pISSN: 0378-6471 eISSN: 2092-9374 http://dx.doi.org/10.3341/jkos.2013.54.3.479
= 증례보고 =
각막내피세포의 증식 및 손상의 회복에 대한 ROCK 억제제 Y-27632의 효과
김경환1,2⋅정진권1,2⋅류진숙2⋅고아영2⋅김미금1,2⋅위원량1,2
서울대학교 의과대학 안과학교실1, 서울대학교병원 의생명연구원 인공안구센터 안면역각막재생 연구실2
목적: ROCK 억제제인 Y27632가 인간각막내피세포의 생체외 및 생체내 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
대상과 방법: 인간공여각막에서 각막내피세포를 분리 및 배양한 후 Y27632 (10 μM) 투여 여부에 따른 세포증식의 정도를 유세포분석 을 통해 비교하여 생체외 효과를 알아보았다. 생체내 효과의 분석을 위해, 각막경유 냉동손상으로 유도한 각막내피세포손상 토끼동물 모델에서 Y27632 (10 mM) 투여 여부에 따른 각막두께 및 손상크기를 비교하였다.
결과: Ki67양성 세포는 투여군(9.1 %)이 대조군(8.0 %)에 비해 높았으며, Annexin V 양성 세포는 2.9%로 대조군(4.2%)에 비해 줄었으 나 통계적 유의성은 없었다. 동물모델에서 손상크기는 대조군(45.6 mm2)이 투여군(49.3 mm2)에 비해 유의하게 작았으나(p=0.029), 두 군 모두 처치 전에 비해 유의한 변화는 없었다. 세극등 및 각막두께 검사상 두 군간 유의한 차이는 없었다.
결론: Y27632가 기존의 연구와는 달리, 인간각막내피세포에서는 비생체 증식에는 유의한 효과를 관찰할 수 없었고, 토끼동물모델의 손상된 각막내피세포에도 증식을 유도하지 못했다.
<대한안과학회지 2013;54(3):479-489>
￭ 접 수 일: 2012년 9월 8일 ￭ 심사통과일: 2012년 10월 30일
￭ 게재허가일: 2013년 2월 7일
￭ 책 임 저 자: 김 미 금
서울특별시 종로구 대학로 101 서울대학교병원 안과
Tel: 02-2072-2665, Fax: 02-741-3187 E-mail: [email protected]
* 이 연구는 서울대학교병원 기금연구비지원(과제번호: 04-2010-0390)에 의하여 이루어진 것임.
* 이 논문의 요지는 2010년 대한안과학회 제104회 학술대회에서 구연으로 발표되었음.
인간의 각막 내피세포는 누출성 장벽 기능 및 능동적 펌 프 작용의 동적 평형을 통해 수분이동을 조절함으로써 각 막의 투명성을 유지하는데 있어 생리적으로 가장 중요한 단일 세포층이다.1,2 하지만 생체내에서 손상된 각막내피세 포의 재생은 극히 제한적이어서,3푹스각막이영양증, 외상, 인공수정체 수포각막병증 등의 여러 질환들에서와 같이 내 피세포가 손상되는 경우 각막의 부종 및 혼탁을 유발하여 심각한 시력의 소실을 초래하기도 한다. 이러한 질환의 치 료로 여러 형태의 각막이식이 시행되고 있지만, 이식거부반 응, 일차 이식편 실패 가능성 등의 제한점이 있고, 환자 수 에 비해 상대적으로 부족한 각막 기증으로 인해 조직 공학 을 이용한 기증 각막 대용물의 개발 및 이를 위한 각막내피 세포의 체외 배양 및 확장에 대한 관심이 증가하고 있다.
생체 내에서의 각막내피세포는 세포주기 중 G1 기에 멈 추어 있어 유사분열적으로 비활성적인 것으로 알려졌으나,3
체외 환경에서는 어느 정도 증식 시킬 수 있는 것으로 보고 되고 있다.4-6이렇게 증식이 제한적인 내피세포를 분리 및 일차배양하기 위한 많은 노력이 있어 왔으며, 최근의 연구 에서 Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) 신호전 달경로를 선택적으로 억제하는 합성화학물인 Y-27632가 원숭이에서 분리된 각막내피세포의 부착과 증식을 촉진하 는 것으로 보고되었다.7 또한 토끼를 이용한 동물모델에서 점안약의 형태로 투여시에도 각막내피손상의 회복을 촉진 한다고 보고하였다.8하지만 ROCK 는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)을 구성하는 단백질로서 세포의 증식, 분화, 세포자멸사, 종양성변화 등에 있어 중요한 역할을 하나,9세 포의 종류에 따라 작용이 다양하여 ROCK의 억제가 오히려 세포자멸사를 촉진하는 경우도 보고되고 있다.10-12또한 원 숭이의 각막내피세포가 타 동물에 비해 손상의 회복이 느 린 것으로 알려졌으나,13,14유사분열적 활성도를 비롯한 각 막내피세포의 특성이 인간과는 다를 가능성을 배제할 수 없다.
따라서 본 연구팀은 ROCK 억제제인 Y-27632가 인간 각막내피세포에 대해서도 세포증식이나 세포자멸사의 억제 효과가 있는지 알아보고자 하였다. 또한 생체 내에서의 내 피세포에 대한 효과를 알아보기 위해 토끼 동물 모델을 이 용한 실험을 진행하였다.
대상과 방법
본 연구는 ROCK 억제제인 Y-27632가 각막내피세포의 배양시 분화에 미치는 효과를 알아보기 위해 인간 공여 각막 을 이용한 비생체 기능 분석과 손상된 각막내피세포의 회복 에 미치는 효과를 분석하기 위한 내피세포 손상동물 모델을 통한 생체내 실험으로 진행되었다. 동물 실험 프로토콜(No.
11-0117)은 서울대학교병원 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 후 시행되었으며, 전 실험 과정 동안 모든 동물은 실험 동물관리원칙(the principles of laboratory animal care (National Institutes of Health publication No. 85-32, re- vised 1985) 및 눈과 시력연구에서의 동물사용에 관한 원칙 (the requirements of the Association for Research in Vision and Ophthalmology statement on the use of animals in ophthalmic and vision research)을 준수하였다.
ROCK 억제제 Y-27632가 각막내피세포에 미치는 효 과에 대한 비생체 기능 분석
인간 공여 각막
각막내피세포의 1차 배양을 위한 인간 공여 각막은 각막 이식 후 남은 각막윤부 조직을 이용하였다. 실험에 사용된 모 든 각막은 공여자의 병력 및 각막내피세포 수를 비롯한 각막 의 상태를 검토한 이후 수여자에 전층각막이식을 위해 적절 하다고 판단되어 수술에 사용 되었던 각막의 일부로서, 기증 각막의 채취 직후부터 각막보관용액(Optisol-GS, Bausch &
Lomb, USA)에 담은 후 4°C에 보관되었으며, 각막이식수술 직후 바로 각막내피세포의 분리 및 일차배양을 시행하였다.
인체각막내피세포의 분리 및 배양
각막내피세포의 분리 및 배양은 기존의 보고를 토대로 약간의 변형된 방법을 이용하였다.4,5 각막보관용액으로부 터 꺼낸 조직을 gentamicin (50 g/mL)을 포함하는 re- duced serum media (OptiMEM-I, Gibco-BRL, Grand Island, NY)를 이용해서 수차례 헹궈서 상피세포 쪽이 아래 로 향하도록 넓은 배양용기에 올려놓았다. 현미경하에서 내 피세포와 데스메막의 복합체를 아래의 후방 각막 간질로부 터 떼어냈으며, 이 때 준비된 전체 각막윤부조직에서 20- 25개 정도의 조각이 되도록 여러 개의 작은 조각으로 나누어 분리하였다. 배양용 배지에 담긴 내피세포와 데스메막의 복 합체 조각들은 세포의 안정화를 위해 37°C, 5% CO2의 환경 하의 배양기 내에서 밤새(overnight) 전배양(preincubation) 하였다. 모든 전배양, 일차세포배양 및 계대배양시 사용한 배지는 reduced serum media (OptiMEM-I, Gibco-BRL,
Grand Island, NY)에 8% fetal bovine serum (FBS;
Gibco-BRL, Grand Island, NY), 0.2 mg/ml CaCl2(Sigma- Aldrich Corp., St. Louis, MO), 0.08% Chondroitinsulfate (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), 0.02 mg/ml Ascorbic acid (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), 1:100 diluted Multivitamin solution (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), 1:200 diluted Gentamicin (Invitrogen, Grand Island, NY), 1:100 diluted Antibiotics-PSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), 1:100 diluted Pituitary extract (Gibco- BRL, Grand Island, NY), 5 ng/ml Epidermal growth factor (EMD Millipore, Billerica, MA) 및 20 ng/ml Nerve growth factor (Biomedical technologies, Inc., Stoughton, MA)를 첨가하여 만들었 다. 밤새 전배양된 조직을 원심분리하여 상층액을 조심스럽 게 제거한 이후 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA;
0.2 mg/ml)를 20분간 37°C에서 처리하였으며, 다시 원심 분리 후 상층액을 제거하고 미리 코팅된 12-well tissue culture plate에 분주하여 7일간 배양하였다. 배양에 사용된 모든 tissue culture plate는 tissue culture reagent (FNC Coating Mix; Athena Environmental Sciences Inc., Baltimore, MD)로 미리 코팅하였으며, 배지의 교환은 첫 1 주일 이후부터 2일 간격으로 시행하였다.
계대배양은 80% 정도의 confluency를 보일 때 시행하였 으며, Calcium/Magnesium free Dulbecco’s phosphate buf- feredsaline (PBS)으로 헹궈내고, 0.02% Trypsin/EDTA 를 4분간 37°C에서 처리하여 resuspension 시켰다. 이후 1:6의 비율로 미리 코팅된 12-well tissue culture plate에 분주하였으며 2일 간격으로 배지교환을 하였다.
모든 실험에는 passage 2의 세포가 이용되었으며, 80%
의 confluency를 이루었을 때 serum starvation을 위해 배 지를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM;
Gibco-BRL, Grand Island, NY)으로 교환하여 24시간 유 지하였다. 유세포분석시 동일한 공여각막에서 분리 배양된 세포를 각각 Serum starvation 이후 DMEM 배지만 24시간 추가로 유지한군(Control group), 10 μM Y27632를 첨가 한 DMEM 배지를 24시간 추가로 유지한 군(Y-27632 group), 또는 10 μg/mL heparin과 10 ng/mL Fibroblast growth factor 2 (FGF-2; CalBiochem, San Diego, CA)를 첨가한 DMEM 배지를 24시간 추가로 유지한 군(FGF-2 group) 등의 총 3군으로 나누어 결과를 분석하였다.
세포형태분석 및 면역세포화학염색
분리 배양된 각막내피세포의 형태 분석을 위해 위상차현미 경(DMI 6000B; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을
A B
C D
Figure 1. (A) Cylindrical dry-ice block was prepared using 7.75 mm sized corneal trephine. (B) Dry-ice block was applied
on the corneal surface of the animal for 25 seconds (C, D) for the induction of transcorneal freezing injury.이용하여 세포의 형태를 관찰하고 사진을 촬영하였다.
각막내피세포의 확인을 위해 각막내피세포가 발현하는 여러 표지자 중 collagen VIII (α2) (COL8A2) 및 내피세포 의 기능과 관련된 Na/K ATPase의 발현 여부를 확인해 보 았다. Na/K ATPase 염색을 위해서는 배양된 세포를 10분 간 차가운 메탄올로 고정한 후 1% bovine serum albumin, 0.3% Triton X-100 in PBS에 incubation하였다. 이후 12시간 동안 human monoclonal anti-Na/K-ATPase α-1 antibody (1:500; EMD Millipore, Billerica, MA)에 배양하고 FITC (fluorescein isothiocyanate) conjugated anti-human Ig G an- tibody (1:150; EMD Millipore, Billerica, MA)를 이용하여 Na/K-ATPase를 검출하였다. 음성대조염색을 위해서는 일차 항 체를 사용하지 않고 이차항체만을 사용하여 염색을 시행하였다.
유세포분석
세포주기진행에 대한 효과를 알아보기 위해 Ki67 분석을 하였다. 각 실험군의 배양된 세포들은 0.02% trypsin/EDTA 를 이용해 single cell로 분리한 이후 70% (w/v) ethanol에 고정하고 20°C에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 1:20 diluted FITC mouse anti-human Ki67 (BD Biosciences, San Diego, CA)을 넣고 배양 후 분석에 이용하였다.
세포자멸사에 대한 효과를 알아보기 위해 Annexin V 분 석을 하였다. 분석은 FITC Annexin V apoptosis detection kit (BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용하였으며, 설 명서의 순서대로 분석을 진행하였다. 각 실험군의 배양된 세포들은 0.02% trypsin/EDTA를 이용해 single cell로 분 리한 이후 차가운 PBS로 washing하고 1 ×binding buffer 에 부유시켰다. 이 중 100 μl (세포 수 1 ×105cells/ml)에 FITC Annexin V 5 μl와 Propidium iodide (PI) 5 μl를 첨 가 후 차광상태에서 실온, 15분간 배양하였다. 1×binding buffer를 400 μl 첨가한 후 1시간 이내에 분석을 하였다.
각각의 유세포분석은 유세포분석기(FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하였으며, 각 군 당 총 4개의 배양 개체를 대상으로 시행하였다.
내피세포손상 동물모델에서 Y-27632가 상처회복에 미치는 효과 분석
실험 동물
In vivo 실험을 위해 12마리의 백색 가토(체중 2.5-3.0 kg)를 이용하였다. 모든 수술 전 zolazepam (10 mg/kg)과 xylazine hydrochloride (10 mg/kg)를 근육주사하여 마취
Wound area (mm)2
A C
Corneal endothelial wound area
Baseline
(n = 4) Y-27632 group
(n = 4) Control group (n = 4) p > 0.05* p> 0.05*
100
80
60
40
20
0
B
Figure 2. (A) Alizarin red staining was performed using the cornea isolated 48 hours after corneal endothelial wound
induction. Gross appearance and (B) microscopic appearance shows the area of the induced corneal endothelial wound. (C) There was no significant difference between Y-27632 group and control group for the wound area change from the baseline (*Mann-W hitney U test).를 유도하였으며, 실험 종료시 모든 동물은 sodium pento- barbital (65 mg/mL)를 5ml 정맥내 주사하여 희생하였다.
각막내피세포 손상 동물 모델의 확립
각막내피세포 손상 동물 모델의 확립을 위해 4마리의 백 색 가토(체중 2.5-3.0 kg)를 이용하였으며, 상기 서술한 바대로 마취를 시행한 이후 진행되었다. 7.75 mm Barron donor corneal trephine (Katena Products, Inc., Denville, NJ)을 이용하여 드라이아이스를 원통형으로 절제한 후 이 를 실험 동물의 우안 각막표면에 25초간 적용하여 각막내 피세포의 냉동 손상을 유도하였다(Fig. 1).
이후 안구 적출을 하고 동물을 희생하였다. 척출된 안구 에서 각막윤부까지의 각막을 분리한 이후 각막내피세포의 손상범위를 측정하기 위해 Alizarin red staining을 시행하 고 ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD) 를 이용하여 분석하였다(Fig. 2A, B).
각막내피세포 손상의 회복 비교
각막내피세포 손상의 회복에 있어 Y-27632 처치의 영
향을 알아보기 위해 8마리의 백색 가토(체중 2.5-3.0 kg) 를 이용하였다. 상기 서술된 바대로 적절한 마취 이후 8마 리의 우안 각막내피세포의 냉동 손상을 유도하였다. 이후 실험군(4마리)의 경우 Phosphate-buffered saline (PBS) 에 희석된 10 mM의 Y27632를 하루 6회 국소 점안하였으 며, 대조군(4마리)는 PBS를 하루 6회 점안하였다. 술 전 두 군의 내피세포의 수에 차이가 없음을 확인하기 위해 경 면현미경검사를 시행하였으며, 손상 회복정도의 비교를 위 해 세극등 검사 및 각막두께검사를 술전, 처치 후 24시간, 48시간에 각각 시행하였다. 48시간째에는 안구적출후 각막 조직을 채취하여 alizarin red staining을 통해 손상정도를 분석하는 데에 이용하였으며, 이후 실험 동물은 기 서술된 방법에 의해 안락사를 유도하였다.
통계적 분석
SPSS version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하 여 통계 분석을 하였다. 연속변수의 비교를 위해 Wilcoxon signed rank test 와 Mann-Whitney Utest를 시행했으며, p-value<0.05의 경우를 통계적으로 유의한 것으로 정의
Primary culture First passage Second passage
COL8A DAPI Merge
Na/K ATPase DAPI Merge
Figure 3. (A) Morphological analysis of cultured corneal endothelial cells showed relatively uniform and similar
sized appearance. Until the second passage cells were kept hexagonal confluent single cell layers and showed less phenotypical change due to the replicative scenecence. (B, C) Cells during primary culture and subcultures were stained positively by both the COL8A2 and Na/K ATPase. Different from intracellular homogenous distribution of COL8A2, Na/K ATPase was distinctively found around the cellular membrane.하였다.
결 과
배양된 인간 각막내피세포의 확인
실험에 사용된 2차 계대배양까지의 세포들은 비교적 일 정한 크기로 육각형의 내피세포모양을 나타내었으며 융합 하는 단층의 세포층으로 유지되었다(Fig. 3A).
면역형광염색의 결과 일차배양 및 계대 배양된 세포는 모두 Na/K ATPase와 COL8A2에 양성으로 염색되었다. 특 히 Na/K ATPase의 경우는 세포막 부분에 잘 나타났으며, COL8A2의 경우에는 세포내 균일하게 염색되는 양상을 나 타내었다(Fig. 3B, C).
세포주기진행 및 세포자멸사에 대한 Y-27632의 영향
세포주기진행의 표지자인 Ki67양성 세포의 비율은 Y-27632 group에서 9.07 ± 4.09%로서 Control group의 7.97 ± 5.86%에 비해 높았으나(p>0.05, Mann-Whitney Utest), FGF-2 group에 비해서는 낮은 경향을 보였다(10.75 ± 4.26%; p>0.05, Mann-Whitney Utest; Fig. 4).
조기 세포자멸사를 나타내는 Annexin V 양성 및 PI 음성 세포의 비율은 Control group (4.15 ± 2.35%)에 비해 Y-27632 group에서는 줄었으나(2.36 ±0.78%; p>0.05, Mann Whitney Utest), FGF-2 group에서는 오히려 증가 하는 경향을 보였다(5.79 ±5.03%; p>0.05, Mann Whitney Utest). 하지만 후기 세포자멸사 및 세포괴사를 나타내는 Annexin V 양성 및 PI 양성 세포의 비율은 Control group (0.67 ±0.35%)과 비교하여 Y-27632 group (0.56 ± 0
A
B
C
Count Count Count
A B C
ki-67 FITC
ki-67 FITC ki-67 FITC
Control group (n = 4)
p > 0.05* p > 0.05*
20
15
10
5
0 Y-27632 group
(n = 4) FGF-2 group (n = 4)
Ki67 positive cells (%)
Figure 4. (A-C) The number of Ki67 positive cells were ana-
lyzed using flow cytometry. (A: Control group, B: Y-27632 group, C: FGF-2 group) (D) Ki67 positive cells were in- creased in the Y-27632 group compared to the control group, however there was no statistical significance (*Mann-W hitney U test).D
Table 1. Baseline characteristics of corneal endothelial cells before wound induction
Y‐27632 group(n = 4)
Control group
(n = 4) p
Specular microscopy
Cell Density 2692 ± 293.3 2415 ± 330.1 0.400*
Coefficient of Variance 32.8 ± 8.8 31.7 ± 3.7 0.857*
Hexagonality 65.5 ± 10.4 54.7 ± 8.3 0.229*
Pachymetry
Corneal thickness (μm) 341.6 ± 16.3 341.1 ± 28.5 0.857*
Values are presented as mean ± SD.
*Mann-Whitney U test.
.68%) 및 FGF-2 group (0.28 ±0.26%)에서 유의한 차이 는 보이지 않았다(p>0.05, Mann Whitney Utest; Fig. 5).
동물모델에서의 각막내피손상의 회복에 대한 Y-27632의 영향
드라이아이스를 이용한 각막경유 냉동손상으로 각막내 피세포손상 동물모델을 유도하였으며, 일정한 크기 및 형태 로 각막 내피 가운데 부분에 원형의 손상이 유발됨을 확인
하였고, 각막내피손상부위의 크기는 평균 59.51 ± 1.67 mm2 (n=4)로 측정되었다(Fig. 2). 각막내피손상의 유도 전 측정한 각막내피세포수 및 각막두께는 Y-27632 group 과 Control group 간에 유의한 차이는 없었다(p>0.05, Mann-Whitney Utest; Fig. 6 and Table 1).
각막내피손상 유도 48시간 이후 세극등 검사상 각막의 투명도 및 부종에 있어 Y-27632처치군과 대조군 간의 유 의한 차이는 보이지 않았으며, 각막내피손상 유도 24시간 및 48시간째에 측정한 초음파 각막두께 검사상에도 두 군
Control group
(n = 4) Y-27632 group
(n = 4) FGF-2 group (n = 4) p > 0.05*
p > 0.05* 10
8
6
4
2
0
Annexin V positive & PI negative cells (%)PI-PE PI-PE PI-PE
Annexin V-FITC Annexin V-FITC Annexin V-FITC
Figure 5. (A-C) The number of annexin V positive cells were an-
alyzed using flow cytometry. (A: Control group, B: Y-27632 group, C: FGF-2 group) (D) Annexin V positive and propidium iodide (PI) negative cells were decreased in the Y-27632 group compared the the control group with no statistical significance (*Mann-W hitney U test).A B C
D
간에 유의한 차이는 없었다(p>0.05, Mann-Whitney U test; Fig. 7).
48시간째에 채취된 각막조직의 Alizarin red 염색을 통해 확인된 손상부위의 크기는 대조군(45.63 ± 0.59 mm2)이 Y-27632처치군(49.26 ±0.77 mm2)에 비해 오히려 유의 하게 작았으나(p=0.029, Mann-Whitney Utest), 두 군 모두 처치 전 손상부위의 크기에 비해서 유의한 변화를 보이 지는 않았다(p>0.05, Wilcoxon signed rank test; Fig. 2).
고 찰
Rho, Rac, Cdc42으로 이루어진 Rho GTPase는 세포이 동, 세포증식, 세포자멸사 같은 세포 행동의 여러 측면에서 중요한 조절자로서, ROCK는 이러한 Rho의 첫 번째 하위 effector이고 myosin light chain의 인산화를 통해 stress fibers와 focal adhesion의 형성에 관여하는 것으로 알려졌 으며,15 이외에도 민무늬근 수축부터 세포이동이나 신경돌 기성장까지 세포 운동성의 매우 다양한 측면에 관련되어
있다.9 최근의 연구에서 이러한 ROCK를 억제하는 합성화 학물인 Y-27632가 원숭이 각막내피세포의 부착과 증식을 촉진하고, 세포자멸사를 감소시키는 것으로 보고되었으며,7 저자들은 Y-27632가 인간각막내피세포에도 이와 유사한 효과를 나타내는지 알아보기 위해 이 연구를 진행하였으나 기존 보고와는 달리, 증식 촉진 및 자멸사 억제에는 큰 효 과가 없었다.
생체외 분석을 위해 2차 계대까지 배양된 인간 각막내피 세포는 비교적 일정한 크기의 육각형 내피세포모양을 나타 내었으며, 면역형광염색을 통해 각막내피세포임을 확인하 였다. 본 연구팀의 예비 실험을 통해 2차 계대 배양까지는 분열 노화에 의한 표현형의 변화가 비교적 적은 것으로 관 찰하였다. 원숭이에서는 계대배양시 Y-27632의 투여가 세포노화 표현형을 지연시키는 것으로 보고하였으나,7저자 들은 세포모양의 변화, 증식속도 저하 등에 있어 Y-27632 의 투여로 인한 유의한 차이를 발견하지 못하였다(data not shown). Rho가 다른 Rho GTPase인 Rac과 Cdc42의 활성 화 의해 억제되면, cortical actin formation과 protrusive
A B
Figure 6. Baseline endothelial cell profile analyzed with specular microscope was not different between the Y-27632 group (A) and
the control group (B).Corneal thickness
Baseline POD 1 POD 2
p> 0.05*
p> 0.05* 1600
1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Corneal thickness ()µm
p > 0.05* Y-27632 group (n = 4)
Control group (n = 4)
A C
B
Figure 7. (A, B) As far as corneal transparency and edema are concerned, there was no significant difference between the Y-27632
group and the control group 48 after corneal endothelial wound induction. However, Y-27632 group showed relatively more surface irregularity compared to the control group.(A: Y-27632 group, B: Control group) (C) Corneal thickness confirmed by ultrasound pachymetry 48 after corneal endothelial wound induction revealed no significant difference between the two groups (*Mann-Whitney U test).process formation을 일으켜 결과적으로 각막내피세포의 mesenchymal transformation을 일으키는 것으로 알려졌 다.16 이것과 저자들의 예비실험 결과를 동시에 고려해 볼 때, ROCK 억제제의 사용이 세포노화 표현형을 지연시키는 것은 아닐 것이며, 오히려 mesenchymal transformation 등 에 의한 세포형태 변화에 영향을 미칠 가능성도 있는 것으 로 생각한다.
세포주기의 진행 및 세포자멸사에 대한 영향을 분석하기 위해 유세포 분석을 시행하였으며, 교란변수에 의한 비뚤림 통제를 위해 동일 기증각막에서 분리배양된 세포를 각 군 으로 나누었으며, 모두 serum starvation을 미리 시행한 이 후 진행되었다. FGF-2의 경우 인간각막내피세포에서 억제 성 세포주기조절자인 p27을 인산화함으로써 세포 분화를 촉진하는 것으로 보고되었으며,17본 연구에서는 Y-27632
의 효과와 비교하기 위한 대조군으로 이용하였다. 세포주기 진행을 나타내는 Ki67 양성 세포의 비율은 Y-27632 군은 대조군에 비해서는 높고 FGF-2 군에 비해서는 적은 경향 은 보였으나 통계적 유의성은 없었다. ROCK는 cen- trosome의 위치결정에 관여하며 ROCK의 억제가 G1 phase의 두 centriole의 분리를 유발하는 것으로 알려졌 다.18 하지만 actomyosin 고리 수축을 통한 세포의 분열 (cytokinesis)시 ROCK가 필요한 것으로 보고되었으며,19 ROCK의 억제시 오히려 이러한 cytokinesis를 지연시킬 수 있으므로 세포증식에 있어서 ROCK 억제제의 효과는 다양 하게 나타날 것으로 생각한다. 또한 세포 종류에 따라 ROCK 신호전달과정의 차이가 있을 수 있는 점을 감안할 때,20Y-27632가 원숭이 각막내피세포의 증식을 촉진했다 는 보고와는 달리,7 인간 각막내피세포를 이용한 저자들의 연구에서는 유의한 결과를 얻지 못한 것으로 생각한다.
RhoA가 cyclin E/CDK 2 활성도에 영향을 주어 p27의 분해 를 조절함으로써 S phase로 진행하도록 한다는 보고와,21 ROCK의 억제가 세포주기 진행을 억제한다는 다른 연구결 과들도 이러한 점을 뒷받침한다.22,23
세포자멸사가 시작되면 세포는 세포막 기포형성(membrane blebbing), 국소적 부착부위 손실 및 세포 분리 등의 형태적 변화를 일으키며, caspase-3에 의해 활성화된 ROCK가 이 러한 세포막 기포형성을 유발하는 것으로 알려졌다.24따라 서 caspase 활성도가 증가되는 특정 조건에서는 이후 활성 화된 ROCK에 의해 세포자멸사의 과정이 촉진되므로,25,26 ROCK억제제의 사용이 항세포자멸사 효과를 나타낼 수 있
으나,27-29 오히려 세포자멸사를 유발하는 경우도 보고되었
다.10-12인간각막내피세포를 이용한 본 연구에서는 Y-27632
의사용시 조기 세포자멸사가 줄어드는 경향은 보였으나 통 계적 유의성은 찾지 못했다. TNF-α, ceramide, Fas ligand 등의 외부 요소에 의해 세포사가 유발되는 경우에는 ROCK 의 활성화가 비교적 늦은 시기에 일어나고,24,30이러한 경우 ROCK의 억제가 세포자멸사 과정을 중단시킬 수 없는 것으 로 보고되었으며,30저자들의 연구에서도 이에 합당하게 후 기 세포자멸사 및 세포괴사는 ROCK억제제 사용에 따른 유 의한 변화를 보이지 않았다. Y-27632의 경우 비근육성 세 포에서 RhoA에 의해 매개되는 다양한 기능들을 억제하지 만, 이외에도 Protein kinase C-related kinase (PRK) 2 나,31citron kinase를 억제할 수도 있다.32따라서 ROCK 억 제제인 Y-27632를 이용한 여러 연구의 결과가 다른 pro- tein kinase와의 다양한 상호작용에 의해 다양하게 나타날 수도 있을 것으로 생각하며, 저자들의 연구에서 유의성을 찾을 수 없었던 원인 중 하나로 생각한다. 각막내피세포의 특성상 많은 개체를 이용해 실험을 수행 할 만큼 충분한 세
포 양을 확보할 수 없었던 제한점이 있다.
이 연구에서 Y-27632를 각막내피세포손상 토끼 동물모 델에 점안약 형태로 투여시, 각막부종의 회복 및 손상부위 크기변화에 있어서도 유의한 차이를 발견할 수 없었다. 오 히려 Y-27632를 사용한 경우 각막표면이 불규칙한 양상 이었으며, 이는 Y-27632가 각막상피세포의 세포증식을 억제한다는 보고에서 근거를 찾을 수 있다.33인간각막내피 세포는 방수 내에 존재하는 항세포분열인자인 transforming growth factor beta 2 (TGF-β2)나34 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)에 의한 효과35 및 내피세포 자체 의 contact-dependent inhibition 기전 등에 의해 세포주기 중 G1기에 멈추어 있어 유사분열적으로 비활성적인 것으로 알려졌다.3따라서 방수에 접하고 있는 생체내 환경하의 각 막내피세포에 대해서는 ROCK의 억제만으로는 유의한 효 과를 얻을 수 없었다고 생각한다. 또한 토끼의 각막내피세 포는 인간과는 달리 생체내에서도 높은 분열 능력이 있어 손상시에도 빠르게 증식하므로,36,37 이러한 것이 교란변수 로 작용해서 손상부위크기변화에 있어 유의한 차이를 찾지 못했을 수도 있을 것이다.
결론적으로 Y-27632가 동물각막내피세포의 증식을 촉 진한다는 기존의 연구와는 달리, 인간각막내피세포에서는 생체외 증식 및 자멸사 억제에 큰 도움이 되지 않았으며, 토끼동물모델을 이용한 생체내의 증식에 있어서도 유의한 효과를 관찰할 수는 없었다. 각막내피세포의 특성상 많은 개체를 이용해 실험을 수행할 만큼 충분한 양을 확보할 수 없었던 제한점이 있지만, 본 연구결과를 바탕으로 각막내피 세포기능이상의 새로운 치료법을 개발하기 위한 여러 후속 연구들에는 도움이 될 수 있을 것으로 기대한다.
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=ABSTRACT=
Effect of ROCK Inhibitor on the Expansion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cell
Kyeong Hwan Kim, MD1,2, Jin Kwon Chung, MD1,2, Jin Suk Ryu, MS2, Ah Young Koh, BS2, Mee Kum Kim, MD, PhD1,2, Won Ryang Wee, MD, PhD1,2
Department of Ophthalmology, Seoul National University College of Medicine1, Seoul, Korea Laboratory of Corneal Regenerative Medicine and Ocular Immunology, Seoul Artificial Eye Center,
Seoul National University Hospital Clinical Research Institute2, Seoul, Korea
Purpose: To investigate the effect of ROCK inhibitor Y27632 on the human corneal endothelial cell proliferation in vitro and in vivo.
Methods: Using corneal endothelial cells isolated and cultured from human donor cornea, we compared the effect of Y27632 (10 μM ) on the proliferation in vitro by flow cytometry analysis. For the evaluation of the effect of Y27632 (10 mM) in vivo, corneal thickness and wound area were analyzed for the corneal endothelial wound rabbit model induced by trans- corneal freezing.
Results: Ki67 positive cells were increased in the Y27632 group (9.1 ± 4.1 %) than the control group (8.0 ± 5.9 %), where- as annexin V positive cells in the Y27632 group (2.9 ± 1.0 %) were decreased compared to the control group (4.2 ± 2.2 %).
However these were not statistically significant. Wound area after Y27632 application in animal model is concerned, the control group showed significant smaller area (45.6 ± 0.6 mm2) compared to the Y27632 group (49.3 ± 0.8 mm2; p = 0.029, Mann-Whitney U test), however, these were not significantly different from the baseline. Corneal thickness was not differ- ent between the two groups.
Conclusions: Different from other reports for the effect of Y27632, no significant effect on the proliferation in vitro and wound healing in vivo, regarding human corneal endothelial cell, were found in this study.
J Korean Ophthalmol Soc 2013;54(3):479-489
Key Words: Human corneal endothelium, Rho-associated kinase inhibitor, ROCK inhibitor, Wound healing, Y27632
Address reprint requests to Mee Kum Kim, MD, PhD
Department of Ophthalmology, Seoul National University Hospital
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