Effects of <italic>Brassica rapa SHI-RELATED SEQUENCE</italic> overexpression on petunia growth and development

J. K. Hong ･ E. J. Suh ･ S. B. Lee ･ J. A. Kim ･ S. I. Lee ･ Y. H. Lee ( )

농촌진흥청 국립농업과학원

(National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, 370 Nongsaengmyeong-ro, Jeonju-si,

Jeollabuk-do, 560-500, Korea) e-mail: [email protected] S. Y. Lee

농촌진흥청 국립원예특작과학원 화훼과

(Floricultural Research Division, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Rural Development Administration, 100 Nongsaengmyeong-ro, Wanju-gun, Jeollabuk-do, 565-852, Korea)

C. Y. Song

한국농수산대학 화훼학과

(Department of Floriculture, Korea National College of Agriculture and Fisheries, 1515, Kongjwipatjwi-ro, Wansan-gu, Jeonju-si, Jeollabuk-do, 565-500, Korea)

배추 SHI-RELATED SEQUENCE 유전자 발현이 페튜니아 생장 발달에 미치는 영향

홍준기 ･ 서은정 ･ 이수영 ･ 송천영 ･ 이승범 ･ 김진아 ･ 이수인 ･ 이연희

Effects of Brassica rapa SHI-RELATED SEQUENCE overexpression on petunia growth and development

Joon Ki Hong ･ Eun Jung Suh ･ Su Young Lee ･ Cheon Young Song ･ Seung Bum Lee ･ Jin A Kim ･ Soo In Lee ･ Yeon-Hee Lee

Received: 29 June 2015 / Revised: 28 July 2015 / Accepted: 29 July 2015

ⓒ Korean Society for Plant Biotechnology

Abstract SHI-RELATED SEQUENCE (SRS) genes are plant-specific transcription factors that contain a zinc-binding RING finger motif, which play a critical role in plant growth and development. Among Brassica rapa SRS genes, BrSRS7 and BrLRP1 genes, isolated from shoot apical regions are important regulators of plant growth and development. In order to explore the function of BrSRS genes in horticultural plant growth and development, two constructs containing BrSRS7 and BrLRP1 under the control of a cauliflower mosaic virus 35S promoter were introduced into petunia by Agrobacterium-mediated transformation. The resulting trans- genic plants were dwarf and compact plants with reduced plant height and diameter. Additionally, these transgenic plants had upward-curled leaves of narrow width and short

internodes. Interestingly, the flower shapes of petunia were different among transgenic plants harboring different kinds of SRS genes. These phenotypes were stably inherited through generations T

and T

. Semi-quantitative RT-PCR analyses of transgenic plants revealed that BrSRS7 and BrLRP1 regulate expression of gibberellin (GA)- and auxin- related genes, PtAGL15- and PtIAMT1-related, involved in shoot morphogenesis. These results indicate that the overex- pression of BrSRS7 and BrLRP1 genes suppressed the growth and development of petunia by regulating expression of GA- and auxin-related genes. From these data, we deduce that BrSRS7 and BrLRP1 genes play an important role in the regulation of plant growth and development in petunia.

These findings suggest that transformation with the BrSRS genes can be applied to other species as a tool for growth retardation and modification of plant forms.

Keywords Short internodes, Transcription factor, Trans- genic plant, Retardation, Morphogenesis

서 론

왜성(dwarfism)의 특성을 유도하기 위한 생장 지연(Growth

retardation) 은 그 종(種)의 표준 크기에 비하여 작게 자라

는 형질, 또는 그런 형질을 가진 품종을 생산하기 위해

농업 및 원예산업에서 경제적으로 중요성을 가지는 영역

이다(Topp et al. 2009). 생장지연을 통해 식물 높이와 줄

기 길이를 축소함으로써 새로운 미적 가치를 갖는 관상

R esearch A rticle

용 원예작물을 제조할 수 있고, 채소 또는 과일을 소형화 함으로써 먹기에 적당한 크기를 갖는 새로운 상업적 가 치의 농작물들을 제조할 수 있으며 식물을 재배하는데 필요한 공간을 줄일 수 있기 때문에 효율적인 공간 사용 을 가능하게 한다.

화훼작물은 수세기 동안 육종가와 연구자들에 의해 수 많은 종류의 절화, 분화, 화단화 등이 개발되었고 상업화 되었다(Chandler and Sanchez 2012). 최근, 소비자들은 보 다 작고 콤팩트 하면서도 현재의 특성을 가진 화훼작물 을 선호하는데 특히 소형화된 화훼류는 생산시설에서 자 리를 덜 차지하고 다루기가 쉬우며 운송비가 절약된다는 이점이 있어 선호도가 높다(Islam et al. 2013). 특히 화훼 에서는 왜화제 처리가 부수적으로 많은 수의 측지를 발 생시켜 결과적으로 더 많은 꽃을 확보할 수 있는 장점이 있어서 왜화제들이 고수량, 고품질의 식물체를 얻는데 오랫동안 이용되었다(Kazaz et al. 2010). 그러나 이들 물 질들이 환경과 인체에 해롭다는 것이 밝혀지고 있다(De Castro et al. 2004; Lütken et al. 2012; Sørensen and Danielsen 2006). 최근 유럽에서는 식물의 생장조절을 위해 사용되는 왜성 유도의 대표적인 물질인 패클로부트라졸(paclobutrazol) 과 다미노지드(daminozide)등을 사용하기 위한 새로운 지 침서가 만들어 졌으며 유해성을 가지는 다른 화학 생장 조절제에 대해서도 환경단체들에 의해서 재평가되고 있 다(Lütken et al. 2012). 이러한 왜성 품종은 단기간에 전통 육종으로 쉽게 확보되기 어려운 상황으로 생장조절에 관 여하는 유전자를 이용한 GM 화훼 개발이 이루어지고 있다.

생장지연을 통한 왜성 식물체를 유도하기 위해 생명공 학적으로 식물 생장호르몬인 지베렐린산(Gibberellic acid, GA) 생합성에 초점을 맞춰 연구가 진행되어 왔다. 다양한 식물에서 활성 GA 생합성 경로에 관여하는 GA20-oxydase (GA20ox) 의 발현이 감소하면 식물 줄기의 길이가 줄고 왜성 식물체가 유도되며 활성을 가지는 GA가 줄었다. 또 한 식물에서 GA20ox의 감소는 작은 잎을 유도하고 개화 시기 지연 및 생식능력을 감소시킨다고 보고되어 있다 (Coles et al. 1999). 최근, 애기장대의 GA 신호 반응에서 관련 단백질의 완벽한 네트워크를 조절하기 위해 관련된 유전자들이 기능적인 유사성(functional redundancy)을 가 지는 것으로 보고되었다. 이들 중에서 전사조절인자인 DELLA 단백질은 GA 반응을 억제하는 조절자로 GA가 증가할 때 ubiquitin proteasome pathway에 의해 빠르게 분 해된다(Eckardt 2002; Wen and Chang 2002). DELLA 단백 질 발현을 통해 식물 생장이 영향을 받을 수 있는데 DELLA motif 인 DELLAVLGYKVRSSEMA가 결실된 애기장대 gai (GA INSENSITIVE, gai) 유전자가 발현된 벼는 “Green revolution rice” 와 유사한 왜성의 형태를 나타냈다(Fu et al. 2001; Koornneef et al. 1985). 또한 국화에서 gai 유전자 발현 시 왜성 식물을 유도하며 꽃 크기와 수, 개화시기를

지연시켰다(Petty et al. 2001). 사과에서 애기장대 gai 유전 자 과발현은 식물의 크기가 줄고 뿌리의 형성도 감소 시 키는 것으로 나타났다(Zhu et al. 2008).

애기장대에서 분리된 SHI (SHORT INTERNODES) 유전 자는 GA 신호를 인식하는데 관여하고 있으며 유전자군들 중에서 LATERAL ROOT PRIMORRDIA 1 (LRP1), STYLISHI (STY1), STYLISH2 (STY2), SRS7 은 중요한 식물 생장 발달 조절자로 잘 알려져 있다(Fridborg et al. 2001; Hong et al.

2012; Kim et al. 2010; Kuusk et al. 2006). SHI 유전자들은 전사조절을 담당하며 단백질간의 상호결합을 매개하는 역할을 하는 RING-like zinc finger와 IGGH 도메인이 공통 적으로 잘 보존되어 있다(Fridborg et al. 2001; Kuusk et al.

2006). 최근에 STY1은 트립토판 의존 옥신(Auxin) 생합성 경로에서 YUCCA4 유전자의 프로모터 부분에 있는 cis- element 의 특정부위에 결합하여 옥신 생합성을 활성화시 키는 전사인자로 밝혀졌다(Eklund et al. 2010; Sohlberg et al. 2006). 이렇게 SHI 단백질들은 생장과 발달에 관여하 는 다양한 호르몬 pathway에 연관되었다는 것이 확인되 었다(Zawaski et al. 2011). SHI 유전자가 과발현된 식물체 는 정단 우세 현상(apical dominance)이 감소되고 꽃 수가 증가되었으며 개화시기도 정상적으로 유도되었다(Fridborg et al. 1999). 이와 같이 SHI 유전자는 식물 암술군, 잎, 뿌 리 등의 조직에서 생장 조절 호르몬 반응을 조절하는 유 전자들의 전사조절을 통해 최종적으로 식물체의 형태 발 생 조절 과정에 관여하는 유전자로 밝혀졌다(Fridborg et al. 2001; Kuusk et al. 2006; Sohlberg et al. 2006; Staldal et al. 2008). 애기장대 유래 SHI 유전자의 과발현을 통하여 개화시기, 잎 모양 등 다른 화훼 특징을 보유하면서 크기 가 작아진 왜화 칼란코에 및 포인세티아를 생산하였으며 포플러에서도 작아지는 왜성 특성을 유도 하였다(Islam et al. 2013; Lütken et a1. 2010; Zawaski et al. 2011). 본 연구 의 선행 연구 결과로서 SHI 계열 유전자 6종을 배추로부 터 분리하여 구조 및 발현 분석을 하였으며 6종의 SHI 유 전자들 중에서 BrSTY1, BrSRS7, BrLRP1 유전자가 도입된 애기장대는 up-ward curled된 작은 잎과 꽃대가 신장하지 않고 개화하는 형태를 보유하면서 전체적으로 키가 작고 왜소한 왜성 특성을 나타내었다(Hong et al. 2010; Hong et al. 2012).

본 연구에서는 배추 유래 SHI 유전자 BrSRS7과 BrLRP1

을 페튜니아에 형질전환하여 생장 발달 및 형태적 특성

에 미치는 영향을 분석하였으며 화훼작물에서 배추 SHI

유전자가 왜성 등 새로운 특성을 유도하기 위한 주요한

후보 유전자로 이용될 수 있다는 것을 제시하고자 하였다.

Table 1 Oligonucleotide primers used in RT-PCR and genomic DNA PCR

Target Primer sequences Expected size (bp)

BrSRS7-forward 5’-ATGGCTGGATTGTTCTATCTAGGAGGTAG-3’ 1057

BrSRS7-reverse 5’-TTAAGACCTAGGAGATGCAAAGAAGGATG-3’

BrLRP1-forward 5’-ATGTCGGATTCCGGTGCCTTCACGGACTG-3’ 1159

BrLRP1- reverse 5’-TTAACTGTAAAACCCAGCGCCTGCACCAC-3

PtAGL15-forward 5’-ATGGGGAGAGGAAAGATTGATATAA-3’ 813

PtAGL15-reverse 5’-TAGTCACTTTGAGCCGACTTGATTC-3’

PtIAMT1-forward 5’-ATGGAAGTTGTTGAAGTTCTTCAC-3’ 1022

PtIAMT1-reverse 5’-TTGGACATGCAATCAGAAACAATC-3’

Actin-forward 5’-TGGCATCACACTTTTCTACAA-3’ 515

Actin-reverse 5’-CAACGGAATCTCTCAGCTCC-3’

재료 및 방법

식물재료

페튜니아 Dream Red (PanAmerican Seed)종자를 70% 에탄 올에서 1 분간 세척 후 1% NaClO 용액에서 10 분간 소독 하고 멸균된 증류수로 5-10 회 반복 세척하였다. 소독된 종자를 발아배지(MS basal medium + 2% sucrose + 0.9%

Phytagar) 에 파종하여 25°C 장일조건(낮 16 시간, 밤 8 시 간)인 식물 생장실에서 배양하였다.

BrSRS7과 BrLRP1 유전자 식물형질전환 벡터 제작 식물 형질전환을 위해서 pCAMBIA 1390 벡터를 변형하 여 사용하였다. pCAMBIA1390 벡터에 존재하는 His-tag 부위를 SpeI과 BstEII로 처리하여 제거하였으며, 항생제 하이그로마이신 분해 유전자(HPHII) 부위를 카나마이신 분해 유전자(NPTII)로 대체하여 제작하였다. BrSRS7과 BrLRP1 유전자를 CaMV 35S 프로모터에 융합하여 식물 형질전환용 벡터 35SP::BrSRS7과 35SP::BrLRP1을 제작하 였다. 제작된 벡터를 freeze thaw 방법으로 Agrobacterium tumefaciens GV3101 에 도입하였으며 유전자 도입이 확인 된 콜로니를 페튜니아 형질전환에 사용하였다.

형질전환 페튜니아 제작 및 세대 육성

기내에서 종자 발아 후 자라 나온 본엽을 0.5 cm 정도로 절단하여 아그로박테리움(O.D.550=0.4-0.6)을 포함하고 있 는 공동배양배지(MS basal medium + 3% sucrose + 1.0 mg/L BA + 2.0 mg/L IAA + acetosyringone 100 μM)에 넣고 25°C, 암상태에서 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 페튜 니아 잎을 멸균수로 5번 이상 부드럽게 세척 후에 선발 배지(MS basal medium + 3% sucrose + BA 1.0 mg/L + IAA

2.0 mg/L + carbenicillin 100mg/L + cefotaxime 250 mg/L + kanamycin 50 mg/L + 0.9% Phytagar) 에 치상하였다. 약 2-3 주 배양 후 절편체 끝부분에서 형성된 캘러스를 분리하 여 다시 선발배지로 옮겨 2-3 주 간격으로 계대배양 하면 서 shoot를 유기하였다. Shoot가 유도되면 뿌리 유도배지 (MS basal medium + 2% sucrose + carbenicillin 100mg/L + cefotaxim 250 mg/L + kanamycin 50 mg/L + 0.9 % Phytagar) 로 옮겨 뿌리를 유기하였다. 뿌리가 유기된 형질전환체 는 순화단계를 거쳐 온실에서 재배되었고 교배를 통하여 후대 종자를 확보하였다. 페튜니아 형질전환체의 세대 진전을 위해 독립된 20 개체의 T

종자를 카나마이신 50 mg/L 이 포함된 MS 기본 배지에 90개씩 파종하여 3 (저항 성) : 1 (감수성)의 분리비를 보이면서 표현형을 나타내는 형질전환 식물체를 온실로 옮겨 재배하였다. 온실로 옮 겨진 후 지속적으로 왜성의 형태적 특징을 나타내는 형 질전환 페튜니아를 선택하여 T

에서 T

까지 세대를 진전 시켰다. BrSRS7과 BrLRP1 유전자 형질전환체에서 4개 계 통의 T

종자를 카나마이신 50 mg/L을 사용하여 항생제 저항을 나타나는 개체를 선발하여 계통당 4개체를 선택 하여 T

로 전개시켰다. 최종적으로 형태가 고정된 2개 계 통을 T

세대로 전개하여 생장 발달 및 형태적 특성을 분 석하였다.

형질전환 페튜니아 유전자 도입 및 발현 분석

왜성의 형태적 특징을 나타내는 형질전환 페튜니아를 선 택하여 genomic DNA PCR과 RT-PCR을 통해 BrSRS7과 BrLRP1 유전자 삽입 유무와 발현을 각각 확인하였다.

페튜니아 식물체 잎으로부터 genomic DNA를 분리하였

다(DNeasy Plant Kit, Qiagene). 분리된 genomic DNA 500 ng

을 사용하여 BrSRS7과 BrLRP1 유전자 특이 프라이머를

이용한 PCR (95°C에서 3분 1 사이클, 95°C에서 1분, 55°C

에서 1분, 72°C에서 1분, 35 사이클, 72°C 10분 1 사이클

Fig. 1 The expression of BrSRS7 and BrLRP1 genes in trans- genic petunia plants. (A) Structure of the plant transformation constructs for the expression of BrSRS7 and BrLRP1 genes.

The gene encoding bacterial neomycin phosphotransferase II ( npt II), which is regulated by the nopaline synthase gene promoter ( nos-pro) and 3’ terminator (nos-ter), serves as a selectable marker for petunia transformation. BrSRS7 and BrLRP1 genes are regulated by the CaMV 35S promoter (CaMV 35S-Pro). LB and RB indicate left and right T-DNA borders, respectively. (B) PCR analysis using the genomic DNA of wild-type and transgenic petunia. The presence of BrSRS7 and BrLRP1 genes was verified by PCR amplification using gene-specific primers. (C) Semi-quantitative RT-PCR for BrSRS7 and BrLRP1 genes in over-expressing transgenic plants. Actin gene expression level was used as a quantitative control. Lanes M: molecular size marker, Wt: untransformed wild-type, lane #1, #2, and #: over-expressed lines, S7: BrSRS7 over-expressing line, L1: BrLRP1 over-expressing line 조건)로 식물체내 유전자 도입을 확인하였다(Table 1).

도입된 BrSRS7과 BrLRP1 유전자 발현을 확인하기 위 하여 형질전환 페튜니아 잎으로부터 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 total RNA를 분리 하였다. 분리된 total RNA 3 μ g 을 역전사효소(MMLV transcriptase RNase free, Toyobo)를 이용하여 cDNA를 제작하였다. 각 cDNA 샘플은 3배 희석 하여 2 μl를 PCR 증폭에 사용하였다. 유전자를 확인할 수 있는 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR (95°C에 서 3분 1 사이클, 95°C에서 1분, 55°C에서 1분, 72°C에서 1 분, 30 사이클, 72°C 10분 1 사이클 조건)로 도입된 BrSRS7 과 BrLRP1 유전자 발현을 확인하였고 DNA 염기서열 분 석을 통해 도입된 유전자의 발현을 최종 확인 하였다.

또한 8주된 형질전환 페튜니아의 분열조직에서 total RNA 를 분리하여 식물 생장 호르몬 GA와 auxin 관련 페튜 니아 AGL15-related (AY370526), IAMT1-related (AA045012) 유전자 특이 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 통해 상호 관련 유전자들의 발현을 분석 하였다(Table 1). Actin은 각 cDNA 샘플들이 동일한 양의 RNA로부터 cDNA가 제작되 었는지 확인을 위해 사용되었다.

형질전환 페튜니아 형태학적 특성 분석

분석에 사용된 형질전환 페튜니아는 3세대를 자가 수분 시켜 대부분 형질이 고정된 대표 2계통을 이용하여 분석 하였다. 배지에서 선발된 개체는 32공 tray를 사용하여 계 통별로 10개체씩 원예용 상토에 펄라이트(perlite)를 4:1 비율로 혼합한 토양에 옮겨 심어 4주 키운 후 18cm 화분 에 옮겨 심었다. 생육조사 및 개화조사는 화분 10개를 기 준으로 3반복으로, 화분당 30여개의 꽃이 개화되는 시기 에 조사를 실시 하였다(Song 2009a, 2009b). 생육조사는 초장, 초폭, 엽장, 엽폭, 엽색, 엽형, 줄기수, 줄기길이, 줄 기수, 절간장을 조사하였다. 초폭은 식물체 상단에서 옆 으로 퍼진 길이, 줄기길이는 식물체에서 가장 긴 줄기의 길이, 절간장은 5-6 마디 사이의 길이를 측정하였다. 개 화 조사는 화고, 화폭, 화색, 화형 등을 대상으로 조사하 였다. 화고는 개화한 꽃의 높이를 측정 하였고 화폭은 꽃 의 상단에서 내려본 직영의 길이를 측정하였다.

결 과

BrSRS7과 BrLRP1 유전자 도입 페튜니아 형질전환체 페튜니아에 배추 SHI 계열 유전자 BrSRS7과 BrLRP1를 발 현시키기 위하여 pCAMBIA 1390의 his-tag 부분을 제거하 고 선발 항생제를 카나마이신으로 대체한 형질전환 벡터 를 작성하였다(Fig. 1A). 작성된 벡터를 포함하고 있는 아

그로박테리움 GV3101을 사용하여 페튜니아 Dream Red (PanAmerican Seed) 에 형질전환을 하였다. 카나마이신에 저항성을 보이는 T

식물을 1차 선별한 후, 각 유전자 특 이 프라이머를 이용하여 genomic PCR로 형질전환체를 확인하였다. 유전자 도입이 확인된 페튜니아의 생장 발 달에서 뚜렷한 특징은 비형질전환체와 달리 식물체 전체 크기가 작았으며 잎 끝이 안으로 말리는 형태를 보였다.

또한 일부 형질전환체는 꽃 모양과 색상에서도 다른 특

징을 보였는데 심한 왜성을 나타내고 꽃이 활짝 전개되

지 않으면서 색상이 선명하지 않은 개체는 불임을 나타

내었다. 전체 식물체 크기가 작은 왜성의 특징, 잎, 꽃 모

양 등이 비형질전환체와 다른 특성을 갖는 BrRSR7 형질

전환체 128계통과 BrLRP1 형질전환체 60 계통의 T

종자

를 수확하였다. T

종자를 카나마이신 50 mg/L에서 발아

시켜 자라나온 식물체의 항생제 저항성과 감수성을 조사

하여 비율이 3:1로 나타나면서 왜성의 형태적 특징을 보

이는 20개 독립 계통에서 3 개체씩을 T

으로 선발하였다.

Fig. 2 Phenotypes of transgenic petunia plants transformed with BrSRS7 and BrLRP1 genes. (A) Comparison of soil-grown plants at the same age. (B) Comparison of plant morphologies after flowering. Seedlings were grown for 4 weeks in the same Petri-dish, transplanted into soil and photographed 4 to 11 weeks later. Wt: untransformed wild-type, lane #1, #2, and #3: over-expressed lines, S7: BrSRS7 over-expressing line, L1: BrLRP1 over-expressing line, WAI: weeks after imbibition, WAF: weeks after flowering. Bars are 1 cm

세대 진전을 위해 T

식물체 중에서 왜성의 형태적 특징 을 지속적으로 강하게 나타내는 형질전환 페튜니아 계통 (BrSRS7 : #3-3, 85-1-3, 113-1-3, 160-1, BrLRP1 : #24-3, 29-3, 45-3, 106-2-3) 에서 4개체씩을 선택하여 T

로 전개시켰다.

선발되어 세대가 진전된 T

식물체들은 식물체 전체 크 기가 작은 왜성 특성을 나타내었다. BrRSR7 도입 페튜니 아의 잎은 피침형으로 up-ward curled 현상이 나타났고 BrLRP1 도입 페튜니아의 잎은 작은 타원형으로 변형 되 었으며 꽃의 형태변화도 유전자에 따라서 특정한 모양을 나타내어 이들로부터 최종적으로 형태가 고정된 2개 계 통(BrSRS7 : #3-3-2, 160-1-1, BrLRP1 : #24- 3-2, 29-3-4)을 T

로 세대 진전 하였다. T

식물체에서 각 유전자의 특이 프라이머를 이용한 genomic PCR로 유전자 도입을 확인하 였으며(Fig. 1B), semi-quantitative RT-PCR로 BrSRS7과 BrLRP1 유전자 과발현을 최종 확인하였다(Fig. 1C).

페튜니아 형질전환체 형태학적 특성 분석

최종 선발된 BrSRS7과 BrLRP1 도입 T

형질전환 페튜니

아 #3-3-2, #160-1-1, #24-3-2, #29-3-4 계통을 종자발아 후

8 주부터 개화 후 3주까지 생장 발달 단계에 따라 왜성 특

성, 잎과 꽃 모양 등의 형태적 특성을 분석하였다. 종자

발아 후 8주부터 개화기까지 생장발달 동안 지속적으로

전체적인 식물체 크기가 작은 왜성의 특징을 강하게 나

타내었으며 잎의 발달과 형태, 줄기의 길이 생장과 꽃의

형태형성에 영향을 주는 다형질발현성(pleiotropism) 변이

를 보였다(Fig. 2A, B). 형질전환 페튜니아의 잎은 비형질

전환체 보다 진한 녹색을 보였고 BrSRS7 형질전환체는

피침형과 BrLRP1 형질전환체는 작은 타원형으로 나타났

다(Fig. 3A). 형질전환체 잎의 길이와 폭을 생장시기별로

비교 분석한 결과, 비형질전환체 보다 길이는 12-22%, 폭

은 11-44% 감소하였으며 지속적으로 크기가 작은 것을

Fig. 3 Leaf morphology of the transgenic petunia plants. (A) The leaves from each line are displayed. Comparison of leaf lengths (B) and widths (C). Values represent means of 10 plants per line. Error bars represent the standard deviation (SD)

Fig. 4 Phenotypes of transgenic petunia plants transformed with BrSRS7 and BrLRP1genes. Time course of transgenic plant height (A) and width (B) in the weeks following imbibition. (C) Comparison of stem number, length, diameter, and 5-6th internode length.

The values represent means of 10 plants per line. Error bars represent the standard deviation (SD) 확인 할 수 있었다(Fig. 3B, C). 또한, 생장시기에 관계없

이 형질전환체의 초장과 초폭은 비형질전환체보다 크기 가 작았고 15주 때에는 초장은 19-63%, 초폭은 13-35% 감

소하였다(Fig. 4A, B).

형질전환 페튜니아의 첫 번째 꽃이 개화했을 때에 줄

기의 수는 L1:24-3-2를 제외한 S7:3-3-2, S7:160-1-1, L1:29-

Fig. 5 Flower phenotypes of transgenic petunia plants transformed with BrSRS7 and BrLRP1genes. (A) The flowers from each line are displayed. (B) Comparison of flower heights and diameters. (C) Comparison of styles, stigma, and anther. The values represent means of 10 plants per line. Error bars represent the standard deviation (SD)

3-4 에서 비형질전환체와 유사하게 7-8개를 형성하였다 (Fig. 4C). L1:24-3-2 은 12.5개의 줄기가 형성 되었는데 증 가한 줄기 수의 표현형은 BrLPR1 유전자를 포함하는 T-DNA 가 페튜니아 genome에 삽입될 때 주위에 존재하는 줄기 수 발생 유전자에 직 ․ 간접적으로 영향을 주었을 것 으로 사료된다(Fig. 4B, Krysan et al. 1999; Ryu et al. 2010).

형질전환 페튜니아의 가장 긴 줄기의 길이, 직경, 5-6번 째 마디 사이의 길이를 비형질전환체와 비교하여 본 결 과 줄기의 길이는 17-36%, 직경은 18-42%, 절간의 길이는 8-41% 정도 감소하였다(Fig. 4C).

BrSRS7 과 BrLRP1 유전자 형질전환 페튜니아의 개화특

성을 분석한 결과, 형질전환체들의 개화기간은 크게 영 향을 받지 않았으나 비형질전환체보다 꽃이 일주일 빨리 개화하였다. BrSRS7 형질전환 페튜니아의 꽃은 (오)각형 을 나타내는 비형질전환체와 비교해서 전체적으로 별모 양을 나타내고 있으며 꽃받침의 크기는 비형질전환체보 다 유사하거나 조금 컸으며 화색은 짙게 관찰되었다(Fig.

5A). 개화한 꽃의 높이를 측정한 화고는 비형질전환체보

다 16-19%가 증가한 것으로 나타났는데 개화 때 완전하

게 꽃잎이 전개되지 못하고 발달된 개체들이 많아 상대

적으로 화고가 증가한 것으로 사료된다. 꽃의 상단에서

내려다 본 직경의 길이를 측정한 화폭은 2-6% 정도 작았

Fig. 6 Expression patterns of GA- and auxin-related genes in the apical regions of BrSRS7 and BrLRP1-overexpressing transgenic petunias. Data are means ± standard deviations (SD) from at least three independent experiments. PtAGL15: petunia AGAMOUS- LIKE15-related gene, PtIAMT1: IAA CARBOXYL METHYLTRANSFERASE 1-related gene

다(Fig. 5B). BrSRS7 형질전환체에서 암술과 수술의 형태 분석 결과, 암술대의 길이가 짧고 굵었으며 암술머리가 두툼하게 변형된 것으로 나타났으며 수술대의 길이는 비 형질전환체보다 짧으며 화분의 형성이 매우 빈약하였다 (Fig. 5C). BrLRP1 형질전환 페튜니아의 꽃은 전체적으로 원형을 나타내었고 꽃받침의 크기 또한 작았으며 화색은 비형질전환체 보다 옅게 관찰되었다(Fig. 5A). 화고는 비 형질전환체 보다 5-6% 정도, 화폭은 12-15% 정도 감소하 였다(Fig. 5A). BrLRP1 형질전환체에서 암술과 수술의 형 태 분석 결과, 암술대의 길이가 짧았으나 굵기는 비형질 전환체와 비슷하였으며 암술머리는 크게 변형되지 않았 고 화분의 형성이 빈약하였다(Fig. 5C).

페튜니아 형질전환체에서 식물생장호르몬 GA와 auxin 관련 유전자 발현 분석

선행 연구 결과에서 왜성의 특성이 강하게 유도된 BrSRS7 과 BrLRP1 유전자가 과발현된 애기장대에서 왜성의 형 태 형성에 관련된 AGL15, DDF1 유전자와 키, 뿌리 신장, 생식력에 관련한 RGA2등 GA 관련 유전자들의 발현이 증가 되었고, 잎과 뿌리의 형태발생에 관여하는 IAMT1, IAA, ARF7 등 옥신 관련 유전자들의 발현 또한 증가 하였 다(Hong et al. 2012). 이러한 결과를 바탕으로, BrSRS7과 BrLRP1 형질전환 페튜니아에서 보여준 왜성의 형질은 BrSRS7 과 BrLRP1 형질전환 애기장대와 유사하게 GA와 auxin 관련 유전자들의 발현 조절을 통해 유도되었을 것 으로 예상되었다. 애기장대의 GA와 auxin 관련 유전자 AGL15, IAMT1 의 motif 영역의 프라이머를 사용하여 페튜 니아 형질전환체의 정단분열조직에서 RT-PCR을 수행한 결과 PtAGL15 (AY370526)와 PtIAMT1 (AA045012) 유전자

가 BrSRS7과 BrLRP1 형질전환 애기장대에서의 결과와 유사하게 비형질전환체 보다 발현양이 현저히 증가한 것 을 확인 할 수 있었다(Fig. 6).

고 찰

배추 분열조직에서 분리된 BrSRS7과 BrLRP1은 zinc-binding

RING finger motif 를 갖고 있는 SHI 계열 유전자로 식물의

생장과 발달에 중요한 조절인자이다(Hong et al. 2012). 지

금까지 보고 된 경우를 보면, SHI 유전자들은 미성숙한

성장기나 발달기에 생장을 조절하는 것으로 알려져 있는

데 보리에서 SHI 유전자를 과발현 시켰을 경우 보리의

aleurone 세포층에서 GA에 의한 α-amylase의 발현을 억제

하는 기능을 가지고 있다(Fridborg et al. 2001; Olszewski et

al. 2002). 또한 애기장대 SHI 유전자를 화훼 칼랑코에와

포인세티아에 과발현 시킨 결과 식물의 초장이 감소하였

으며 세대를 진전하면서 작은 초장을 유지하는 왜성의

특징을 강하게 나타냈고 개화기는 비형질전환체와 큰 차

이를 나타내지 않아 SHI 유전자를 이용한 소형의 화훼

작물 개발 가능성을 보고하였다(Islam et al. 2013; Lűtken

et al. 2012). 포플러에서 애기장대 SHI 유전자와 유사한

포플러 STY1을 RNAi 방법으로 발현을 억제했을 때 키가

커졌으며, 애기장대 SHI 유전자가 과발현 되었을 때는

포플러 키에는 크게 영향을 미치지 않았으나 마디와 엽

병의 길이가 짧아지고 목부가 발달된다는 것을 보고하였

다(Zawaski et al. 2011). 선행 연구 결과에서 배추 SHI 계

열 유전자가 도입된 애기장대는 잎이 작고 위로 말리며

작은 초장을 유지하는 왜성의 특징을 강하게 보였다

(Hong et al. 2012). 이러한 결과들은 BrSRS7과 BrLRP1 유

전자가 과발현된 페튜니아 형질전환체에서 나타나는 초 장의 길이, 초폭, 줄기, 절간 사이의 길이 등이 감소한 왜 성의 형태적 특성들과 유사하다고 할 수 있다(Fig. 4, 5).

따라서, 페튜니아에 도입된 BrSRS7과 BrLRP1 유전자는 줄기 수에는 영향을 주지 않지만 줄기의 길이, 직경, 절 간 사이의 길이 생장을 억제하고 있으며 잎의 형태와 크 기도 작아져서 전체적으로 소형화된 식물의 형태인 왜성 을 유도하는 것으로 사료된다.

본 연구에서 BrSRS7과 BrLRP1 형질전환 페튜니아의 세대진전 시 모두 종자 형성율이 높지 않았는데 낮은 빈 도의 화분형성 및 비정상적인 암술형태가 원인 중의 하 나로 사료된다(Fig. 5). SHI 유전자들이 암술과 수술 형성 에 관련된다는 연구결과가 보고 되었는데 STY1 과 STY2 유전자는 옥신과 반응하여 암술군(gynoecium)의 발달 및 형태 형성을 조절하는 기능을 수행하고 있음을 확인 하 였다(Kuusk et al. 2006; Sohlberg et al. 2006). 또한, 애기장 대와 배추의 BrSRS7 유전자 과발현은 비정상적인 수술 열개(dehiscence)와 꽃기관 발달(floral development)을 유도 한다고 보고 되었다(Hong et al. 2012; Kim et al. 2010). 그 러나, 유사한 기능을 나타내는 SHI 유전자라도 작물과 품종에 따라 도입된 유전자에 의해 표현되는 생장 발달 및 형태적 특성이 다를 수 있음이 보고되었다. 꽃대와 꽃 수가 증가한 SHI 과발현 애기장대와는 다르게 AtSHI 유 전자가 도입된 칼랑코에 대부분의 품종들 경우 꽃대와 곁가지 수 및 길이가 감소한 것으로 나타났다(Lűtken et al. 2012). 특히 AtSHI 형질전환 칼랑코에 Sarah는 가지 길 이가 비형질전환체보다 15-25% 감소하였으며 짧아진 가 지로 인해 밀집해서 개화하는 칼랑코에는 유용하게 이용 될 수 있는 형태적 특성을 보였고 개화시기도 지연되지 않았다. 그러나 AtSHI 형질전환 칼랑코에 57-SHI-2는 꽃 이 피어 있는 시기(flowering period)가 길었으며 Jackie SHI- 계통, Simone-SHI-2, Suzanne-SHI-2, Suzanne-SHI-5는 특이 적으로 짧은 개화기의 특성을 보여 주었다. 따라서 본 연 구에서 사용된 SHI 계열 유전자 BrSRS7과 BrLRP1은 기존 의 연구와 유사하게 형질전환 페튜니아에서 비정상적인 수술 열개를 유도하고 있으나 암술과 화형 발달에는 각 각의 유전자가 다르게 영향을 준다는 것을 알 수 있었다 (Fig. 5). 따라서 BrSRS7과 BrLRP1 유전자는 왜성의 특성 뿐만 아니라 작물에 따라 꽃의 형태에도 영향을 주는 유 전자일 가능성이 제시된다.

GA 와 auxin은 식물의 형태발생에 중요한 호르몬으로 이들 호르몬 생합성, 전이, 반응 등에 관련된 유전자 일 부는 형태발생에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고 되었다(Fleet and Sun 2005; Li et al. 2007). 지금까지 보고 된 경우를 보면, 형태 발생에 관여하는 GA와 auxin 관련 유전자 중에서, AGL15가 과발현된 식물체는 GA가 결실 된 왜성의 형태를 유도하며 auxin 관련 유전자들 중

IAMT1 유전자는 식물체에서 잎이 말리게 하거나 뿌리의 발달을 저해하는 짧은 뿌리의 형태 발생을 유도한다고 보고 되었다(Fleet and Sun 2005; Li et al. 2007; Liscum and Reed 2002). 본 연구에서 BrSRS7과 BrLRP1이 과발현된 형 질전환 페튜니아의 정단분열조직에서 AGL15와 IAMT1유 전자의 발현량이 증가하였다(Fig. 6). 이러한 결과는 페튜 니아에 도입된 BrSRS7과 BrLRP1 유전자가 분열조직에서 왜성 형태발생 GA관련 PtAGL15 (AY370526) 유전자와 잎 과 뿌리의 형태발생 auxin 관련 PtIAMT1 (AA045012) 유전 자의 발현을 직 ․ 간접적으로 조절함으로써 왜성을 유도 한다는 사실을 예측 할 수 있다.

본 연구 결과 BrSRS7과 BrLRP1 유전자는 화훼 작물의 생장 ․ 형태 발달에 영향을 주어 왜성, 특이적인 잎과 꽃 모양을 유도할 수 있는 유용 유전자로서의 기능을 할 수 있을 것으로 사료된다.

사 사

본 논문은 농촌진흥청 어젠다 사업(과제번호: PJ008634032015, PJ0086162014) 의 지원에 의해 수행되었다. 또한 본 연구 는 2015년도 농촌진흥청 국립농업과학원 박사 후 연수과 정지원사업에 의해 수행되었다.

적 요

SHI-RELATED SEQUENCE (SRS) 유전자는 zinc-binding RING finger motif 를 갖고있는 식물 특이적 전사인자로서 식물 생장과 발달에서 중요한 역할을 하고 있다. 배추 생장점 부위로부터 분리된 Brassica rapa SHI-RELATED SEQUENCE (BrSRS) 유전자인 BrSRS7과 BrLRP1은 식물 생장과 발달 에서 중요한 조절자이다. BrSRS7과 BrLRP1 유전자가 원예 작물의 생장과 발달에 미치는 영향을 보고자 35S 프로모 터에 유전자를 결합시켜 두 종류의 식물 형질전환 벡터 를 제작한 후 아그로박테리움을 이용하여 페튜니아에 형 질전환하였다. 형질전환체들은 전체적으로 식물체 크기 가 감소되었고 잎은 작으면서 upward-curled된 특성을 나 타내었고 줄기 사이의 길이가 줄었다. 페튜니아의 꽃 모 양은 도입된 유전자에 따라 오각형, 별 모양, 둥근 모양 으로 다르게 나타났다. 이러한 특성들은 T

, T

세대진전 후에도 안정적으로 나타났다. RT-PCR로 유전자 발현을 분석한 결과 BrSRS7과 BrLRP1 유전자는 정단 분열 조직 에서 형태 형성에 관여하는 지베릴린과 옥신 관련 유전 자인 PtAGL15, PtIAMT1 발현을 조절함으로서 페튜니아 의 생장과 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다.

따라서 본 연구결과로 BrSRS 계열 유전자는 왜성 특성,

식물 형태 변형을 갖는 화훼 품종을 개발하는데 유용하 게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

References

Coles JP, Phillips AL, Croker SJ, Garcia-Lepe R, Lewis MJ, Hedden P (1999) Modification of gibberellin production and plant development in Arabidopsis by sense and antisense expression of gibberellin 20-oxidase genes. The Plant J 17:547-556

Chandler SF, Sanchez C (2012) Genetic modification; the development of transgenic ornamental plant varieties. Plant Biotech J 10:891-903

De Castro VL, Goes KP, Chiorato SH (2004) Developmental toxicity potential of paclobutrazol in the rat. Int J Environ Health Res 14:371-380

Eckardt NA (2002) Foolish seedlings and DELLA regulators: the functions of rice SLR1 and Arabidopsis RGL1 in GA signal transduction. Plant Cell 14:1-5

Eklund DM, Staldal V, Valsecchi I, Cierlik I, Eriksson C, Hiratsu K,Ohme-Takagi M, Sundstrom JF, Thelander M, Ezcurra I et al. (2010) The Arabidopsis thaliana STYLISH1 protein acts as a transcriptional activator regulating auxin biosynthesis.

Plant Cell 22:349-363

Fleet CM, Sun TP (2005) A DELLAcate balance: the role of gibberellins in plant morphogenesis. Curr Opin Plant Biol 8:77-85

Fridborg I, Kuusk S, Moritz T, Sundberg E (1999) The Arabidopsis dwarf mutant shi exhibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein. Plant Cell 11: 1019-1032

Fridborg I, Kuusk S, Robertson M, Sundberg E (2001) The Arabidopsis protein SHI represses gibberellin responses in Arabidopsis and barley. Plant Physiol 127:937-948

Fu X, Sudhakar D, Peng J, Richards DE, Christou P, Harberd NP (2001) Expression of Arabidopsis GAI in transgenic rice represses multiple gibberellin responses. Plant Cell 13:1791- 1802

Hong JK, Kim JS, Kim JA, Lee SI, Lim MH, Park BS, Lee YH (2010) Identification and characterization of SHI family genes from Brassica rapa L. ssp. Pekinensis. Genes &

Genomics 32: 309-317

Hong JK, Kim JA, Kim, JS, Lee SI, Koo BS, Lee Y-H (2012) Overexpression of Brassica rapa SHI-RELATEDSEQUENCE genes suppresses growth and development in Arabidopsis thaliana, Biotechnology letters 34:561-156

Islam MA, Lütken H, Haugslien S, Blystad D-R, Torre S, Rolcik J (2013) Overexpression of the AtSHI Gene in Poinsettia, Euphorbia pulcherrima, Results in Compact Plants, PLoS One 8: e53377

Kazaz S, Atilla AM, Kilic S, Ersoy N (2010) Effects of day length and daminozide on the flowering, some quality parameters and chlorophyll content of Chrysanthemum morifolium

Ramat. Sci Res Essays 5(21):3281-3288

Kim SG, Lee S, Kim YS, Yun DJ, Woo JC, Park CM (2010) Activation tagging of an Arabidopsis SHI-RELATED SEQUENCE gene produces abnormal anther dehiscence and floral development. Plant Mol Biol 74:337-351

Koornneef M, Elgersma A, Hanhart CJ, van Loenen-Martinet EP, van Rijn L, Zeevaart JAD (1985) A gibberellin insensitive mutant of Arabidopsis thaliana. Physiol Plant 65:33-39 Krysan PJ, Young JC, Sussman MichaelR (1999) T-DNA as an

Insertional Mutagen in Arabidopsis. The Plant Cell 11:

2283-2290

Kuusk S, Sohlberg JJ, Magnus Eklund D, Sundberg E (2006) Functionally redundant SHI family genes regulate Arabidopsis gynoecium development in a dose-dependent manner. The Plant J 47:99-111

Li LC, Kang DM, Chen ZL, Qu LJ (2007) Hormonal regulation of leaf morphogenesis in Arabidopsis. J Integr Plant Biol 49:

75-80

Liscum L, Reed JW (2002) Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development. Plant Mol Biol 49:387-400 Lütken H, Clarke JL, Műller R (2012) Genetic engineering and

sustainable production of ornamentals:current status and future directions, Plant Cell Rep 31:1141-1157

Lütken H, Jensen SJ, Topp SH, Mibus H, Müller R, Rasmussen SK (2010) Production of compact plants by overexpression of AtSHI in the ornamental Kalanchoë, Plant Biotechnology Journal 8:211-222

Olszewski N, Sun TP, Gubler F (2002) Gibberellin signaling:

Biosynthesis, catabolism, and response pathways. Plant Cell 14 (suppl.):S61-S80

Petty LM, Thomas B, Jackson SD, Harberd N (2001) Manipulating the gibberellin response to reduce plant height in Chrysan- themum morifolium. Acta Hortic 560:87-90

Ryu H-S, Ryoo N, Jung K-H, An G, Jeon J-S (2010) Rice functional genomics using T-DNA mutants. J Plant Biotechnol 37:133-143

Topp SH, Rasmussen SK, Mibus H, Sander L (2009) A search for growth related genes in Kalanchoe¨ blossfeldiana. Plant Physiol Biochem 47:1024-1030

Sohlberg JJ, Myrenas M, Kuusk S, Lagercrantz U, Kowalczyk M, Sandberg G, Sundberg E (2006) STY1 regulates auxin homeostasis and affects apical-basal patterning of the Arabidopsis gynoecium. The Plant J 47:112-123

Song CY (2009a) Selection of pure lines with various growth and flowering characteristics of spreading petunia, Petunia × hybrida. Flower Res J 17(2):128-136

Song CY (2009b) Correlation and combining ability of plant spreading characteristics in F1 hybrid by diallel cross in Petunia hybrida. Flower Res J 17(3):179-184

Sørensen MT, Danielsen V (2006) Effects of the plant growth regulator, chlormequat, on mammalian fertility. Int J Androl 29:129-133

Staldal V, Sohlberg JJ, Eklund DM. Ljung K, Sundberg E (2008) Auxin can act independently of CRC, LUG, SEU, SPT and STY1 in style development but not apical-basal patterning of

the Arabidopsis gynoecium. New Phytol 180:798-808 Wen C-K and Chang C (2002) Arabidopsis RGL1 encodes a

negative regulator of gibberellin responses. Plant Cell 14:

87-100

Zawaski C, Kadmiel M, Ma C, Gai Y, Jiang X, Strauss SH, Busov VB (2011) SHORT INTERNODES-like genes regulate shoot

growth and xylem proliferation in Populus, New Phytologist 191:678-691

Zhu LH, Li XY, Welander M (2008) Overexpression of the Arabidopsis gai gene in apple significantly reduces plant size.

Plant Cell Rep 27:289-296