토끼의 뇌혈관 연축 모델에서 혈관확장제 및 혈관수축제에 대한 기저동맥의 감수성 변화
*서울대학교 의과대학 신경외과학교실
백 선 하·한 대 희
= Abstract =
Changes in Vascular Responses of Basilar Artery to Vasodilators and Vasoconstrictors in Experimental Vasospasm Model Rabbits
Sun Ha Paek, M.D., Dae Hee Han, M.D.
Department of Neurosurgery Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
bjective：This experiment is aimed at clarifying the characteristics of spasmodic basilar arteries in the rabbits of subarachnoid hemorrhage(SAH) with observation of vascular response to nitric oxide(NO) and endothelin-1.
Material and Methods：Seventy-nine New Zealand white rabbits were divided into 4 groups：control(n＝17), sham operation(n＝13), postictal-2-day(n＝25), and postictal-7-day group(n＝24). Rabbits in the postictal-2- day group and postictal-7-day group underwent transfemoral vertebral angiography 2 days and 7 days after SAH respectively. A vascular ring of spasmodic basilar artery was harvested and suspended in organ chamber(37℃) to observe isometric tension changes in response to NO and endothelin-1 under both high(95% O2/5% CO2) and low(95% N2/5% CO2) O2 tension. To investigate the vascular response to NO, acetylcholine from 10-7M to 3×10-4M concentration was applied to basilar artery ring precontracted with histamine 10-6-10-5M in the organ chamber. The vascular response to endothelin-1 was observed by applying endothelin-1 from 10-11M to 3×10-8M concentration into organ chamber.
Results：Seven of 15 live rabbits which underwent angiography 2 days after SAH, were confirmed to develop vas- ospasm(64.3±11.2%) whereas seven of 13 live rabbits which underwent angiography 7 days after SAH, were confirmed to develop vasospasm(64.9±10.9%). In all groups, hypoxia significantly reduced the vascular relaxation of basilar arteries to NO. However, hypoxia made no influence on the vascular contraction of basilar arteries to endothelin-1 in all groups. In vascular relaxation of basilar arteries to NO under high O2 tension between groups, the maximum relaxation of basilar arteries in the postictal-7-day group was significantly reduced compared to the pos- tictal-2-day group. In vascular contraction of basilar arteries to endothelin-1 under high O2 tension between groups, the maximum contraction of basilar arteries in the postictal-7-day group was significantly reduced compared to the postictal-2-day group.
Conclusions：This experiment suggests that the characteristics of vascular response to NO and endothelin-1 in the spasmodic basilar arteries of rabbits observed 2 days after SAH is different from those observed 7 days after SAH.
KEY WORDS：Rabbit basilar artery・Cerebral vasospasm・Nitric oxide・Endothelin-1・High O2 tension・Low O2
tension.
OOOO
*본 논문의 요지는 1998년 대한신경외과학회 추계학술대회에서 발표되었음.
*본 논문은 일부 서울대학교병원 연구비의 지원으로 이루어 졌음.
서 론
뇌혈관의 평활근 수축 및 이완에 있어 혈관내피세포에서 유리되는 여러 가지 조절 인자들은 뇌혈류의 자동조절(au- toregulation)에 매우 중요한 역할을 한다1)4)6)16). 혈관내피 세포에서 분비되어 혈관평활근의 수축성을 조절하는 대표적 인 내피세포 의존성 혈관활동 물질(endothelium-depend- ent vasoactive substances)로는 내피세포 의존성 이완인 자(endothelium-dependent relaxation factor, EDRF)인 nitric oxide(NO)와 내피세포 의존성 수축인자(endothe- lium-dependent contraction factor, EDCF)인 endothelin 등이 있다13)20). 정상 상태에서는 혈관 평활근에 대한 수축 및 이완 인자의 균형이 조직에 필요한 혈류량을 적절히 조 절하다가 지주막하 출혈로 인하여 이러한 생리적 균형상태 가 파괴되고 평활근에 대한 수축작용이 우세할 경우 뇌혈관 연축이 유발된다고 볼 수 있다. 그러나 지주막하 출혈후 발 생하는 뇌혈관 연축에 관한 현재까지의 연구들은 혈관 평활 근의 수축과 이완이라는 양쪽 측면에서의 접근이 되지 못하 고 일측면에서만의 고찰이 대부분이었다.
본 연구는 뇌혈관 연축의 발생기전을 규명하기 위한 연구 의 한 단계로서 이미 성격이 규명된 토끼의 실험적 뇌혈관 연축 모델을 이용하여 지주막하 출혈후 뇌혈관 연축이 유발 된 토끼와 정상인 토끼의 기저동맥에서 NO와 endothelin- 1에 대한 혈관의 이완 및 수축 반응의 변화를 고산소 분압 과 저산소 분압하에서 각각 관찰하여 연축이 유발된 기저동 맥의 기능적 변화 양상을 살펴 보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 실험 동물
실험동물은 체중 2～3kg 내외의 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand white rabbit)를 암수 구별없이 사용하였다. 토끼 를 비수술군(대조군), 가장수술군, 및 지주막하 출혈군(실험 군)으로 나누었다. 실험군은 다시 지주막하 출혈 2일군과 7 일군으로 나누어 지주막하 출혈전과 수술후 2일, 7일째에 각각 기저동맥의 뇌혈관 조영술을 시행하였다. 실험동물은 모두 79마리를 사용하였다. 17마리는 비수술군으로, 13마 리는 가장수술군으로, 49마리는 수술군 제작에 사용하였다.
이들중 시술 전후로 사망하였거나 혈관의 수축-이완반응이 분석에 부적절하였거나 지주막하 출혈후 뇌혈관 연축이 발 생되지 않았던 경우를 제외하면 분석대상에 포함된 실험동 물은 대조군 6마리, 가장수술군 6마리, 지주막하 출혈 2일
째군 7마리, 지주막하 출혈 7일째군 6마리였다.
지주막하 출혈 수술후 시행한 뇌혈관 조영술상 뇌혈관 연 축이 확인된 토끼를 pentothal을 이용하여 kg당 50mg의 용량으로 정맥내 주입하여 희생시킨 즉시 기저동맥을 적출 하여 4℃의 modified Krebs 용액에 넣어 실험 전까지 보관 하였다. 현미경하에서 modified Krebs 용액에 담근 기저동 맥을 박리하여 혈관 주위에 붙어 있는 지주막 등의 결체조직 을 깨끗이 제거한 후 약 2～3mm 길이로 잘라 혈관환(va- scular ring)을 만들었다.
토끼의 마취제 및 전처치제로 사용한 약제는 ketamine hy- drochloride와 acepromazine maleate이었고 뇌혈관 조영 촬영시 사용된 약제는 항응고제인 heparin sulfate와 혈관 조영제인 Ultravist였다.
적출된 토끼의 기저동맥은 modified Krebs 용액에 담가 서 실험하였다. Modified Krebs 용액의 조성은 물 100g중 NaCl 6.898g, KCl 0.350g, CaCl2 0.277g, MgSO4 0.296g, KH2PO4 0.163g, NaHCO3 2.100g, Glucose 2.000g, EDTA 0.0097g이다. 혈관의 수축 및 이완 실험 전후로 60 mM KCl 용액을 이용하여 혈관을 안정화하였다. 60mM KCl 용 액의 조성은 물 100g중 NaCl 3.664g, KCl 4.456g, CaCl2
0.277g, MgSO4 0.296g, KH2PO4 0.163g, NaHCO3 2.100g, Glucose 2.000g, EDTA 0.0097g이다.
혈관의 수축 및 이완반응을 관찰하기 위하여 사용된 약제 들은 acetylcholine chloride(Sigma), histamine acid ph- osphate(Sigma), 및 endothelin-1(Sigma) 등이었고 사용 한 기구는 수술용 현미경, 미세 수술기구, 항온기, 혈관 조영 기(Toshiba DRX-190D, Japan), blood gas analyzer, JP trading myographs model 400A(physiograph, McLab), film scanner, image analyzer 및 McIntoshi computer 등 이다.
2. 방 법
1) 지주막하 출혈 수술 및 가장 수술
아세프로마진(acepromazine maleate, 20mg/kg)으로 전 처치하고 케타민(ketamine hydrochloride, 50mg/kg)을 근육내 주사하여 마취시켰다. 호흡기를 사용하지 않고 스스 로 호흡하게 하고 혈압, 체온, 맥박 등을 감시하였다. 토끼 를 엎드린 자세로 하여 토끼의 경부를 굴전시킨 다음 두개 척추의 접합부위에서 중앙부위를 촉지하여 외측 후두돌기 (external occipital protuberance)를 확인한 뒤 주변부위 를 세발하였다. Betadine으로 소독한 뒤 소공을 씌우고 외 측 후두돌기에서 직하방으로 약 2.5cm 정도의 정중 피부절 개를 시행하였다. 후두골 중앙부위에 붙어 있는 근육을 박
리하여 환측추막(atlanto-occipital membrane)을 확인한 뒤 5cc-syringe의 바늘을 이용하여 대조를 개통하였다. 뇌 척수액이 유출되는 것을 확인한 뒤 토끼의 중앙이동맥에서 동맥혈을 1～2cc 정도 채혈하였다. 토끼의 활력징후를 감 시하면서 20G-medicut을 개통된 환측추막사이로 밀어 넣 고 채혈해 놓은 토끼의 nonheparinized arterial blood(0.5 cc/kg)를 대조내로 주입하였다. 가장 수술군은 대조에서 뇌 척수액을 뽑아낸 다음 토끼의 자가 동맥혈대신 생리식염수 (0.5cc/kg)를 대조내로 주입하였다.
2) 뇌혈관 조영술 및 동맥직경의 측정
아세프로마진(acepromazine maleate, 20mg/kg)으로 전 처치하고 케타민(ketamine hydrochloride, 50mg/kg)을 근육내 주사하여 마취시킨 후 호흡기를 사용하지 않고 스스 로 호흡하게 하였다. 혈압, 체온, 맥박 등을 감시하였다. 대 퇴동맥을 노출하여 대퇴동맥으로 혈관 조영 가데터를 밀어 넣어 쇄골하 동맥 기시부에 위치시킨 후, 2ml의 혈관조영제 (Ultravist)를 주입하여, 추골-기저동맥 조영술을 시행하였 다. 지주막하 출혈 수술을 시행하기 전에 혈관조영술을 시 행한후, 실험군에 따라 지주막하 출혈 수술후 2일과 7일째 에 각각 혈관조영술을 시행하였다. 출혈전후 혈관조영술 직 후에 활력징후를 감시하면서 동맥혈의 가스분압을 검사하였 다. 혈관 조영술 직후에 동맥혈의 가스분압을 검사하여 이 산화탄소의 분압이 35～45mmHg 사이에 있는 경우만을 실험결과에 포함시켰다.
동맥조영사진을 한꺼번에 모아 실험내용에 관계하지 않는 두사람의 방사선과 의사가 판독하도록 하였다. 기저동맥 및 추골동맥의 직경을 측정하기 위하여 토끼의 동맥 조영 사진 을 film scanner로 scanning한 뒤 image analyzer를 이용 하여 동맥의 직경을 측정하였다. 기저동맥의 원위부 끝에서 1mm 근위부, 중간부위, 척추기저동맥 접합부에서 1mm 원 위부, 세곳에서 직경을 각각 세 번씩 측정하여 각각의 평균 값을 구한 뒤 두 사람의 관찰결과를 다시 평균하여 평균 기 저동맥 직경을 구하였다. 이와 함께 추골동맥이 환추의 척 추동맥강을 빠져나오는 부위의 동맥직경을 같은 방법으로 평균 추골동맥 직경을 측정하였다. 이를 바탕으로 기저–추 골동맥 비례치(vertebro-basilar arterial ratio)를 계산하 였다. 기저-추골동맥 비례치는 환추의 추골동맥강의 추골 동맥 직경에 대한 평균 기저동맥의 백분율로 정의하였다.
뇌혈관 연축의 판단기준은 지주막하 출혈 수술전에 시행한 뇌동맥혈관조영상 관찰되는 기저-추골동맥 비례치보다 지 주막하 출혈 수술 후 시행한 뇌동맥혈관조영상 관찰되는 기 저-추골동맥 비례치가 30%이상 감소된 경우로 정하였다.
3) 고산소 분압 및 저산소 분압하에서의 기저동맥의 혈관 수축제 및 이완제에 대한 반응 관찰
현미경 시야에서 준비된 2～3mm 크기의 혈관환 내강으 로 2개의 텅스텐(직경 40μm)을 삽입하여 혈관의 장력을 측정할 수 있도록 organ chamber내에 고정시킨 후 force transducer를 통해 physiograph(JP trading myographs models 400A)로 연결시켜 등장성 장력(isometric tension) 의 변화를 기록하였다. Organ chamber내에는 control 용액 5ml를 채우고 95% 산소/5% 이산화탄소 혼합가스를 계속 공급하여 산소공급과 동시에 pH가 7.4 정도로 유지되게 하 였다. Organ chamber내의 온도가 항상 37℃가 되도록 하였 다. 혈관환을 여러 단계에 걸쳐 stretch시켜 0.4g의 전부하를 주고 약 30분간 기다린 후 1) NO의 이완 반응 및 2) endo- thelin-1의 수축 반응 실험을 시행하였다. 모든 혈관환은 실 험에 앞서 60mM KCl 용액으로 수축-control 용액으로 세 척하는 과정을 두 차례 반복하여 안정시켰다.
Organ chamber를 control 용액 5ml로 채우고 95% 산 소/5% 이산화탄소 혼합가스 대신 95% 질소/5% 이산화탄 소 혼합가스를 계속 공급하면서 pH가 7.4～7.5 정도로 유 지되게 하였다. 혈관환을 여러 단계에 걸쳐 stretch시켜 0.4g의 전부하를 주고 약 30분간 기다린 후 1) 내피세포 의존성 이완 반응 및 2) 혈관 수축 반응 실험을 시행하였다.
(1) 내피세포 의존성 이완 반응
적출된 혈관환의 내피세포 의존성 이완 반응을 살펴보기 위하여 10-6M～10-5M 농도의 histamine을 organ cham- ber내로 첨가하여 혈관환을 수축시키고 기초 수축 장력(in- itial contractile tension)을 측정한다. Histamine에 의하여 수축이 일어난 혈관환에 아세틸콜린(acetylcholine, 10-7～ 3×10-4M)을 첨가하여 아세틸콜린에 따른 농도–이완 반 응을 관찰하였다. 아세틸콜린에 의한 혈관 이완의 정도는 hi- stamine의 혈관 수축에 대한 백분율로 표시하였다(Fig. 3-A).
(2) 혈관 수축반응
내피세포 의존성 이완 반응을 측정한 후 혈관 수축 반응 을 관찰하기 위해 혈관환을 60mM KCl 용액(수축-control 용액)으로 수축하여 대조 수축 장력을 측정한 다음 organ chamber내로 endothelin-1(10-11～3×10-8M)을 첨가하 여 endothelin-1에 대한 농도–수축 반응을 관찰하였다.
Endothelin-1에 의한 혈관 수축의 정도는 60mM KCl의 혈관 수축에 대한 백분율로 표시하였다(Fig. 3-B).
4) 통계처리
각각의 농도-이완, 농도-수축 곡선으로부터 곡선하 면적
(area under the curve；임의의 단위로 표시), 최대 이완치 (maximum relaxation level), 최대 수축치(maximal con- traction level),；-logM), pD2(histamine 수축의 50% 이 완이 일어나는 아세틸콜린의 농도의 음의 log값 또는 60 mM KCl 수축치의 50% 수축을 일으키는 endothelin-1 농도의 음의 log 값) 등을 구하였다. 대조군과 수술군 사이 의 각 지표들을 비교하기 위하여 paired t-test 및 ANOVA test를 사용하고 모든 결과치는 평균±표준오차로 나타냈다.
통계적 유의성의 검정은 p값이 0.05 미만인 것으로 하였다.
통계 프로그램은 32bit IBM-PC/AT용 SPSS(Stastis- tical Package for the Social Science) 7.0을 이용하였다.
결 과
1. 지주막하 출혈 유발 전후의 뇌혈관 조영술상 관찰된 토 끼의 기저-추골동맥 비례치의 변화
총 79마리의 토끼중 지주막하 출혈 2일군은 모두 25마리 였는데 이중 10마리는 실험도중 사망하였다. 생존한 15마리 중 30%이상의 기저동맥의 연축을 보인 토끼는 모두 7마리였 고 기저동맥의 연축을 보이지 않았던 토끼는 모두 8마리였다 (Fig. 1). 뇌혈관 연축이 발생한 토끼의 시술전후 관찰되는 기저-추골동맥 비례치의 평균 변화는 64.3±11.2%였다.
총 79마리중 지주막하 출혈 7일군은 모두 24마리였는데 이 중 11마리는 실험도중 사망하였다. 생존한 13마리중 30%이 상의 기저동맥의 연축을 보인 토끼는 모두 7마리였고 기저 동맥의 연축을 보이지 않았던 토끼는 모두 6마리였다(Fig.
2). 뇌혈관 연축이 발생한 토끼의 시술전후 관찰되는 기 저-추골동맥 비례치의 평균 변화는 64.9±10.9%였다.
2. 각 실험군에서 관찰된 기저동맥의 수축 및 이완반응 기저동맥의 수축 및 이완반응을 관찰할 수 있었던 비수술 군의 토끼는 모두 6마리였다. NO에 대한 혈관 이완반응을 살펴보면 Table 1과 같다. 이를 그래프로 살펴보면 Fig. 4- A와 같은데 각 graph의 곡선하 면적이 고산소 분압에서 191±92.8, 저산소 분압에서 283±101을 보였고 최대 이 완치가 고산소 분압에서 92.4±7.87, 저산소 분압에서 102
±4.97을 보여 통계학적을 유의한 차이가 관찰되었다(p값：
0.047, 0.024) 즉, 비 수술군의 기저동맥의 NO에 대한 이 완 반응이 저산소 분압에서 현저히 감소되어 있는 것을 알 수 있다. Endothelin-1에 대한 혈관수축반응을 살펴보면 Table 2와 같으며 이를 그래프로 살펴보면 Fig. 4-B와 같 다. 각 그래프상 고산소 분압과 저산소 분압사이의 통계학 적 유의성을 갖는 차이는 관찰할 수 없었다. 즉, 비수술군의
기저동맥의 endothelin-1에 대한 혈관 수축 반응은 저산소 분압에서 변화되지 않는 것을 알 수 있다.
기저동맥의 혈관의 수축 및 이완반응을 관찰할 수 있었던 가장 수술군의 토끼는 모두 6마리였다. NO에 대한 혈관 이 완반응을 살펴보면 Table 1과 같다. 이중 곡선하 면적이 고 산소 분압에서 197±69.5, 저산소 분압에서 252±60.5를 보여 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p값：0.001).
pD2는 고산소 분압에서 6.59±0.60, 저산소 분압에서 6.20
±0.37을 보여 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p 값：0.02). Endothelin-1에 대한 혈관수축반응을 살펴보면 Table 2와 같으며 고산소분압과 저산소 분압사이에서 통계 적으로 유의한 차이는 관찰할 수 없었다.
Fig. 1. Rabbit angiographic findings 2 days after subarachnoid hemorrhage. Upper panel shows no vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Lower panel shows severe vasospasm after subarachnoid hemorrhage.
기저동맥의 수축 및 이완반응을 관찰할 수 있었던 지주 막하 출혈 2일군 토끼는 모두 7마리였다. NO에 대한 혈관 이완반응을 살펴보면 Table 1과 같다. 이중 곡선하 면적이 고산소 분압에서 146±84.2, 저산소 분압에서 217±104 를 보여 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었고(p값 ： 0.003) 최대 이완치가 고산소 분압에서 77.6±16.4, 저산 소 분압에서 93.3±7.58을 보여 통계학적으로 유의한 차이 가 관찰되었다(p값：0.008). Endothelin-1에 대한 혈관 수축반응을 살펴보면 Table 2과 같으며 고산소 분압과 저 산소 분압사이의 통계학적 유의성을 갖는 차이는 관찰할 수 없었다.
기저동맥의 수축 및 이완반응을 관찰할 수 있었던 지주 막하 출혈 7일군의 토끼는 모두 6마리였다. NO에 대한 혈
관 이완반응을 살펴보면 Table 1과 같다. 이중 곡선하 면적 이 고산소 분압에서 211±33.9, 저산소 분압에서 263±52.2 를 보여 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p값：0.016).
pD2는 고산소 분압에서 5.99±0.69, 저산소 분압에서 5.52
±0.75를 보여 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되었다(p 값：0.003). Endothelin-1에 대한 혈관 수축반응을 살펴 보면 Table 2와 같으며 고산소 분압과 저산소 분압사이에 서 통계학적 유의성을 갖는 차이는 관찰할 수 없었다.
Table 1. Endothelium-dependent relaxation to acetylch- oline in rabbit basilar artery
AUC Max(%) pD2
O2 191±92.8 92.4± 7.87 6.86±0.87 Control
N2 283±101 102± 4.97** 5.71±1.63 O2 197±69.5 96.9± 3.86* 6.59±0.60 Sham
N2 252±60.5 99.0± 1.01 6.20±0.37 O2 146±84.2 77.6±16.4*† 6.93±1.06 PI2 N2 217±103 93.3± 7.58** 5.72±1.22 O2 211±33.9 93.9± 6.73† 5.99±0.69 PI7 N2 263±52.2 96.8± 3.10 5.52±0.75 O2：under high O2 pressure；N2：under low O2 pressure AUC：area under the curve
Maxz(%)：maximal relaxation(%) compared to histamine contraction
pD2： -log(concentration of acetylcholine at which va- scular relaxation reach the 50% level of contraction to histamine)
Control：control group；Sham：sham operation group；
PI2：postictal-2-day group；PI7：postictal-7-day group
*, **, †：Statistically significant difference between gro- ups(p<0.05)
Fig. 2. Rabbit angiographic findings 7 days after subarachnoid hemorrhage. Upper panel shows no vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Lower panel shows severe vasospasm after subarachnoid hemorrhage.
Fig. 3. A typical recording of NO(A) & endothelin-1(B) res- ponse. A：Acetylcholines with increasing concentra- tion(10-7-3×10-4M) relax the vascular contraction induced by 3×10-6 M histamine(Ach ： acetylcho- line；7, 6, 5, 4：concentration of acetylcholine, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4M acetylcholine). B：Endothelin-1 with increasing concentration(10-11-3×10-8M) induces the contraction of vascular ring stabilized by 60mM KCl(ET-1：endothelin-1；11, 10, 9, 8：concentration of endothelin-1, 10-11, 10-10, 10-9, 10-8M endothelin-1).
3. 각 실험군 사이에서 관찰되는 혈관 수축 및 이완반응의 차이
고산소 분압하에서의 NO에 대한 각 실험군의 혈관이완 반응을 그래프로 나타내면 Fig. 5-A와 같다. 이중 지주막 하 출혈 2일군과 지주막하 출혈 7일군사이에서 관찰되는 최대이완치가 각각 77.6±16.4, 93.9±6.73을 보여 통계학 적으로 유의한 차이를 보였고(p값：0.042) 가장수술군과 지주막하 출혈 2일군사이에서 관찰되는 최대이완치가 각각 77.6±16.4, 96.9±3.86을 보여 통계학적으로 유의한 차이 를 보였다(p값：0.019). 그래프상 지주막하 출혈 2일군이 다른 실험군들과 비교하여 NO에 대한 혈관 이완반응이 증
가되어 있는 것을 알 수 있으며 지주막하 출혈 7일군은 다 른 실험군들에 비하여 NO에 대한 혈관 이완 반응이 감소되 어 있는 것을 알 수 있다.
저산소 분압하에서의 NO에 대한 각 실험군의 혈관 이완 반응을 그래프로 나타내면 Fig. 5-B와 같다. 이중 지주막 하 출혈 2일군과 비수술군사이에서 관찰되는 최대이완치가 93.3±7.58, 102±4.97을 보여 통계학적으로 유의한 차이 를 보였다(p값：0.036). 그래프상 고산소 분압과 마찬가지 로 지주막하 출혈 2일군이 다른 실험군들과 비교하여 NO 에 대한 혈관 이완 반응이 증가되어 있는 것을 알 수 있다.
고산소 분압하에서의 endothelin-1에 대한 각 실험군의 혈 관수축반응을 그래프로 나타내면 Fig. 6-A와 같다. 이중 지주 막하 출혈 2일군과 지주막하 출혈 7일군사이에서 관찰되는 최 대수축치가 각각 113±11.2, 92.1±18.8을 보여 통계학적으 로 유의한 차이를 보였다(p값：0.044). 그래프상 지주막하 출 혈 7일군이 다른 실험군들과 비교하여 endothelin-1에 대한 혈관 수축 반응이 감소되어 있는 것을 알 수 있다.
저산소 분압하에서의 endothelin-1에 대한 각 실험군의 혈관수축반응을 그래프로 나타내면 Fig. 6-B과 같다. 각 실험군간의 통계학적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
고 찰
1. 자가 동맥혈의 주입용량과 뇌혈관 연축
Baker 등2)은 토끼의 자가 동맥혈을 1.3cc/kg의 용량으 로 3일간격으로 두차례에 나누어 줄 경우 약 26%정도의
Table 2. Contraction to endothelin-1 in rabbit basilar artery
AUC Max(%) pD2
O2 174±70.2 102 ±15.3 8.89±0.66 Control
N2 160±61.7 102 ±15.1 8.87±0.58 O2 218±86.4 111 ±11.2 9.02±0.20 Sham
N2 221±93.6 110 ±16.5 9.04±0.13 O2 165±96.4 113 ±11.2* 8.66±0.57 PI2
N2 170±81.1 102 ± 8.68 9.26±1.00 O2 114±29.6 92.1±18.8* 8.47±0.36 PI7
N2 121±69.3 89.7±15.5 8.83±0.85 O2：under high O2 pressure；N2：under low O2 pressure AUC：area under the curve
Max(%)：maximal contraction(%) compared to 60mM KCl contraction
pD2：-log(concentration of endothelin-1 at which vascu- lar contraction reach the 50%
level of contraction to 60mM KCl)
Control：control group；Sham：sham operation group；
PI2：postictal-2-day group；PI7：postictal-7-day group
* ： Statistically significant difference between groups (p<0.05)
Fig. 4. Endothelium-dependent relaxation to acetylcholine(A) and contraction response to endothelin-1(B) in rabbit basilar artery of control group(n＝6). Vertical bars indicate standard errors of means. O2：under high O2 pressure；N2：under low O2 pressure.
사망률로 토끼의 뇌혈관연축 모델을 만들었다고 보고한 바 있다. 두 번째 자가 동맥혈을 주입한 후 1일째부터 모든 토 끼에서 뇌혈관 연축이 관찰되기 시작되었고 2일째에 가장 심한 뇌혈관 연축을 보였으며 그 이후로 10일까지 혈관 연 축이 점차 회복되었다고 보고하였다. Vorkapic 등19)은 토끼 의 자가 동맥혈 총 3cc/kg의 용량을 0.5～0.8cc씩 4시간 간격으로 대조내로 주입하여 뇌혈관연축 모델을 만들었다고 보고하였다. 그 결과 모든 토끼에서 1일째에 가장 심한 뇌 혈관 연축을 보인 뒤 5일째에 다시 심해지는 혈관연축이 관 찰되었다고 보고하였다.
그러나 본 연구 결과에서 보듯이 총 0.5cc/kg의 자가 동 맥혈을 토끼의 대조내로 주입하고 2일뒤에 뇌혈관 조영술 을 시행한 15마리중 7마리에서 64.3±11.2% 정도의 혈관 연축을 확인하였고 7일뒤에 뇌혈관 조영술을 시행한 13마 리중 7마리에서 64.9±10.9% 정도의 혈관 연축을 확인할 수 있었다. 따라서 기존의 토끼 모델을 개발한 저자들의 발 표와는 달리 뇌혈관 연축을 유발할 수 있는 최소의 자가 동 맥혈의 총량은 0.5cc/kg에서도 가능한 것을 확인할 수 있 었다. 본 실험에서 관찰된 사망율은 49마리중 21마리가 실 험도중 사망하여 43% 정도의 비교적 높은 사망율을 나타 내고 있으나 사망한 토끼들중 대부분이 실험 초기 토끼 관 리의 기술이 미흡할 때 사망한 것이었고 토끼관리가 제대로 시행되고 실험의 수기가 숙달된 실험 후기에서는 5마리중 한 마리 정도가 사망하는 비교적 안정적인 모델을 만들 수 있었다.
2. 뇌혈관 연축의 발생시기와 개체별 특성
본 실험에서 지주막하 출혈 2일군에서는 15마리중 7마리
(46.7%)가 뇌혈관 연축을 보였던 반면 8마리는 뇌혈관 연 축이 발생하지 않았다. 지주막하 출혈 7일군에서는 13마리 중 7마리(53.8%)가 뇌혈관 연축을 보였던 반면 6마리는 뇌혈관 연축을 보이지 않았는데 이는 인체에서 지주막하 출 혈후 뇌혈관 조영술상 관찰되는 뇌혈관 연축의 발생빈도와 유사한 결과이다.
현재까지 개발되어 온 토끼의 뇌혈관 연축 모델들에서 제 시된 일정 유형의 시기별 뇌혈관 연축곡선의 개념은 재고되 어야 할 것으로 생각되었다. 더욱이 인체에서 관찰되는 현 상과 전혀 양상이 다른 이들 토끼 모델을 이용하여 지주막 하 출혈의 치료 및 예방을 위한 여러 가지 약제를 개발한다 면 이 약제를 인체에 적용할 경우 많은 문제가 야기될 것이 다. 따라서, 토끼의 경우에서도 인체에서 관찰되는 것처럼 같은 양의 지주막하 출혈이 있었다 하더라도 개체에 따라 뇌혈관 연축의 발생 시기와 정도가 다른 것을 전제로 토끼 의 지주막하 출혈 모델을 고안하여야 할 것으로 생각된다.
3. 저산소증이 혈관 반응에 미치는 영향
두개강내 혈관에서는 혈관 외벽(adventitia) 및 중벽(me- dia)의 평활근에 산소와 영양을 공급해줄 vasa vasorum이 없다. Zervas 등21)은 horseradish peroxidase를 이용하여 지주막하 뇌척수액 공간과 혈관 중벽의 평활근층이 서로 교 통되는 것을 확인하였다. 따라서 지주막하 출혈이 있는 경 우라면 지주막하 공간내의 혈종으로 인하여 혈관 외벽 및 중벽의 평활근층으로의 원활한 산소 공급에 지장이 초래될 수 있다. 본 연구 결과에서 보듯이 지주막하 출혈후 뇌혈관 외벽 및 중벽의 평활근층에 발생할 수 있는 국소적 저산소 상태는 혈관의 endothelin-1에 대한 수축 반응에서 뇌혈관
Fig. 5. Endothelium-dependent relaxation response to acerylcholine in oxygenated(A) & hypoxic(B) basilar artery. Vertical bars indicate standard errors of means. S(PI2), S(PI7)：postictal-2-day, postictal-7-day group.
연축이 발생한 혈관이나 정상상태의 혈관이나 관계없이 고 산소 상태와 비교하여 별다른 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되었다. 반면 저산소 상태는 혈관의 NO에 대한 이완 반응은 뇌혈관 연축이 발생한 혈관이나 정상 상태의 혈관이 나 관계없이 고산소 상태와 비교하여 이완 반응을 억제하는 것으로 관찰되었다. 따라서 지주막하 출혈후 혈관 외벽 및 중벽의 평활근층의 저산소상태가 뇌혈관 연축을 유발한다기 보다는 이미 연축이 유발된 뇌혈관을 지주막하 출혈이 흡수 되기 전까지 저산소상태에서 지속적으로 뇌혈관 연축현상을 유지시키거나 심화시킬 수 있는 인자로 생각되었다. 임상적 으로 지주막하 출혈후 뇌혈관 연축을 예방하기 위하여 이용 되고 있는 지주막하 공간내의 혈종을 recombinant tissue plasminogen activator(rTPA) 등의 약제로 녹여 내거나 지주막하 공간내로 배액관을 삽입하여 뇌척수액을 씻어내는 방법들은 뇌혈관 연축을 유발하는 물질로 알려져 있는 ox- yhemoglobin을 제거할 뿐만 아니라 뇌혈관의 외벽과 중벽 의 평활근층의 상대적 저산소증을 해소하여 뇌혈관 연축의 지속을 억제할 수 있다고 판단되었다.
4. 연축 혈관에서 관찰되는 혈관반응의 시기별 차이 NO에 대한 혈관 이완반응을 살펴보면 지주막하 출혈 2 일군의 기저동맥이 지주막하 출혈 7일군과 비교하여 고산 소 분압과 저산소 분압에서 모두 증가되어 관찰되었다. 통 계학적으로 유의한 차이를 보였던 것은 고산소 분압에서의 NO에 대한 혈관 이완 반응이었지만(Fig. 5-A) 저산소 분 압에서도 지주막하 출혈 2일군이 7일군에 비하여 혈관의 이완 반응이 증가된 경향을 보이고 있다(Fig. 5-B). 이러 한 혈관 반응의 차이는 지주막하 출혈 7일군의 기저동맥이
지주막하 출혈 2일군보다 NO의 생성 및 감수성저하로 혈 관 평활근의 이완작용이 현저히 감소된 상태에 있다고 해석 할 수 있다. 더욱이 지주막하 출혈에 의한 혈관 외벽 및 내 벽의 평활근 층의 저산소상태를 감안하여 보면 지주막하 출 혈 7일군의 기저동맥이 지속적으로 혈관 연축을 보일 수 있 는 상태에 있다고 볼 수 있다.
지주막하 출혈후 7일째는 지주막하 출혈후 적혈구가 분 해되어 많은 양의 oxyhemoglobin이 세포밖으로 유리되어 나오는 시기이다5)11)12)16)
. Oxyhemoglobin과 다른 ferrous hemoproteins들은 잘 알려진 내피세포 의존성 이완작용의 억제제들이다. Oxyhemoglobin이 내피세포 의존성 이완작 용을 억제시키는 기전은 아직 잘 알려져 있지 않으나 지주 막하 출혈과 oxyhemoglobin의 유리에 의한 혈관내피세포 의 손상으로 인한 이차적인 EDRF(NO)의 감소를 가능한 기전로 생각할 수 있다3)6)9). 또는 oxyhemoglobin이 세포 밖으로 유리되어 혈관 평활근에 작용할 NO와 결합으로 인 한 NO의 감소로 해석할 수 있다.
따라서 지주막하 출혈후 7일째 혈관연축이 관찰된 기저 동맥의 혈관 반응의 변화는 oxyhemoglobin이 유리되는 시 기에 관찰되는 소견이며 NO에 대한 혈관의 이완반응이 지 주막하 출혈후 2일째 혈관연축이 관찰된 기저동맥에 비하 여 현저히 감소되어 있기 때문에 비록 뇌혈관조영술상 혈관 연축이 관찰되었다 하더라도 지주막하 출혈 2일군과 지주 막하 출혈 7일군의 기저동맥은 기능적으로 성격이 다른 혈 관으로 생각할 수 있다.
Endothelin-1에 대한 혈관 수축반응을 살펴보면 지주막 하 출혈 7일군의 기저동맥이 지주막하 출혈 2일군과 비교
Fig. 6. Contraction response to endothelin-1 in oxygenated(A) & hypoxic(B) basilar artery. Vertical bars indicate standard errors of means. S(PI2), S(PI7)：postictal-2-day, postictal-7-day group.
하여 고산소분압과 저산소분압에서 모두 감소되어 관찰되었 다. 통계학적으로 유의한 차이를 보였던 것은 고산소분압에 서의 endothelin-1에 대한 혈관 수축 반응이었지만(Fig.
6-A) 저산소분압에서도 지주막하 출혈 7일군이 2일군에 비하여 혈관의 수축반응이 감소된 경향을 보이고 있다(Fig.
6-B). 이러한 혈관 반응의 차이는 지주막하 출혈 7일군의 기저동맥이 지주막하 출혈 2일군보다 endothlein-1에 대 한 감수성이 떨어져 혈관 평활근의 수축작용이 현저히 감소 된 상태에 있다고 해석할 수 있다.
지주막하 출혈후 적혈구가 분해되어 유리되는 oxyhem- oglobin은 내피세포 의존성 혈관 이완작용을 억제시킬뿐만 아 니라 배양한 내피세포에서 강력한 혈관 수축제인 endothe- lin-1의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다7-10)14)15)17)18)
. 지주막하 출혈후 oxyhemoglobin이 유리되는 시기에 뇌척 수액내에 endothelin-1의 농도가 증가되어 뇌혈관의 수축 이 유발되었다고 가정하면 본 연구에서 관찰된 지주막하 출 혈 7일군의 endothelin-1에 대한 혈관 수축 반응의 감소 는 뇌척수액내의 증가된 endothelin-1에 대한 혈관 평활근 의 endothelin-1 receptor(ETA receptor)의 endoth- elin-1 에 대한 감수성의 저하때문에 endothelin-1에 대 한 혈관 수축반응이 감소된 것으로 해석할 수 있다.
따라서 지주막하 출혈후 7일째 혈관연축이 관찰된 기저 동맥의 혈관 반응의 변화는 oxyhemoglobin이 유리되는 시 기에 관찰되는 소견이며 endothelin-1에 대한 혈관의 수축 반응이 지주막하 출혈후 2일째 혈관연축이 관찰된 기저동 맥에 비하여 현저히 감소되어 있기 때문에 이 역시 비록 뇌 혈관조영술상 혈관연축이 관찰되었다 하더라도 지주막하 출 혈 2일군과 지주막하 출혈 7일군의 기저동맥은 기능적으로 성격이 다른 혈관으로 생각할 수 있다.
결 론
지주막하 출혈 수술후 2일째와 7일째 뇌혈관 연축이 확 인된 토끼의 기저동맥을 적출하여 organ chamber 내에서 고산소 분압과 저산소 분압하에서의 NO에 대한 혈관 이완 반응과 endothelin-1에 대한 혈관 수축반응의 변화를 비수 술군 및 가장 수술군과 비교 관찰한 결과 지주막하 출혈 2 일군 토끼의 기저동맥에서 관찰되는 뇌혈관연축의 특성은 지주막하 출혈 7일군에서 관찰된 뇌혈관 연축과는 생리적 으로 다른 것으로 생각되었다. 또한 본 연구에서 이용된 토 끼 모델은 뇌혈관 연축을 예방하거나 치료제로 제시된 여러 가지 약제들의 임상적 효용도를 생체내에서 평가할 수 있는 비교적 값싸고 안정적인 뇌혈관 연축 동물모델로 이용될 수
있다고 판단되었다.
•논문접수일：1999년 7월 6일
•심사완료일：1999년 9월 16일
•책임저자：한 대 희
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