의 항산화 및 향기성분 연구(Chae 등, 2014), 오디농축액 첨가에 따른 식혜의 품질 특성(Yang 등, 2016), 오디 분말 첨가 요구르트의 품질 및 항산화능의 영향(Sung과 Choi, 2014), 분리 유산균종들에 의한 오디 농축액 등의 발효 특성(Ryu 등, 2018), 젖산발효 에 의한 오디 등의 이화학 및 항산화적 특성 변화(Chae 등, 2017), 오디 유산균 발효물의 이화학적 특성 및 항산화 활성 (Lee와 Hong, 2016) 등이 보고되어 있다. 그러나 유산균 발효에 의한 오디의 유효성분 변화에 대한 연구는 다소 미흡 한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 오디의 유산균 발효 조 건에 따른 발효액의 유효성분의 변화를 확인하여 기능성식 품 소재로서의 이용성과 효능 연구 등에 활용하고자 발효식 품 등에서 분리한 식물성 유산균인

Lactobacillus planta- rum

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에서 사용된 오디는 2016년 경북 영천에서 재배 생산한 익수뽕 품종을 당해연도 6월에 직접 농가에서 구입 하였으며, 구입 후 즉시 유압 압착기(스텐 유압기, BCM, Daegu, Korea)로 착즙 후 여과한 오디액(10.9±0.1°Brix) 을 -20°C에 보관하면서 발효원료로 사용하였다.

유산균의 분리 및 β-glucosidase 활성 균주 선발

g

후, Peralta 등(1997)의 방법을 변형하여 β-glucosidase 활성을 측정하였다. 즉 원심분리 한 상층액 0.5 mL를 37°C, 5분간 활성화하고 5 mM

p

p

°C, 30분간 반응시켰다. 이 반응액에 100 mM Na₂CO₃ 용액 (pH 8)을 첨가하여 반응을 중지시키고, 분광광도계(UV mini-1240, Shimadzu, Kyoto, Japan) 405 nm에서 흡광도 를 측정한 후

p

p

p

p

모든 측정값은 3회 반복 측정하였으며 통계분석은 각 시 료군을 Statistical Analysis System(SAS) program(SAS Institute, 2005)을 사용하여 평균±표준편차를 산출하였고, 각 군의 평균 간 유의적 차이를 검증하기 위해 Duncan’s multiple range test를 실시하였다(

P

오디액 발효

오디액 발효에 사용된 균주는 β-glucosidase 활성이 뛰 어난 최종 선별 균주로서 동정 후 기탁된

Lactobacillus plantarum

g

g

오디액의 최적 발효 조건

오디액의 발효 조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석 법(response surface methodology, RSM)(Myers, 1971) 을 이용하여 모니터링 하였다. 발효 조건의 최적화를 위한 실험계획은 중심합성계획법(central composite experi- ment design)(Wanasundara와 Shahid, 1996)을 사용하였 고, 독립변수(X_i)로 고려되는 인자, 즉 발효시간(X₁), 오디액 의 농도(X₂) 및 온도(X₃)에 대한 실험범위를 설정하게 각각 의 5단계로 부호화하였으며(Table 1), 중심합성 계획에 따 라 Table 2와 같이 19구로 설정하여 발효실험을 하였다.

또한 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수로는 pH, 산도, 생균수, 총 안토시아닌, lactic acid, polydatin, resveratrol 함량 등을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다. 반응표 면 회귀분석을 위해서는 SAS program(SAS Institute, 2005)을 사용하였으며 변수들의 특성과 그에 상응하는 최 적 추출조건은 예측된 모델식을 바탕으로 Mathematica program(Wolfram Research, 2014)을 이용하여 4차원 반

Table 1. Experimental design of mulberry juice fermentation conditions

Fermentation conditions −2 −1 0 1 2

X1 Fermentation time (h)

X2 Mulberry juice concentration (°Brix) X3 Temperature (°C)

12 5 30

24 6 33

36 7 36

48 8 39

60 9 42

Table 2. Central composite design for the optimization of mul-

Exp.

No¹⁾

Fermentation conditions Fermentation

time (h)

Mulberry juice concentration (°Brix)

Temperature (°C) 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

48 (1) 48 (1) 48 (1) 48 (1) 24 (−1) 24 (−1) 24 (−1) 24 (−1) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 60 (2) 12 (−2) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0)

8 (1) 8 (1) 6 (−1) 6 (−1) 8 (1) 8 (1) 6 (−1) 6 (−1) 7 (0) 7 (0) 7 (0) 7 (0) 7 (0) 7 (0) 7 (0) 9 (2) 5 (−2) 7 (0) 7 (0)

39 (1) 33 (−1) 39 (1) 33 (−1) 39 (1) 33 (−1) 39 (1) 33 (−1) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 36 (0) 42 (2) 30 (−2)

1)The number of experimental conditions by central composite design.

응표면으로 나타내었다(Abell과 Braselton, 1992).

발효액의 pH, 산도, 및 생균수 측정

오디 유산발효액의 pH는 pH meter(AG 8603, Mettler- Torledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였으며 산도는 0.1 N-NaOH로 pH 8.3이 될 때까지 적정하고 이때 소비된 0.1 N-NaOH 양으로부터 lactic acid 계수를 곱하여 lactic acid 함량(%)으로 환산하여 나타내었다. 발효액의 유 산 생균수 측정은 발효액 1 mL를 취하여 멸균생리식염수로 10배 희석법으로 희석한 희석액 100 µL를 MRS agar에 도 말하고 37°C에서 24시간 배양 후, 형성된 colony 집락을 계수하여 colony forming unit(CFU/mL)으로 나타내었다.

총 안토시아닌 함량

총 안토시아닌 함량 측정은 발효액 시료 0.4 mL를 3.6 mL의 pH 1.0 potassium chloride buffer(0.025 M)와 pH 4.5 sodium acetate buffer(0.4 M)에 각각 혼합한 후 흡광 도계로 520 nm와 700 nm에서 흡광도를 측정한 다음 그 값을 아래의 식을 사용하여 함량값을 구하였다(Moyer 등,

2002).

Total anthocyanin content

(mg/100 mL) ＝ A×449.2×DF×10³ 26,900×1

A＝(OD 520 nm－OD 700 nm) of pH 1.0－(OD 520 nm－OD 700 nm) of pH 4.5

449.2＝1 mol molecular weight of cyanidin-3-glu- coside (C3G) (g/mol)

DF＝dilution factor

10³＝a conversion factor to mg of g 1＝cell length (cm)

26,900＝the molar absorptivity (A×mol^-3×cm^-1)

Lactic acid 함량 측정

Lactic acid 함량은 오디 발효액을 원심분리 한 후 0.45 µm membrane filter로 여과하여 HPLC(2685 Alliance HPLC, Waters, Milford, MA, USA)로 분석하였다. 컬럼은 Aminex^Ⓡ HPX-87H(7.8×300 mm, 9 µm, BIO-RAD Lab., Hercules, CA, USA)를 사용하여 이동상으로 5 mM sulfu- ric acid를 유속 0.6 mL/min의 조건으로 하여 Photodiode array(PDA) 214 nm에서 분석하였다.

Polydatin 및 resveratrol 함량 측정

Polydatin 및 resveratrol 함량은 원심분리 한 오디 발효 액을 0.45 µm membrane filter로 여과하여 HPLC(Waters) 로 분석하였다. Column은 X-bridge^Ⓡ C18 column(150×

4.6 mm, 3.5 µm, Waters)을 사용하였으며, 이동상으로는 water(A)와 acetonitrile(B)을 사용하였다. 이동상의 비율 (A:B)은 90:10(18 min)에서 15:85(19 min), 90:10(20 min), 90:10(25 min)으로 순차적으로 변화시켜 측정하였고, 유속은 0.8 mL/min으로 PDA 308 nm에서 25분간 측정하 였다.

최적 발효 조건의 예측 및 실증 시험

모든 반응 변수는 회귀분석(regression analysis)과 분산 분석(ANOVA)을 수행하였고, 이로부터 얻은 이차 회귀식을 통하여 반응모델의 적합성을 검증하였다. 오디 유산발효의 최적 조건 예측은 발효액의 특성 및 유효성분에 대한 반응표 면을 superimposing 했을 때 중복되는 부분의 범위에서 최 적 조건을 설정하였고, 예측된 범위에서 임의의 중심점을 최적 조건으로 예측한 후 각 희귀식에 대입하여 예측값을 설정하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여

Fig. 1. Photos of black complex on esculin agar media for screen

Table 3. The length of black complex on the esculin agar plate and β-glucosidase activity of the isolated lactic acid bacteria strains

(mm)

β-Glucosidase activity (U/mL)

0 h 24 h 48 h

L-1 L-2 L-4 L-5 L-6 L-8 L-10 L-11 L-12 L-13 L-14 L-15 L-16 L-17 L-18 L-19

24.63±0.06^bc ND 12.00±0.00^f 23.00±0.06^cd 24.00±0.26^bc 8.00±0.20^g

ND 29.00±0.10^a 26.00±0.10^b 17.00±0.10^e 15.00±0.10^e 9.33±0.15^g 16.33±0.00^e

ND 21.33±0.06^d 16.67±0.15^e

0.04±0.00^a 0.01±0.00^b 0.02±0.00^a 0.03±0.00^a 0.03±0.01^a 0.01±0.00^b 0.01±0.00^b 0.03±0.01^a 0.02±0.00^a 0.01±0.00^b 0.01±0.00^b 0.01±0.00^b 0.01±0.00^b 0.01±0.00^b 0.02±0.00^a 0.01±0.00^b

9.83±0.03^a 0.94±0.00^g 0.08±0.00ⁿ 1.97±0.00^f 0.32±0.01ⁱ 0.22±0.00^k 0.15±0.00^m 0.55±0.00^h 0.21±0.01^k 0.25±0.00^j 0.19±0.01^l 4.26±0.00^e 5.85±0.01^c 5.34±0.00^d 0.16±0.00^m 6.35±0.00^b

2.30±0.02^a 0.29±0.00^e 0.10±0.01^g 0.56±0.01^e 0.18±0.02^f 0.69±0.01^d 0.12±0.00^g 0.21±0.01^f 0.32±0.02^e 0.28±0.02^e 0.14±0.01^g 1.48±0.01^b 0.99±0.02^c 0.91±0.02^c 0.11±0.00^g 0.85±0.02^c Values are mean±SD. Means with different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

회귀식에 대입한 후 그 예측된 값들에 대하여 동일조건에서 실제 실험을 통하여 얻은 실험치를 비교하고 SAS pro- gram(SAS Institute, 2005)의 F-검증과

t

P

결과 및 고찰

유산균 분리와 β-glucosidase 활성 균주 선발

유산균의 분리를 위하여 가정용 김치 수십 종을 수집하여 생리식염수에 희석하여 MRS 고체배지에서 도말, 배양한 결 과 전형적인 집락을 나타낸 수십 종의 유산균을 순수 분리하 였다. Esculin agar법은 미생물이 분비하는 β-glucosidase 에 의해 esculin이 glucose와 esculetin으로 분리되며, 유리 된 esculetin은 배지 내 ferric ammonium citrate와 반응하 여 colony 주위에 black complex를 형성하게 된다(Shim 등, 2014). Esculin 배지에서 black complex의 생성 여부에 따라 1차 선발한 균주는 Fig. 1과 같다. 총 16개의 균주 중에 서 13개의 균주는 colony 주변에 black complex를 형성하 는 것을 확인할 수 있었으며, 이들의 black complex의 지름 을 측정한 결과(Table 3) L-11 균주가 지름 29.00 mm로 가장 크게 나타났고 이외에도 20 mm 이상은 L-12, L-1, L-6, L-5 및 L-18의 순으로 나타났다.

β-Glucosidase 활성능 측정

분리된 16개 유산균의 β-glucosidase 활성능을 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. 24시간 배양 시 L-1, L-19, L-16, L-17 및 L-15의 순으로 β-glucosidase 활성이 높 게 나타났으며, 48시간 배양 시 L-1, L-15, L-16, L-17 및 L-19의 순으로 활성이 높게 나타났으며, 배양시간별로 보았을 때 24시간 배양을 할 경우 β-glucosidase 활성이

높은 것으로 나타났다. Esculin 배지에서 black complex가 나타나지 않은 L-17 균주는 오히려 β-glucosidase 활성이 나타나 상반되는 결과가 나타났다. 또한, esculin 배지에서 black complex 길이가 15 mm 이상인 균주가 β-glucosi- dase 활성 또한 다른 균주들 비해 높게 나타났으며, 최종적 으로 L-1 균주가 배양 24시간에서 β-glucosidase 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 L-1 균주를 오디의 유 산발효를 위한 최적 균주로 선정하여 본 균주를 동정한 결 과,

Lactobacillus plantarum

Lactobacillus

Table 4. Experimental data on pH, acidity, and viable cell count

Exp.

No.¹⁾

Experimental data pH Acidity

(%) Viable cell count (log CFU/mL) 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

3.72±0.01 3.68±0.02 3.61±0.01 3.58±0.01 3.84±0.02 3.81±0.00 3.74±0.01 3.75±0.01 3.69±0.00 3.68±0.00 3.69±0.01 3.69±0.00 3.68±0.01 3.60±0.00 4.05±0.02 3.78±0.01 3.59±0.00 3.78±0.02 3.70±0.00

1.40±0.03 1.46±0.01 1.26±0.01 1.30±0.03 1.12±0.01 1.15±0.02 1.00±0.00 0.99±0.01 1.21±0.01 1.21±0.02 1.20±0.02 1.19±0.00 1.21±0.01 1.40±0.01 0.77±0.01 1.34±0.03 1.03±0.00 1.09±0.01 1.20±0.02

13.72±0.07 13.67±0.02 13.92±0.06 13.92±0.04 12.59±0.07 12.61±0.06 13.64±0.02 13.79±0.03 12.64±0.04 12.63±0.06 12.69±0.04 12.64±0.05 12.65±0.04 14.31±0.04 11.02±0.07 13.41±0.05 14.14±0.07 12.32±0.07 12.71±0.05 Control²⁾ 4.78±0.05 0.40±0.02 0 Values are mean±SD.

1)The number of experimental condition by central composite design.

2)Control was the mulberry juice of 7°Brix, which was not fermented.

Table 5. Polynomial equations calculated by RSM program for pH, acidity, and viable cell count of mulberry ferments

Response Second order polynomials R² Significance

pH Y＝6.348108－0.025283X1－0.041672X2－0.122652X3＋0.000128X12＋0.000521X1X2－

0.000372X22＋0.000174X1X3＋0.002083X2X3＋0.004186X32 0.9925 <0.0001 Acidity Y＝－2.379493＋0.034322X1＋0.176419X2＋0.111227X3－0.000183X12＋0.000208X1X2

－0.001351X22－0.000278X1X3－0.002500X2X3－0.001261X32 0.9714 <0.0001 Viable cell

count

Y＝44.751757－0.143178X1－6.012331X2－0.275439X3＋0.000338X12＋0.016458X1X2＋

0.328649X22＋0.001458X1X3＋0.015833X2X3＋0.001239X32 0.8069 0.0223

Table 6. Regression analysis for pH, acidity, and viable cell count of mulberry ferments

Response F-Ratio

Fermentation time (h) Mulberry juice concentration (°Brix) Temperature (°C) pH

Acidity

Viable cell count

205.98^***

60.71^***

5.75^**

75.89^***

14.34^***

3.75^**

18.60^***

1.83 0.12

**Significant at 5% level; ^***significant at 1% level.

Fig. 2. Response surface for pH in mulberry ferments at constant

plantarum

오디액의 유산발효 조건에 따른 발효 특성

분리 유산균

Lactobacillus plantarum

용하여 오디액의 최적 유산발효 조건을 설정하기 위해 발효 시간, 오디액 농도 및 발효온도를 독립변수로 하여 중심합성 계획에 의해 설계된 19구의 발효 조건에서 얻어진 발효액의 특성값은 Table 4와 같다. 각각의 결과를 이용하여 반응표 면분석을 실시하고, pH, 산도 및 생균수에 대한 회귀식을 얻었다(Table 5).

발효 전 오디액(7°Brix)의 pH는 4.78이었고 유산발효 조 건에 따라 발효 후 pH값이 3.58~4.05의 범위로 나타났다 (Table 4). 이를 바탕으로 한 발효액 pH의 회귀식을 구하였 으며 pH에 대한 회귀식의 R²값은 0.9925로 확인되었다 (Table 5). pH에 대한 유산발효 조건의 영향은 발효시간, 오디액의 농도 및 발효온도 세 조건 모두에 영향을 받는 것 으로 나타났다(Table 6). 한편 lack of fit(적합결여검정) 값 은 model의 적합도를 검정하는 통계량으로

P

Table 7. Analysis of variance for response of dependent variables on pH, acidity, and viable cell count of mulberry ferments

P-value

pH

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

0.139655 0.127569 0.011149 0.000938 0.001061 0.000941 0.00012

0.016 0.043 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000

131.63 360.71 31.52 2.65

－ 6.27

－

<0.0001

<0.0001

<0.0001 0.1123

－ 0.0498

－

Total 0.281433 － － －

Acidity

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

0.482604 0.463250 0.018054 0.0013 0.014207 0.014127 0.00008

0.054 0.154 0.006 0.000 0.002 0.003 0.000

33.97 97.82 3.81 0.27

－ 141.27

－

<0.0001

<0.0001 0.0516 0.8424 － 0.0001

－

Total 0.993622 － － －

Viable cell count

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

9.626929 6.564675 2.710104 0.35215 2.304282 2.302082 0.0022

1.070 2.188 0.903 0.117 0.256 0.460 0.001

4.18 8.55 3.53 0.46

－ 837.12

－

0.0223 0.0053 0.0617 0.7180 －

<0.0001 －

Total 23.86242 － － －

Table 8. Predicted levels of optimum fermentation conditions for the maximum responses by ridge analysis on pH, acidity, and

Response Predicted response

Morphology Time (h) Mulberry juice conc. (°Brix) Temp. (°C) Result

pH Min

Max

50.46 12.77

5.42 7.48

35.35 36.42

3.53

3.92 Saddle Acidity (%) Min

Max

12.92 52.96

6.45 8.31

35.94 34.37

0.79

1.50 Saddle Viable cell count

(log CFU/mL)

Min Max

13.77 39.38

7.62 5.03

37.28 35.40

11.54

14.62 Saddle 보다 작을 때 model의 적합성에 문제가 있으며, 이보다 클

때 model이 적합하다고 판단하는 통계값이다(SAS Institute, 2005). pH의 model에 대한 lack of fit의

P

Lactobacillus plan-

tarum

Leuconostoc mesenteroides

본 실험의 발효 전 오디액의 산도는 0.40%였고 발효 조건 에 따라 발효 후 산도는 0.77~1.46%의 범위로 나타났으며 (Table 4), 이를 바탕으로 한 산도의 회귀식은 Table 5와 같다. 발효 조건에 따른 산도에 대한 회귀식의 R²값은 0.9714

Fig. 3. Response surface for acidity in mulberry ferments at con-

Fig. 4. Response surface for viable cell count in mulberry fer-

mL) according to fermentation time, mulberry concentration, and temperature.

로 1% 이내의 높은 신뢰도를 보였다. 산도에 대한 발효 조건 에 대한 영향에서 발효시간과 오디액의 농도에 영향을 크게 받는 것으로 나타났으나, 설정된 범위 내에서 발효온도에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다(Table 6). 산도 값의 model에 대한 lack of fit의

P

°Brix의 오디 농축액을 5종 유산균으로 24시간 발효한 결과 초기 산도 0.47~0.51%에서 30°C, 24시간 발효 후 0.93~

1.31%로 증가한다고 보고하여 본 실험의 연구 결과와 유사 하였다. 또한, Lee와 Hong(2016)의 연구에서 발효 전 오디 파쇄액의 산도는 0.05%였고

Lactobacillus plantarum

에서

Leu

mesenteroides

유산발효 조건에 따른 유산균의 생균수를 측정한 결과, 발효 조건에 따라 11.02~14.31 log CFU/mL의 범위로 측 정되었다(Table 4). 발효 조건에 따른 생균수의 회귀식은 Table 5와 같으며, 이 모델 회귀식의 R²값은 0.8069로 회귀 방정식에 대한 5% 이내에서 유의성이 있는 것으로 나타났 다. 유산균의 생균수에 대한 유산발효 조건에 대한 영향은 발효시간 및 오디액의 농도에 영향을 받는 것으로 나타났으

나 발효온도에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다(Table 6).

ANOVA 분석을 통한 lack of fit의

P

4와 같으며 발효시간이 길수록 생균수가 높은 것으로 나타 났다. 유산발효 조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분 석 결과 정상점은 안장점으로 나타났으며 능선분석을 통한 최적점을 산출한 결과, 생균수의 최대값은 14.62 log CFU/

mL였고 이때의 유산발효 조건은 발효시간이 39.38 h, 오디 액 농도 5.03°Brix, 발효온도는 35.40°C로 나타났다(Table 8). 한편 Ryu 등(2018)은 10°Brix의 오디 농축액을 5종 유 산균으로 24시간 발효한 결과 균종에 따라 11.14~13.61 log CFU/mL의 범위로 나타났다고 하여 본 연구의 유산균 수 결과와 유사한 결과를 보고하였다. 한편 Lee와 Hong (2016)은 오디 파쇄액을

Lactobacillus plantarum

mL로 나타났다고 보고하였고, Chae 등(2017)은 오디를

Leu

mesenteroides

오디액의 유산발효 조건에 따른 유효성분 함량

오디액의 최적 유산발효 조건을 설정하기 위해 발효시간, 오디액의 농도 및 발효온도를 독립변수로 하여 중심합성계 획에 의해 설계된 19구의 발효 조건에서 얻어진 발효액의 유효성분 함량을 측정하였다. 유산발효 조건에 따른 총 안토 시아닌 함량을 측정한 결과 발효구의 총 안토시아닌 함량은

Table 9. Experimental data on total anthocyanin, lactic acid, polydatin, and resveratrol content of mulberry ferments under different

Exp. No.¹⁾

Experimental data Total anthocyanin contents

(C3G mg/100 mL) Lactic acid content

(mg/100 mL) Polydatin content

(mg/100 mL) Resveratrol content (mg/100 mL) 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

72.61±0.97 80.05±0.80 61.63±0.63 60.98±0.67 74.02±1.11 87.22±0.58 60.17±0.62 47.92±0.72 70.53±0.62 66.33±0.94 68.95±0.88 77.05±1.83 64.63±0.89 65.80±0.64 74.55±0.38 101.17±8.74 51.92±0.65 62.03±0.72 73.76±0.55

806.32±0.22 867.35±0.25 1,324.37±0.37 710.73±0.62 695.00±0.12 674.71±1.58 687.15±1.15 626.51±0.32 1,354.85±0.75 1,534.56±1.35 1,296.76±1.76 1,409.22±1.01 1,235.89±0.68 1,308.53±0.54 423.55±1.82 834.45±1.10 611.07±0.83 1,392.79±2.53 833.38±0.38

7.94±0.84 7.21±0.10 6.71±0.20 6.98±0.07 9.82±0.28 7.59±0.44 5.40±0.25 4.91±0.07 5.20±0.21 6.18±0.16 6.77±0.24 5.78±0.23 5.39±0.29 5.92±0.08 5.88±0.34 10.02±0.13 3.82±0.05 6.29±0.29 5.24±0.24

0.40±0.05 0.56±0.08 0.26±0.05 0.24±0.04 0.40±0.07 0.33±0.05 0.32±0.02 0.27±0.03 0.32±0.03 0.33±0.03 0.32±0.02 0.35±0.03 0.32±0.02 0.34±0.05 0.32±0.06 0.65±0.05 0.11±0.03 0.31±0.05 0.32±0.04

Control²⁾ 52.28±0.63 0 8.29±0.32 0.09±0.01

Values are mean±SD.

1)The number of experimental condition by central composite design.

2)Control was the mulberry juice of 7°Brix, which was not fermented.

Table 10. Polynomial equations calculated by RSM program for total anthocyanin, lactic acid, polydatin and resveratrol content

Response Second order polynomials R² Significance

Total anthocyanin contents

Y＝－441.753042＋2.370434X1＋48.980234X2＋14.970556X3－0.000464531X12

－0.240613X1X2＋1.562061X22－0.019729X1X3－1.359583X2X3

－0.071232X32 0.9132 0.0009

Lactic acid content

Y＝－28756＋57.407095X1＋3737.651611X2＋833.857017X3－0.991192X12

－4.348878X1X2－178.551950X22＋1.637779X1X3＋29.792454X2X3

－8.996699X32 0.8202 0.0169

Polydatin content Y＝21.650473＋0.656672X1－5.468176X2－0.829910X3＋0.000602X12－

0.058750X1X2＋0.341655X22－0.007847X1X3＋0.114167X2X3＋0.005878X32 0.8491 0.0084 Resveratrol content Y＝－2.093750＋0.009479X1＋0.032500X2＋0.098333X3＋0.000008681X12

＋0.003333X1X2＋0.013750X22－0.000903X1X3－0.006667X2X3－0.000278X32 0.9082 0.0011

Table 11. Regression analysis of total anthocyanin, lactic acid, polydatin and resveratrol content of mulberry

Response F-Ratio

Fermentation time (h) Mulberry juice concentration (°Brix) Temperature (°C) Total anthocyanin content

Lactic acid content Polydatin content Resveratrol content

0.77 5.85^***

1.64 2.49

22.69^***

4.82^**

11.82^***

21.02^***

2.09 2.51 1.14 1.27

**Significant at 5% level; ^***significant at 1% level.

47.92~101.17 mg/100 mL의 범위로 나타났다(Table 9).

이는 발효 전 오디액 7°Brix의 총 안토시아닌의 함량이 52.28 mg/100 mL에서 동일농도인 9~15번 시험구와 18 및 19번 의 발효시험구의 총 안토시아닌의 함량이 62.03~77.05 mg/

100 mL의 결과값을 보여 발효에 의하여 총 안토시아닌의 함량은 대체로 증가하는 것으로 보인다. 발효 조건에 따른 값을 이용한 총 안토시아닌 함량의 회귀식을 구한 결과는 Table 10과 같으며, 이 모델 회귀식의 R²값은 0.9132로 회

Table 12. Analysis of variance for response of dependent variables on total anthocyanin, lactic acid, polydatin, and resveratrol

Responses Sources Sum of squares Means squares F-value

P-value

Total anthocyanin

content

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

242.27 211.32 8.42 21.15 23.17 13.97 9.25

26.927 71.037 2.850 7.035 2.557 2.768 2.305

10.53 27.74 1.09 2.75

− 1.21

−

0.0009

<0.0001 0.4022 0.1049

− 0.4397^*

−

Total 53.16 − − −

Lactic acid content

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

1,791,266 681,551 996,211 113,504 392,685 340,559 52,125

199,029.6 227,183.7 332,070.3 37,834.67 43,632 68,112 13,031

4.56 5.21 7.61 0.87

− 5.23

−

0.0169 0.0234 0.0077 0.4929

− 0.0671^*

−

Total 4,367,901 − − −

Polydatin content

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

37.641 29.29

2.8 5.55 6.69 5.097 1.593

4.182 9.763 0.933 1.850 0.743 1.019 0.398

5.63 13.13 1.25 2.49

− 2.56

−

0.0084 0.0012 0.3468 0.1265

− 0.1918^*

−

Total 88.661 − − −

Resveratrol content

Model Linear Quadratic Cross-product Residual Lack of fit Pure error

0.2084 0.1785 0.00545 0.02445 0.0211 0.0204 0.0007

0.023 0.060 0.002 0.008 0.002 0.004 0.000

9.89 25.41 0.78 3.48

− 23.99

−

0.0011

<0.0001 0.5367 0.0636

− 0.0044

−

Total 0.459 − − −

*

P>0.05 of lack of fit indicate that response surface models was adequate at 95% confidence level.

Table 13. Predicted levels of optimum fermentation conditions for the maximum responses by ridge analysis on total anthocyanin,

Response

Predicted response

Morphology Response Time

(h)

Mulberry juice conc. (°Brix)

Temp.

(°C) Result Total anthocyanin content

(C3G mg/100 mL)

Min Max

28.09 30.47

5.35 8.81

33.27 33.87

46.07

103.32 Saddle Lactic acid content

(mg/100 mL)

Min Max

20.10 49.32

5.60 6.44

34.36 40.70

271.38

1,462.48 Maximum Polydatin content

(mg/100 mL)

Min Max

20.40 46.41

5.49 8.73

35.36 37.92

3.51

11.05 Saddle Resveratrol content

(mg/100 mL)

Min Max

47.95 46.41

5.27 8.72

36.01 34.38

0.13

0.66 Saddle 귀방정식에 대한 1% 이내에서 유의성이 있는 것으로 나타

났다. 총 안토시아닌 함량에 대한 유산발효 조건에 대한 영 향은 오디액의 농도에서만 영향을 받는 것으로 나타났으며 (Table 11), ANOVA 분석을 통한 lack of fit의

P

0.4397로 분석되어 반응표면 모형에 대한 적합성이 인정되 었다(Table 12). 4차원 반응표면을 통한 총 안토시아닌 함 량 변화는 Fig. 5와 같다. 유산발효 조건에 따라 반응표면모 델로 예측된 정상점은 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산

Fig. 5. Response surface for total anthocyanin content (TAC)

Fig. 6. Response surface for lactic acid content in mulberry fer-

100 mL) according to fermentation time, mulberry concen- tration, and temperature.

출한 결과 총 안토시아닌 함량의 최대값은 103.32 mg/100 g이었다. 이때의 유산발효 조건은 발효시간이 30.47 h, 오 디액의 농도 8.81°Brix, 발효온도는 33.87°C로 나타났다 (Table 13). 한편 Lee와 Hong(2016)은 오디 파쇄액을

Lac- tobacillus plantarum

Brix의 오디 농축액을 5종 유산균으로 24시간 발효한 결과 발효 전보다 총 안토시아닌 함량이 감소하는 결과가 나타났 다고 보고하였고 균주와 발효원료의 특성의 차이에 의한 발 효 전과 발효 후의 증감이 다르게 나타난다고 고찰하였다.

Chae 등(2017)은 오디를

Leu. mesenteroides

°C, 24시간 발효 후의 총 안토시아닌 함량값이 발효 전과 유의적인 차이가 나타나지 않아, 오디는 실험균주에 의한 젖산발효가 기능성분의 증가에 영향을 미치지 않거나 미비 하다고 하였고, 복분자 및 아로니아는

Leu. mesenteroides

유산발효 조건에 따른 오디발효액의 lactic acid 함량은 423.55~1,534.56 mg/100 mL의 범위로 나타났으며(Ta- ble 9), 이를 바탕으로 한 lactic acid 함량의 회귀식은 Table

10과 같고 R²값은 0.8202로 5% 이내에서 유의적이었다.

유산발효 조건에 대한 영향은 Table 11에서와 같이 발효시 간과 오디액의 농도에서 영향을 받는 것으로 나타났다.

Lactic acid 함량에 대한 lack of fit의

P

Ryu 등(2018)은 10°Brix의 오디 농축액을 5종 유산균으로 24시간 발효한 결과 발효 전에는 젖산이 검출되지 않았으나 모든 균주의 발효액에서 증가하는 경향을 보였고 발효균주 별로 5.24~10.06 mg/mL로 젖산의 함량 차이가 큰 것으로 보고하였으나 본 연구 발효액의 젖산 함량값보다 다소 낮게 나타났는데, 이는 발효균주와 발효 조건의 차이의 결과인 것으로 보인다. 한편 Sung와 Choi의 연구(2014)에서 대조 군 요구르트의 lactic acid 함량이 오디 분말 첨가군 요구르 트보다 낮았으며, 오디 분말을 3% 첨가한 요구르트의 발효 중 lactic acid 함량은 0.81~13.87 mg/g의 값으로 보고하 였다. Kim 등(2013)의 연구에서 오디막걸리의 lactic acid 는 발효 1일째에 0.174 mg/mL였으나, 발효 7일째에는 0.440 mg/mL로 감소한다고 보고하였다.

유산발효 조건에 따른 오디 발효액의 polydatin 함량은 3.82~10.02 mg/100 mL의 범위였고 발효 전 오디액(7°Brix) 의 polydatin의 함량은 8.29 mg/100 mL였다(Table 9). 발 효 전 시험구와 동일 농도 오디액의 발효시험구인 9~15번,

Fig. 7. Response surface for polydatin content in mulberry fer-

Fig. 8. Response surface for resveratrol content in mulberry fer-

100 mL) according to fermentation time, mulberry concentration, and temperature.

18과 19번 시험구의 발효액의 polydatin 함량은 5.20~

6.77 mg/100 mL로 발효 전보다 감소한 결과를 볼 수 있다.

Polydatin 함량에 대한 회귀식의 R²값은 0.8491로 높은 신 뢰도를 보였으며(Table 10), 발효 조건에 대한 영향에서 polydatin 함량의 경우 오디액의 농도에서만 영향을 받는 것으로 나타났다(Table 11). Model에 대한 lack of fit의

P

°C로 나타났다(Table 13). 한편 본 발효에 의해 polydatin 의 감소는 본 연구의 발효균주가 생성하는 β-glucosidase 활성에 의한 생물전환(bioconversion 또는 biotransfor- mation)의 결과라 생각된다(Mei 등, 2015). Kim 등(2010) 은 오디 품종별 polydatin 함량은 대성뽕 14.02 mg%, 용뽕 13.75 mg%, 과상 1호 12.22 mg%, 과상2호 9.59 mg%로 각각 나타났으며, 나머지 품종은 검출되지 않았다고 보고하 였다. Kim 등(2008a)은 뽕잎과 오디의 polydatin 함량이 각각 39.95 mg/100 g, 133.66 mg/100 g을 함유한다고 보 고하여 두 연구에서의 polydatin의 함량은 본 연구의 원료값 보다 함량이 높게 나타났다. 이는 사용된 원료의 품종, 원료 의 숙기 상태 및 시료 처리방법에 따른 차이라 생각된다.

유산발효 조건에 따른 오디 발효액의 resveratrol 함량을 측정한 결과 0.11~0.65 mg/100 mL의 범위로 나타났다

(Table 9). 발효 전 오디액(7°Brix)의 resveratrol 함량은 0.09 mg/100 mL였고 발효 전과 동일 농도 오디의 시험액 인 9~15번, 18과 19번 발효액의 resveratrol 함량은 0.31~

0.35 mg/100 mL로 발효 전보다 resveratrol 함량값이 3.5 배 이상 증가한 결과를 볼 수 있다. 유산발효 조건에 따른 발효액의 resveratrol 함량값의 회귀식은 Table 10과 같으 며, 이때 회귀식의 R²값은 0.9082로 1% 이내에서 유의적이 었다. 유산발효 조건에 대한 영향은 오디액의 농도에서만 영향을 받는 것으로 나타났다(Table 11). 또한 ANOVA 분 석을 통한 lack of fit의

P