보검선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten) 및 용과(Hylocereus undatus)의 부위별 플라보노이드 특성 비교
이선혜1․김헌웅1․이민기1․Gelila Asamenew1․김영진1․이수지1․차연수2․유선미1․김정봉1
1농촌진흥청 국립농업과학원
2전북대학교 식품영양학과
Characterization of Flavonoids from Used Parts of Prickly Pear (Opuntia ficus-indica var. saboten) and Dragon Fruit
(Hylocereus undatus) Using UPLC-DAD-QToF/MS
Seon-Hye Lee1, Heon-Woong Kim1, Min-Ki Lee1, Gelila Asamenew1, Young Jin Kim1, Suji Lee1, Youn-Soo Cha2, Seon Mi Yoo1, and Jung-Bong Kim1
1National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration
2Department of Food Science and Human Nutrition, Chonbuk National University
ABSTRACT A LC-MS library for the identification of flavonoids was constructed from the Cactaceae family based on previous reports. A total of 24 flavonol derivatives were identified in the used parts of Opuntia ficus-indica var.
saboten (prickly pear) and Hylocereus undatus (dragon fruit) using UPLC-DAD-QToF/MS and a constructed library.
Among them, as new flavonol derivatives, isorhamnetin 3-methyl ether and kamepferol 3-O-galactoside (trifolin) were tentatively identified in prickly pear, and quercetin 3-O-robinobioside and isorhamnetin 3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside were identified in dragon fruit (peels). In particular, isorhamnetin 3-O-rutinoside (narcissin) and isorhamnetin 3-O-rob- inobioside were confirmed as the major compounds in both samples. The flavonoid contents of prickly pear increased in the order of cladode (un-peeled)> whole fruit> cladode (peeled), and dragon fruit showed higher concentrations in the peels than pulps, suggesting that the by-products of these plants are more valuable as functional resources for various industries, such as foods, cosmetics, and pharmaceuticals.
Key words: prickly pear, dragon fruit, flavonoid, UPLC-DAD-QToF/MS
Received 8 October 2018; Accepted 7 November 2018 Corresponding author: Jung-Bong Kim, National Institute of Agri- cultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-63-238-3560
서 론
선인장과(Cactaceae) 식물은 flavonoids, phenolic acids, betalains, coumarins 등의 기능성 성분을 함유하며(1-4), 항암(5,6), 항염(7,8), 항산화(9-11), 항당뇨 및 항알츠하이 머 효과(12,13)를 나타내는 것으로 보고되었다.
국내에서 재배되고 있는 선인장 중 대표식물인 보검선인 장(백년초, Opuntia ficus-indica var. saboten)은 기온이 온화한 제주도와 남해안 지역에서 주로 재배되며, 저단선인 장(천년초, Opuntia humifusa)과 비교하였을 때 생장높이 및 가시형태에 따라 형태학적으로 다르게 구분되어 이용되 고 있다(14,15). 선인장의 플라보노이드는 isorhamnetin 배 당체 중심으로 구성되어 있으며, 저단선인장의 경우 iso- rhamnetin 3-O-rutinoside(narcissin), isorhamnetin 3-
O-robinobioside, isorhamnetin 3-O-rutinoside-4’-O- glucoside, isorhamnetin 3-O-galactoside-4’-O-glu- coside 등이 주요 성분으로 확인되었고(16), 보검선인장에 서는 narcissin, isorhamnetin 3-O-rutinoside-7-O- rhamnoside 등이 주요 성분으로 확인되었다(17). 특히 보 검선인장은 저단선인장에 비해 약 2배 이상의 높은 플라보 노이드 함량을 나타냈으며(18), kaempferol, quercetin, kaempferol 3-methyl ether, quercetin 3-methyl ether, (+)-dihydrokaempferol, (+)-dihydroquercetin, erio- dictyol과 같은 아글리콘을 함유하고 있다고 보고되었다(3).
귀화재배작물로서 용과(Hylocereus spp.)는 피타야 (pitaya)로 불리며 제주 및 남부지역에서 재배되고 있다. 주 로 열매를 식용으로 하며, 과피 및 과육의 색에 따라 백색계 (Hylocereus undatus-적색과피/백색과육), 적색계(Hylo- cereus costaricensis-적색과피/적색과육), 황색계(Hylo- cereus megalanthus-황색과피/백색과육)로 구분된다(1).
용과 열매가 익어갈수록 betalain(알칼로이드 색소)에 속하 는 betacyanins 및 betaxanthin 계열 성분 농도가 증가했으
며(19), Yi 등(20)은 꽃에서 isorhamnetin 3-O-robino- bioside 및 kaempferol 3-O-robinobioside를 포함한 6종 의 배당체를 분리･동정하였다. 또한 적색 열매에서 betanin, bouganivillein 등 8종의 betacyanin 배당체 및 quercetin 3-O-rutinoside(rutin), narcissin 등 5종의 flavonol 배당 체가 동정되었으며(21), Ferreres 등(1)은 적색 및 황색 열 매의 속과 껍질에서 isorhamnetin 배당체 등 총 18종의 flavonol 유도체를 확인하였으나 정확한 구조가 확인된 화 합물은 12종에 불과하였다. 제주에서 재배된 용과 추출물로 부터 LC-MS/MS 분석을 통해 betalain, phenolic acid 유도 체를 포함하는 18종의 페놀화합물이 분리되었으나, 확인된 flavonoid는 단지 phloretin 2’-O-glucoside 및 myricetin 3-O-galactoside로 2종이었다(5).
국내 재배 선인장의 열매 추출물은 천연색소를 풍부하게 함유한 기호식품(초콜릿, 국수, 발효유, 탁주 등)으로 다양하 게 제조되고 있을 뿐만 아니라 이들의 엽상경은 기능성 식품 의 원료로 이용되고 있어 지역 특화 작물로서 중요한 경제적 역할을 하고 있다(22-26). 이처럼 중요한 작물임에도 불구 하고 대표 기능성분 중 하나인 flavonol 배당체에 대한 정확 한 구조 동정 및 정량 평가 연구는 아직까지 부족한 실정이 다.
따라서 본 연구는 선인장에 함유된 플라보노이드의 정확 한 구조 동정을 위해 지금까지 보고된 LC-MS 라이브러리 정보를 구축하였으며, 이를 토대로 국내에서 재배된 보검선 인장 및 용과의 부위별 플라보노이드 특성을 평가하여 보급 되고 있는 국산 선인장 식품 원료에 대해 더욱 체계적이고 정확한 기능성분 정보를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 재료
보검선인장 및 용과는 2015년 제주도 지역에서 재배된 것을 구입하여 분석시료로 사용하였다. 선인장의 부위별 플 라보노이드 특성을 조사하기 위해 보검선인장의 열매는 전 체를 사용하였으며, 엽상경은 껍질을 제거한 것과 그렇지 않은 것으로 구분하였다. 용과(열매)의 경우 과육(백색) 및 과피(적색)로 나누어 사용하였다. 각 선인장 시료는 세절 후 동결건조 및 분말하고, -70oC에서 냉동 보관하여 사용하였 다. 정량분석에 사용된 내부표준물질 galangin은 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 아세토 나이트릴, 메탄올 및 물(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)은 UPLC급을 사용하였으며, 포름산은 Junsei Chem- ical(Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
플라보노이드 추출물의 제조
플라보노이드 추출은 Lee 등(27)의 방법대로 진행되었으 며, 균질화된 분말시료 1 g을 칭량한 후 내부표준물질 (galangin) 20 ppm을 포함한 추출용매(메탄올 : 물 : 포름산
＝50:45:5, v/v/v) 10 mL와 혼합하여 5분 동안 교반하였다.
3,000 rpm에서 15분 동안 상기 추출액을 원심분리(Gyro- zen Co., Daejeon, Korea) 하였고, 이어서 분리된 상층액을 0.2 μm syringe filter(Whatman International, Maid- stone, UK)를 이용하여 여과하였다. 플라보노이드의 효과 적인 부분 정제를 위해 Sep-pak C18 classic cartridge (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였다. 먼저 2 mL의 메탄올 및 물을 순차적으로 흘려 활성화했으며, 여과 된 상층액 0.5 mL에 4.5 mL의 물이 첨가된 희석액을 활성 화된 카트리지에 통과시켰다. 카트리지 내 불순물 제거를 위해 2 mL의 물을 흘려 세척하였고, 흡착된 플라보노이드는 3 mL의 메탄올을 이용하여 용출하였다. 용출 플라보노이드 를 질소가스로 완전히 농축한 후 0.5 mL의 추출용매로 재용 해하였으며, 0.2 μm syringe filter로 여과하여 UPLC- DAD-QToF/MS로 분석하였다.
플라보노이드 구조 동정을 위한 LC-MS 라이브러리 제작 보검선인장 및 용과로부터 검출된 플라보노이드 개별 성 분의 정확하고 신속한 구조 동정을 위해 ‘prickly pear(O. ficus-indica)’, ‘eastern prickly pear(O. humifusa)’, ‘erect prickly pear(Oxalis dillenii)’, ‘red-fleshed pitaya(H.
costaricensis; red peel/red flesh)’, ‘yellow pitaya(H.
megalanthus;yellow peel/white flesh)’, ‘white-fleshed pitaya(H. undatus; red peel/white flesh)’의 선인장 6종으 로부터 보고된 질량단편이온 및 UV spectra 패턴을 포함한 분석학적 정보를 정리하였다(Table 1).
UPLC-DAD-QToF/MS 분석
개별 플라보노이드를 분리하기 위해 diode array(DAD) detector가 장착된 ACQUITY UPLC™ system(Waters Co.)을 사용하였다. 분석 칼럼은 Kinetex XB-C18(150×
2.1 mm i.d., 1.7 μm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) 을 이용하였고, 칼럼 오븐의 온도는 30oC로 설정하였다. 검 출파장은 210~400 nm(대표파장, flavonol 350 nm) 범위 로 지정하였으며, 시료 주입량은 5 μL로 하였다. 이동상 조 성은 0.5% 포름산이 함유된 물을 A, 0.5% 포름산이 함유된 아세토나이트릴을 B로 하였으며, 유량은 0.3 mL/min으로 하였다. 이동상 구배조건은 B를 5%로 시작하여 20분까지 25%, 25분까지 50%, 30분까지 90%로 증가시킨 후 32분까 지 2분 동안 유지하였으며, 35분까지 5%로 다시 감소시키 고 40분까지 유지하였다. 구조 동정을 위해 Xevo G2-S QTOF-ESI/MS(Waters MS Technologies, Manchester, UK) 질량분석기를 사용하였고, positive ion mode로 분석 을 수행하였다. 질량분석 조건으로 capillary, sampling cone 및 extraction cone 전압은 각각 3.5 kV, 40 V 및 4.0 V였으며, ion source 및 desolvation 온도는 120 및 500°C로 설정하였다. Desolvation 및 cone 가스는 1,050 및 50 L/h로 설정하였으며, 질량 스캔범위는 m/z 200~
Fig. 1. Chemical structure of flavonol derivatives from prickly pear and dragon fruit.
1,200으로 하였다. 검출된 플라보노이드는 구축된 라이브 러리의 머무름 시간, 질량단편이온 및 UV spectra 패턴정보 와 비교하여 동정되었다. 정량분석은 전처리 시 투입된 내부 표준물질의 면적과 각 성분의 면적을 1:1로 비교하여 산출 하였다(mg/100 g dry weight).
결과 및 고찰
보검선인장 및 용과의 개별 플라보노이드 분리 및 동정 선인장과 식물 6종(보검선인장, 저단선, 무자단선, 코스 타리카용과-적색과피/적색과육, 황색용과-황색과피/백색 과육, 적색용과-적색과피/백색과육)의 꽃, 줄기, 열매 및 열 매(과피) 부위와 관련된 24편의 연구 결과로부터 flavonols, flavones, flavanones, flavanols, chalcones 계열로 다양 하게 구성된 총 58종의 플라보노이드 개별 화합물 정보를 상세하게 구축하였다(Table 1).
라이브러리 항목 중 질량 이온패턴은 양이온 및 음이온 모드로 구분하였으며, 양이온 모드의 경우 예상 패턴값을 추가로 제시하여 분리된 개별성분의 정확한 구조동정을 가 능하게 하였다. 보검선인장 및 용과로부터 분리된 플라보노 이드는 구축된 라이브러리에 제시된 머무름시간, UV spec- trum, 질량이온 패턴정보 등과 비교하여 총 24종의 fla-
vonol 유도체(kaempferol류 6종, quercetin류 6종, iso- rhamnetin류 12종)로 확인되었다(Fig. 1, Table 2). QToF/
MS를 이용한 양이온 질량패턴 분석 결과, 동정된 플라보노 이드로부터 모 분자량의 H+(m/z 1)에 해당하는 이온이 항상 확인되었고, 배당체의 경우 Na+(m/z 23)가, 아글리콘에서 는 K+(m/z 39)가 특이적으로 확인되었다.
보검선인장의 열매 및 줄기로부터 quercetin, kaemp- ferol, isorhamnetin 아글리콘이 분리되었고 이들의 유도체 quercetin 3-methyl ether 및 kaempferol 3-methyl ether 가 함께 보고된 바 있다(3,16). 본 연구의 같은 식물에서도 quercetin 및 kaempferol 구조의 3-OH 위치에 methyl기 가 결합하여 모 분자량으로부터 14 Da이 증가한 quercetin 3-methyl ether(peak 20) 및 kaempferol 3-methyl ether (peak 23)가 동정되었다. 그뿐만 아니라 369[M+Na]+ 및 331[M+H]+의 질량패턴을 나타내는 isorhamnetin 3- methyl ether(peak 24)는 quercetin 및 kaempferol 3- methyl ether의 동정 해석을 바탕으로 보검선인장 열매에 서 최초 신규 flavonol로 확인되었다(Fig. 2B, Table 2).
보검선인장 및 용과에서 플라보노이드 배당체는 아글리 콘보다 높은 비중으로 존재하며(4,17), glucose, galactose, rhamnose, xylose, arabinose, arabinofuranose, ruti- nose, robinobiose, neohesperidose와 같은 당류의 결합
A
B
C
Fig. 2. UPLC-DAD chromatograms of flavonols in prickly pear (A, whole cladode; B, fruit) and dragon fruit (C, peel). 1, isorhamnetin 3-O-galactoside-4'-O-glucoside; 2, isorhamnetin 3,4'-di-O-glucoside; 3, isorhamnetin 3-O-rutinoside-4'-O-glucoside; 4, isorhamnetin 3-O-rhamnoside-7-O-rutinoside; 5, isorhamnetin 3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside; 6, quercetin 3-O-robinobioside; 7, quercetin 3-O-ruti- noside (rutin); 8, quercetin 3-O-galactoside (hyperoside); 9, quercetin 3-O-glucoside (isoquercitrin); 10, isorhamnetin 7-O-rutinoside;
11, kaempferol 3-O-robinobioside; 12, kaempferol 3-O-galactoside (trifolin); 13, kaempferol 3-O-rutinoside (nicotiflorin); 14, iso- rhamnetin 3-O-robinobioside; 15, isorhamnetin 3-O-rutinoside (narcissin); 16, kaempferol 3-O-glucoside (astragalin); 17, isorhamnetin 3-O-galactoside; 18, isorhamnetin 3-O-glucoside; 19, quercetin; 20, quercetin 3-methyl ether; 21, kaempferol; 22, isorhamnetin;
23, kaempferol 3-methyl ether; 24, isorhamnetin 3-methyl ether; ISTD, galangin (20 ppm).
체로 보고되었다(7,28). 실제 보검선인장 열매 및 줄기에서 분리된 flavonol 배당체는 공통으로 각각의 아글리콘 구조 에 rhamnose(Rham m/z 146), glucose(Glu m/z 162), galactose(Gal m/z 162), rutinose(Rut m/z 308) 및 rob- inobiose(Rob m/z 308)가 주로 3-OH 위치에서 결합하는 패턴을 나타냈으며, 기존 연구와 유사하게 robinobiose →
rutinose → galactose → glucose → rhamnose의 순서로 용출되었다(18,20,30,37,38)(Fig. 1, 2). 이 중 471[M+
Na]+, 449[M+H]+, 287[M+H-Gal]+의 패턴을 나타내는 kaempferol 3-O-galactoside(trifolin, peak 12)는 보검선 인장의 열매 및 줄기에서 최초로 확인되었다.
641[M+H]+의 동일한 분자량을 가진 2종의 isorham- netin 배당체(peak 1, 2)는 순차적으로 6탄당(hexose m/z 162)이 잘려나가는 479[M+H-hexose]+, 317[M+H-2 hexose]+의 패턴을 가지고 있으며 기존 연구 결과를 바탕 으로 3-OH와 4’-OH 위치에 galactose 또는 glucose가 결
합된 화합물임을 확인하였다(16). 따라서 galactose 및 glucose의 용출 순서를 고려하여 peak 1 및 2는 각각 iso- rhamnetin 3-O-galactoside-4’-O-glucose 및 isorham- netin 3,4’-di-O-glucose로 동정되었다(Table 2). 또한 771[M+H]+의 분자량을 가진 화합물들은 625[M+H- Rham]+, 479[M+H-2Rham]+, 317[M+H-2Rham-Glu]+ 의 공통적 패턴을 나타내는 isorhamnetin 3-배당체로서 isorhamnetin rutinoside(peak 10, 15)의 질량이온 패턴을 기본적으로 포함하고 있다(17). 따라서 rhamnose 및 ruti- nose의 용출 순서를 고려하여 peak 4 및 5는 각각 iso- rhamnetin 3-O-rhamnoside-7-O-rutinoside 및 iso- rhamnetin 3-O-rutinoside-7-O-rhamnoside의 이성체 로 확인되었다(Table 2). 특히 확인된 flavonol 배당체 중 isorhamnetin 3-O-rutinoside-7-O-rhamnose(peak 5) 및 quercetin 3-O-robinobioside(peak 6)는 보검선인장 줄기에만 존재하는 것으로 보고되었으나(17), 본 연구의 용
과(과피)에서도 처음으로 확인되었다(Table 1, 2).
보검선인장 및 용과의 부위별 플라보노이드 함량 비교 선인장 함유 개별 플라보노이드의 함량(mg/100 g dry weight)은 relative response factor(RRF)를 고려하지 않 은 상태에서 내부표준물질의 peak 면적을 이용하여 계산되 었다(Table 2).
보검선인장의 엽상경(껍질 제거), 엽상경(껍질 포함) 및 열매에는 isorhamnetin 계열 유도체가 각각 97.8%, 79.5%, 81.0%로 대부분을 차지하고 있으며, isorhamnetin 3-O- robinobioside, isorhamnetin 3-O-rutinoside(narcissin), kaempferol 3-O-rutinoside(nicotiflorin) 및 quercetin 3-O-rutinoside(rutin)가 주요 flavonol 배당체로 나타났다 (Table 2). Mena 등(32)이 제시한 보검선인장의 어린엽상 경> 성숙엽상경> 열매(과피)> 열매(과육)의 순으로 페놀화 합물 함량이 증가한다는 결과와 유사하게 본 연구에서도 엽 상경은 열매보다 약 1.5배 높은 플라보노이드 함량을 나타 냈으며, 껍질을 포함(219.2 mg)하는 경우 껍질을 제거(9.1 mg)했을 때보다 약 24배 높게 나타나 플라보노이드는 주로 이들의 껍질에 분포하는 것으로 확인되었다.
용과의 과육에서는 플라보노이드가 거의 검출되지 않았 으며, 미량의 quercetin 계열 유도체 위주로 확인되었다. 반 면 과피(148.6 mg)에는 보검선인장 열매와 다르게 iso- rhamnetin 계열 유도체(90.8%)가 상당히 많이 분포하였으 며, narcissin, isorhamnetin 3-O-robinobioside 및 iso- rhamnetin 3-O-rhamnoside-7-O-rutinoside가 주요 성 분으로 나타났다. 이들 성분뿐만 아니라 열매 색상별 다양한 용과 시료에서 isorhamnetin 3-O-glucoside, isorhamne- tin 3-O-(2"-rhamnosyl)glucoside, isorhamnetin 3-O- (2",6"-di-rhamnosyl)glucoside 같은 배당체도 추가로 확 인되었다(1). 추후 보검선인장 열매 역시 용과처럼 과육과 과피로 나누어 플라보노이드 함량을 평가한다면 과피에 높 게 분포할 것으로 판단된다.
보검선인장 및 용과에는 narcissin이 전체 함량의 약 39~45%를 차지하는 주요 성분으로 확인되었고, 기존 연구 결과에서도 선인장을 대표하는 주요 플라보노이드로서 보 고되었다(8,9,33,39). 그뿐만 아니라 narcissin은 자유 라디 칼 소거에 의한 항산화 효과를 나타내는 것으로 확인되었으 며, narcissin이 주로 함유된 선인장 열매 주스를 급여하였 을 때 에탄올로 유도된 흰쥐의 위궤양 모델에 위 점막 보호 효과를 나타내었다(9). 또한 보검선인장의 엽상경으로부터 분리된 isorhamnetin 배당체는 염증유도제로 유발된 발 부 종 모델에서 염증 유발 경로인 COX-2를 억제하여 산화질소 (NO)의 생성을 감소시켰고, 염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 생성을 억제하여 항염 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(40). 따라서 보검선인장 및 용과는 이러한 우수 효과를 가진 isorhamnetin 배당체를 다량 함유하고 있어 다양한 산업분야에 기능성 소재로서 이용가치가 클 것으로
생각되며, 나아가 다양한 선인장의 시료 수집을 통해 플라보 노이드 고함유 자원의 선발을 위한 연구가 필요하다.
요 약
보검선인장 및 용과의 부위별 시료로부터 고해상도 ToF- MS 및 구조동정용 라이브러리를 이용하여 kaempferol, quercetin, isorhamnetin 계열의 아글리콘 및 배당체로 구 성된 24종의 flavonol 유도체가 분리･동정되었다. 이들 중 isorhamnetin 3-methyl ether 및 kaempferol 3-O-gal- actoside(trifolin)는 보검선인장에서, isorhamnetin 3-O- rutinoside-7-O-rhamnoside 및 quercetin 3-O-rob- inobioside는 용과의 과피에서 신규 flavonol 화합물로 확 인되었다. 특히 선인장 시료에서 공통으로 확인된 주요 성분 은 isorhamnetin 3-O-rutinoside(narcissin) 및 isorham- netin 3-O-robinobioside로 나타났으며, 보검선인장의 경 우 총 플라보노이드 함량은 엽상경(껍질 포함)> 열매(전 체)> 엽상경(껍질 제거) 순으로 높았고, 용과는 과육보다 과 피에서 월등히 높은 함량을 나타내었다. 따라서 선인장 시료 중 플라보노이드가 주로 분포된 부위는 엽상경(껍질) 및 용 과(과피)였으며, 추후 이들 부산물을 산업원료로 이용하여 플라보노이드 고함유 기능성 소재로서 식품, 화장품, 의약 품, 사료첨가제와 같이 다양한 산업에 응용할 수 있을 것으 로 기대된다.
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청의 어젠다사업(과제명: 농산식품자원 유래 페놀산 소재 탐색, 과제코드: PJ01178703) 연구지원에 의해 수행한 결과의 일부이며, 연구비 지원에 감사드립니다.
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