알로에 베라 부정근 추출물을 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 연구
김동명1*, 정주영1, 이형곤1, 권용성1, 백진홍2, 한인석3
Cosmetic Composition for Skin Improvement Containing Aloe vera Adventitious Root Extract
Dong-Myong Kim1*, Ju-Yeong Jung1, Hyung-Kon Lee1, Yong-Seong Kwon1, Jin-Hong Baek2, and In-Suk Han3
Received: 26 August 2020 / Revised: 16 September 2020 / Accepted: 17 September 2020
© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: The objective of this study was to investigate whether extracts of aloe vera adventitious root produced by plant tissue culture technology has better effects on anti-wrin- kle effect and skin-brightening than aloe vera extracts by per- forming in vitro assays. Aloe vera adventitious root and aloe vera were extracted by either water or 70% ethanol. Among water extract of aloe vera, water extract of aloe vera adventi- tious root, ethanol extract of aloe vera (AVE) and ethanol extract aloe vera adventitious root (AVRE), nitric oxide pro- duction inhibitory activity was the highest at AVRE, with a value of 62.28%. Inhibitory activities of matrix metallopro- teinase (MMP)-1 and MMP-3 syntheses were highest at AVRE (65.11 and 37.21%, respectively). When analyzing synthetic activity of type I procollagen which has an anti- wrinkle effect, AVRE showed higher value by 379.43% than UV-irradiated control group. The anti-melanogenic activity which correlates skin-brightening effect was also the highest at AVRE (83.77%), although, inhibitory activity of tyrosinase was not shown. Moreover, the value of DPPH radical scav-
enging activity of AVRE was higher than that of AVE by more than 10 times. From these results, it was confirmed that aloe vera adventitious root has better effect on wrinkle pre- vention and skin-brightening than aloe vera.
Keywords: aloe vera, adventitious root, tissue culture technol- ogy, antioxidant, anti-wrinkle, skin-brightening
1. INTRODUCTION
피부의 노화는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 발생하는 시간 의존적 내인성 노화와, 자외선 (ultraviolet, UV) 노출과 같은 주위 환경에 인한 광노화 (photoaging)로서 오랫동안 태 양광에 노출된 얼굴, 손등, 목 뒤 등의 피부에서 관찰되는 외 인성 노화로 나눌 수 있다 [1,2]. 이러한 노화는 여러가지 기 작으로 설명될 수 있는데, 그 중 하나는 산화적 스트레스 (oxidative stress)에 지속적으로 노출되어 체내 자유라디칼 (free radical)이 증가되는 것이다. 자외선으로 생성된 활성산 소종 (reactive oxygen species, ROS)은 실질적으로 피부의 효 소 및 비효소적 항산화 방어체계를 손상시키며 산화적 스트 레스는 피부의 염증반응 유발, 피부면역기능 억제, 세포성분 의 손상을 야기시키고 광노화를 촉진한다. 광노화를 유발하 는 활성산소종은 멜라닌 생성을 촉진시키고 주름을 유발하 는 원인 물질로 받아들여지고 있다[3,4]. 또한, 진피의 결합 조직인 콜라겐 (collagen) 및 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효 소인 collagenase 및 elastase의 활성 증가로 피부 노화를 설명 할 수 있다 [5]. 또한, 체내의 자유라디칼은 멜라닌 형성과정 에 관여하여 tyrosinase를 활성화시켜 기미와 주근깨를 생성
1㈜케이제이엠바이오 바이오연구소
1Biotechnology Research Institute, KJM Bio Ltd., Seoul 06649, Korea Tel: +82-2-405-6167, Fax: +82-2-405-6154
E-mail: [email protected]
2㈜김정문알로에 생명과학연구소
2R&D Center of Aloe, Kim Jung Moon Aloe Ltd., Seoul 06649, Korea
3유타대학교 화학공학과
3Department of Chemical Engineering, College of Engineering, The University of Utah, Salt Lake City, USA
Research Paper
하는 원인이 되기도 한다[6]. 따라서 피부 세포를 보호할 수 있는 항산화제 및 피부를 구성하는 물질인 콜라겐을 분해하 는 단백질 분해효소 (matrix metalloproteases, MMPs)의 생합 성을 억제할 수 있는 물질을 사용하여 피부노화를 완화할 수 있는 천연소재 개발에 관한 연구가 많이 진행되고 있다. 특 히, 식물 유래 소재는 안전성 측면에서 우수함을 인정받아 오랫동안 이용되었으며, 국내의 경우 민간에서 이용되거나 혹은 한방에서 이용되는 식물 및 생약 성분을 주로 한 기능 성 소재 개발이 활발히 이루어지고 있다.
알로에 베라 (Aloe Barbadensis Mill.)는 식물 유래 소재 중 지중해 지방과 아프리카가 원산지인 백합과 (Liliaceae)의 다 년생 초본이다. 알로에 베라의 주요 성분으로는 아세만난 (acemannan), 글루코만난 (glucomannan)과 같은 다당체를 포 함하여, 비타민 A, C, D, E, B12, 지방산, 아미노산, 셀레늄, 칼 슘 등과 알로인 (aloin), 알로에신 (aloesin), 에모딘 (emodine) 등 안트라퀴논 (anthraquinone)류 등의 약 300여 가지의 다양 한 성분을 함유하고 있다 [7,8]. 화장품 및 약재의 원료나 식 용 등의 다양한 용도로 사용되며, 살균 및 독소 중화, 피로회 복 및 피부 중성화, 해열, 변비 및 궤양에 효과가 있다고 보고 되어 왔다 [9].
일반적으로 식물체의 부정근을 유도하기 위해 기내배양에 사용되는 식물 호르몬의 종류로는 6-benzyloaminopurine (BAP), 키네틴 (kinetin) 및 thidiazuron-N-phenyl-N-1,2,3 thiadiazol-5yl urea와 같은 사이토키닌 (cytokinins), indole acetic acid, indole butyric acid (IBA), 1- naphthalene-acetic acid (NAA) 및 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid와 같은 옥신 (auxins), 그리고 지베렐린 (gibberellins) 등이 있다 [10-12].
식물 호르몬은 적용되는 조직의 종류에 따라 유효농도가 다 르며, 합성된 장소 이외의 곳에 운반되어 동일한 기능을 나 타낼지 여부가 불확실한 경우가 많기 때문에 목적에 따라 식 물 호르몬의 종류 및 농도를 적절히 선택하는 것이 중요하다.
앞선 연구에서는 조직배양에 의해 생산된 식물의 캘러스나 조직이 재배식물과 동일한 약효성분을 가지며 이를 대량으 로 생산하여 제조된 농축액이나 식물 사포닌으로 재배식물 의 원료를 대체하여 화장품, 의약품 및 건강식품 등의 원료 로 사용할 수 있을 것이라고 보고되었다 [13-15]. 이러한 추 세에 따라, 본 연구에서는 적절한 식물 호르몬을 이용해 알 로에 베라 부정근을 유도하여 알로에 베라 원물에 비해 높은 효용성을 가짐을 입증하고자 하였다.
또한 본 연구는 식물 조직배양 기술에 의해 생산된 알로에 부정근을 이용하여 알로에 베라 부정근의 추출물이 기존의 알로에 베라 추출물에 비해 높은 피부 주름개선 및 미백 효 능을 가지는 것을 확인하고자 진행되었다.
2. MATERIALS AND METHODS
본 연구에서 부정근 유도 및 실험에 사용된 알로에 베라는
㈜김정문알로에(Seoul, Korea)에서 지원받아 사용하였다. 또
한, 실험에 사용된 모든 배지와 시약은 Sigma Aldrich (Saint Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
2.1. 알로에 베라 부정근 추출물 및 알로에 베라 추출물의 제조 방법
알로에 베라 부정근의 배양은 Lee et al. [16]의 방법에 의해 진행되었다. 흐르는 물에 세척한 어린 알로에 베라 잎의 조 직이 단단하고 옅은 노란색을 띄는 부분만 남기고 나머지 부 분은 절단했다. 표면 살균 및 세척한 조직을 0.7 g/L 플레이 트 agar로 고형화된 0.5 mg/L NAA가 포함된 MS 배지에서 28
oC에서 3주간 암배양 하였다. 유도된 부정근은 0.3 mg/L IBA 가 포함된 MS 액체배지로 옮긴 후 최대 10주간 배양되 었다. 이와 같이 수득된 알로에 베라 부정근을 −85
oC에서 24 h 동안 동결건조 시킨 후 (FD8512, ilShinBioBase, Dongduchoen, Korea), 10 g의 건조물을 각각 100 mL의 70% (v/v) 에탄올 수 용액 또는 증류수로 24 h 상온추출 하였다. 그 후 0.45 μm 필 터로 여과 후 감압농축 및 열풍건조를 진행하여 건조 추출물 을 수득하였다.
마찬가지로, 동결건조한 알로에 베라 잎 10 g을 70% (v/v) 에탄올 수용액 또는 증류수 100 mL에서 24 h 상온추출 하였 다. 그 후 0.45 μm 필터로 여과 후 감압농축 및 열풍건조를 진행하여 건조 추출물을 수득하였다.
2.2. MTT assay에 의한 세포 생존율 분석
각 추출물의 세포 독성 분석은 Kim et al. [17]의 방법을 살짝 변형하여 진행하였다. 마우스 대식세포 RAW 264.7 cell 2 × 10
5cells/well 을 96 well plate에 190 μL씩 분주하고 37
oC 에서 24 h 배양하였다. 그 후, 100 또는 200 μg/mL 농도로 준비한 각각의 추출물 시료를 100 μL씩 처리하고 37
oC, 5% CO
2incubator에서 24 h 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 각 well 마다 100 μL 씩 첨가하여 37
oC에서 4 h 배양한 후, 배양액을 제거하고 DMSO : Ethanol (1 : 1) 100 μL를 가하고 실온에서 30 min 반응시킨 뒤 microplate reader (SpectraMax iD3, Molecular Devices, CA, USA) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.3. Nitric oxide 저해 활성 측정
각 추출물의 nitric oxide (NO) 저해 활성은 Griess Reagent System의 방법에 따라 분석하였다 [18]. LPS로 염증반응을 유발한 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 100 μL씩 분주하 여 37
oC에서 24 h 배양하였다. 그 후 알로에 베라 또는 알로 에 베라 부정근 추출물 시료를 각 well마다 100 μL씩 처리하 고, 동량의 Griess 시약을 첨가하여 10 min 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정 후 NO 생성율을 백분율로 표시 하였다.
2.4. MMP-1 및 MMP-3 단백질 합성 저해 활성 분석
추출물의 주름개선 효과를 확인하기 위해 기질금속단백질
분해효소-1 (matrix metalloprotease-1, MMP-1) 및 MMP-3 단
백질의 합성 저해 효과를 측정하였다. 40 mm의 petri dish에
2 mL의 Dulbeco’s modified eagle’s media (DMEM) 배지를 넣고 인간 섬유아세포 (fibroblast cell)를 약 1.2 × 10
5cells/
dish의 농도로 접종한 후 37
oC, 5% CO
2incubator에서 24 h 배 양하였다. UVB 조사 강도는 사전에 보고된 바에 따라 세포 생장률에 영향을 주지 않는 안전한 수준인 144 mJ/cm
2조건 으로 설정하였고 [19,20], UVB를 조사한 직후 각 추출물 시 료를 포함한 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 세포 배양액을 회수하여 4
oC에서 7,500 rpm으로 5 min 원심분리 하여 상층액을 회수하고, Human total MMP-1/3 kit (R&D Systems Inc., MN, USA)를 사용하여 MMP-1과 MMP-3의 단 백질 발현량 변화를 확인하였다.
2.5. 프로콜라겐 단백질 합성 촉진 효과 분석
추출물이 콜라겐 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 프로 콜라겐 단백질의 합성 촉진 효과를 분석하였다. 앞선 MMP 단백질 합성 저해 활성 분석 방법과 동일하게, DMEM 배지 에 인간 섬유아세포를 접종한 뒤 37
oC, 5% CO
2incubator 에 서 24 h 배양하여 준비하였다. 그 후 Procollage Type I C Peptide EIA kit (Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 UVB가 조 사된 세포의 배양액에서 type I 프로콜라겐의 단백질 발현량 에 대한 변화를 확인하였다.
2.6. 멜라닌 합성 억제 활성 분석
추출물의 미백 효능을 평가하기 위해 멜라닌 합성 억제 활 성을 분석하였다. 마우스 흑색종 세포 (B-16 melanma cell)를 10% fetal bovine serum (FBS)가 포함된 DMEM 배지를 이용 해 배양하였고, 6 well plate에 3 × 10
5cells/well 로 분주하여 24 h 배양한 후 50, 100 및 200 μg/mL 농도의 각 추출물을 처 리하였고, 그 후에 3일간 배양하였다. 배양 후 phosphate buffer solution으로 2회 세척하고 트립신 (trypsin)을 처리하 였고 배양 용기로부터 세포를 분리시킨 후 원심분리하여 세 포 침전물을 얻었다. 추출된 멜라닌에 1 N 수산화나트륨 용 액 1 mL을 가하고 10 min 가열하여 멜라닌을 용해시킨 후 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 50 μg/mL의 kojic acid를 사용하여 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준곡선에 의 해 계산하였으며, 시료 무첨가군과 첨가군의 멜라닌 감소율 로 멜라닌 합성 억제효과를 산출하였다. 또한, B-16 세포에 대한 추출물의 독성은 MTT assay를 통해 분석하였다.
2.7. Tyrosinase 억제 활성 분석
알로에 베라 및 알로에 베라 부정근 추출물의 tyrosinase 억제 활성은 다음과 같이 측정하였다. 간단하게, 220 μL의 0.1 M sodium phosphate buffer와 20 μL의 200 μg/mL 추출물 시료 를 혼합한 후 1.5 mM L-tyrosine 40 μL과 1,500 unit/mL로 제 조된 mushroom tyrosinase를 20 μL 첨가하였다. 그 후에 37
oC 에서 15 min 반응시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하여 생 성된 도파크롬 (dopachrome)의 양을 평가하였다.
2.8. DPPH 라디칼 소거 활성 분석
각 추출물의 α-α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼에 대한 환원력을 측정하기 위해 Blois [21]의 방법을 이용하였 다. 시료 10 μL와 0.1 mM DPPH/Ethanol 190 μL를 혼합하고 실온의 암실에서 30 min 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 각 시료 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 절반으로 환원시키는 데 필요한 시료의 농도인 IC
50값으로 나타냈다.
2.9. 통계처리
각 시료 간의 차이를 비교하기 위해 통계처리를 실시하였다.
모든 시료에 대하여 3회 반복 실험을 진행하였으며, 각 자료 는 평균과 표준오차로 나타냈다. 통계 분석은 SPSS (IBM SPSS Statistics, NY USA)를 사용하였고, 95% 유의수준에서 던컨 (Duncan)의 일원배치 다중검정 시험으로 각 처리 간의 유의적인 차이를 확인하였다.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. MTT assay에 의한 세포 생존율 분석 결과
마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대한 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근 추출물의 세포 독성을 알아보기 위해 MTT assay 를 수행한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 알로에 베 라 및 알로에 베라 부정근의 물 및 70% 에탄올 추출물을 각 각 100 및 200 μg/mL로 24 h 처리한 결과, 알로에 베라 70%
에탄올 추출물 (AVE), 알로에 베라 물 추출물 (AVW), 알로 에 베라 부정근 70% 에탄올 추출물 (AVRE) 및 알로에 베라 부정근 물 추출물 (AVRW) 모두 세포 생존율이 95% 이상으 로 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않았다.
Fig. 1. Effect of aloe vera and aloe vera adventitious root extracts on the cell viability of RAW 264.7 cells. Untreated means the group treated nothing; AVE means the group treated with 70%
ethanol extract; AVW means the group treated with distilled water (DW) extracts of aloe vera; AVRE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera adventitious root; AVRW means the group treated with DW extracts of aloe vera adventitious root.
Data represent the mean±S.D. with three separate experiments.
3.2. Nitric oxide 저해 활성 측정 결과
NO는 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러가지 생물학적인 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 농도에 따라 세포 기능유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다 [22,23]. LPS 자극 에 의해 발현된 inducible NOS (iNOS)는 많은 양의 NO를 생 성하게 되며 이에 대한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변 이 및 종양발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되 어 있음이 보고되어 있다 [24-26]. 활성산소종 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생 성에 대한 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근 추출물의 활 성 결과는 Fig. 2에 나타냈다. LPS 처리 후 NO 생성량을 100% 로 나타냈을 때 정상세포군의 NO 생성량은 9.65%이었 으며, positive control로 인도메타신을 처리한 경우에는 NO 생성량이 54.16%로 LPS 처리군에 비해 절반 가량의 값이 확 인되었다. AVW, AVRW, AVE 및 AVRE 실험군은 100 μg/mL 와 200 μg/mL 모두 37.72-94.23% 사이의 값으로 LPS 처리군 보다 낮은 NO 생성량을 보였다. 특히 200 μg/mL 농도의 AVRE에서 37.72%로 NO 생성 저해 활성이 가장 큰 것으로 나타났다.
3.3. MMP-1 및 MMP-3 단백질 합성 저해 활성 분석 결과 자외선에 의한 외인성 노화 과정의 가장 큰 원인이 되는
MMPs는 피부의 섬유아세포, 각질형성세포 등에서 분비되 어 세포의 기질 (extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)을 구성하는 대부분의 기질단백질들을 분해하는 중요한 역할을 하고 있다 [27]. 피부에 조사된 UV량이 높을 경우 세포독성을 직접적으로 일으켜 세포사멸을 촉진하고, MMP-1 발현을 증가시켜 교원질 분해를 촉진하면서 피부의 외인성 노화가 촉진되기 때문에 MMPs 단백질 합성 저해 활 성은 피부 개선에 매우 중요한 역할을 한다. 알로에 베라 추 출물 및 알로에 베라 부정근 추출물의 MMP-1 및 MMP-3 단 백질 발현 저해 활성을 분석한 결과는 Fig. 3에 나타내었다.
자외선 조사 처리한 인간 섬유아세포는 자외선 무처리군에 비해 MMP-1 단백질 생성량이 2배 이상으로 증가하였다 (Fig. 3(A)). AVW 및 AVRW의 MMP-1 단백질 생성량은 100 μg/mL 농도에서 각각 40.21 및 42.09 ng/mL, 200 μg/mL 농도
Fig. 2. Inhibitory effects of aloe vera and aloe vera adventitiousroot extracts on the production of nitric oxide in RAW 264.7 cells.
Untreated means lipopolysaccharide (LPS) not induced group;
LPS-induced means LPS-induced only group; AVE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera on LPS- induced cell; AVW means the group treated with distilled water (DW) extracts of aloe vera on LPS-induced cell; AVRE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera adventitious root on LPS-induced cell; AVRW means the group treated with DW extracts of aloe vera adventitious root on LPS-induced cell.
Data represent the mean±S.D. with three separate experiments.
Values with different alphabetical letters are significantly different at p < 0.05 (ANOVA with post-hoc by Duncan test).
Fig. 3. Effects of aloe vera and aloe vera adventitious root extracts on the production of matrix metalloprotease (MMP) of UV-B irradiated human dermal fibroblast (HDF). (a) Results of MMP-1 production (b) Results of MMP-3 production. AVE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera; AVW means the group treated with distilled water (DW) extracts of aloe vera; AVRE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera adventitious root; AVRW means the group treated with DW extracts of aloe vera adventitious root. Data represent the mean ± S.D. with three separate experiments. Values with different alphabetical letters are significantly different at p <
0.05 (ANOVA with post-hoc by Duncan test).
에서 각각 37.86 및 38.75 ng/mL였으며, AVE 및 AVRE의 MMP-1 단백질 생성량은 100 μg/mL 농도에서 각각 44.03 및 28.44 ng/mL, 200 μg/mL 농도에서 각각 32.38 및 17.93 ng/mL 이었다. MMP-1 단백질 생성 저해 활성은 200 μg/mL의 AVRE에서 가장 높게 나타났고, 65.11% 가량 단백질 생성량 이 감소하는 경향을 보이며 자외선 무처리군과 유사한 수준 을 보이는 것으로 확인되었다. 이를 통해 알로에 베라 부정 근의 에탄올 추출물이 MMP-1의 생성을 효과적으로 저해하 는 것을 확인할 수 있었다. AVW 및 AVRW의 MMP-3 단백질 생성량은 100 μg/mL 농도에서 각각 775.39 및 800.54 ng/mL, 200 μg/mL 농도에서 각각 770.04 및 752.63 ng/mL였으며, AVE 및 AVRE의 MMP-3 단백질 생성량은 100 μg/mL 농도 에서 각각 713.22 및 601.45 ng/mL, 200 μg/mL 농도에서 각 각 609.58 및 523.72 ng/mL이었다. MMP-3 단백질의 생성량 에 있어서도 AVE 및 AVRE의 200 μg/mL 처리 조건에서 각 각 21.38% 및 37.21%의 MMP-3 단백질 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 3(B)). 동일한 알로에 베라 부정근을 사용하였으나 물로 추출한 경우에는 이와 같은 MMP 단백 질의 생성 저해 효과가 확인되지 않았다. 반면에 알로에 베 라 부정근의 에탄올 추출물은 주름 생성 등의 외인성 피부 노화의 원인이 되는 MMP-1과 MMP-3 단백질의 생성을 효 과적으로 억제하여 피부 주름의 예방 및 개선에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
3.4. 프로콜라겐 단백질 합성 촉진 효과 분석 결과 피부상피세포 건조중량의 약 70-80%를 차지하는 주요 구성 성분인 콜라겐은 elastin 및 hyaluronic acid와 함께 피부의 탄 력 및 주름 관련 주요 성분으로 알려져 있다. 일반적으로 피 부에서 type I 콜라겐의 합성과 분해 효소의 하나인 MMP-1 의 활성이 균형을 이루고 있지만, 내외부적인 요인에 의하여 피부 노화가 진행되는 피부조직에서는 type 1 콜라겐의 합성 이 저하되고 MMP-1 효소 활성이 증가되는 것으로 알려져 있 다 [28]. 그러므로 콜라겐 합성 촉진 효능은 주름 방지를 위한 효과적인 방법이라 생각되고 있다. 알로에 베라 추출물 및 알 로에 베라 부정근 추출물이 콜라겐 생성에 미치는 영향을 확 인한 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 자외선 조사 처리한 인간 섬 유아세포의 type I 프로콜라겐 단백질 생성량은 220.53 ng/mL 으로 자외선 무처리군 (601.33 ng/mL)에 비해 생성량이 현저 하게 감소하였다. 감소된 type I 프로콜라겐 단백질 생성량은 AVRE 및 AVE를 200 μg/mL로 처리한 조건에서 각각 379.43%
및 261.47% 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나 MMP 단백 질의 생성 저해능 결과와 유사하게, AVW와 AVRW에서는 프 로콜라겐의 생성 증진 효과가 확인되지 않았다.
알로에 베라가 가지는 피부 건강 증진 효과에 대해서는 여 러 차례 보고되었으며 [29-31], Cho et al. [32]의 연구에서는 임상시험을 통해 알로에 베라 겔 섭취 시 주름 개선 및 탄력 성 증진 효과를 가지는 것을 확인하였다. 그러나 현재까지 알로에 베라의 안티에이징 효과에 대한 메커니즘은 규명된 바 없으며, 대부분 상처 치료 위주의 효능 연구가 진행되고
있다 [32]. 알로에 베라는 겔 및 껍질 표면에 다당체, 안트로 퀴논류, 비타민 등 300여 가지의 다양한 유효 성분을 함유하 고 있어서, 이들 성분이 복합적으로 피부에 기능하는 것으로 생각되었다 [7,8]. 따라서 알로에 베라의 부정근을 유도했을 시 피부 건강 개선 효과를 가지는 유효 성분이 다량으로 생 성되어, 일반 알로에 베라에 비해 더 높은 효과를 보인 것으 로 사료되었다. 또한, 식품의 추출 시 용매로써 물 단독 혹은 에탄올 단독으로 사용하는 것보다 물과 에탄올의 적절한 혼 합 용매를 사용하여 추출할 경우 식품 내의 수용성 성분과 지용성 성분을 복합적으로 녹이기 때문에 더 많은 유효성분 이 추출된다고 알려져 있다 [33-35]. Choi [36]의 연구에서 알 로에 베라 물 추출물과 알로에 베라 70% 에탄올 추출물의 collagen 및 elastin 생성량을 분석한 결과, 100 μg/mL 농도 조 건에서 collagen과 elastin 생성량 모두 70% 에탄올 추출물이 10-15% 가량 높은 수치를 가지는 것으로 확인되었다. 이때 collagen 과 elastin은 모두 피부 결합 조직 내에서 피부의 탄력 성 감소와 주름 형성을 방지하여 피부 노화도를 감소시키는 데 중요한 역할을 하였다 [37]. 따라서 알로에 베라 부정근을 70% 에탄올로 추출했을 때가 피부 건강 효과를 가진 유효성 분이 가장 많이 추출되고, 이에 따라 피부 주름 개선 효과를 나타내는 MMP-1 및 MMP-3 단백질 합성 저해 활성과 프로 콜라겐 단백질 합성 저해 활성이 가장 높게 나타난 것으로 사료되었다.
3.5. 멜라닌 합성 억제 활성 분석 결과
피부가 자외선에 노출되거나 호르몬 변화, 염증 또는 약제 Fig. 4. Effects of aloe vera and aloe vera adventitious root extracts on the production of type I procollagen of UV-B irradiated human dermal fibroblast (HDF). AVE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera; AVW means the group treated with distilled water (DW) extracts of aloe vera;
AVRE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe
vera adventitious root; AVRW means the group treated with DW
extracts of aloe vera adventitious root. Data represent the mean ±
S.D. with three separate experiments. Values with different
alphabetical letters are significantly different at p < 0.05 (ANOVA
with post-hoc by Duncan test).
등 여러가지 환경적 요인에 의해 멜라닌 합성이 촉진되면, 피부 노화가 촉진될 뿐만 아니라 색소 침착에 의한 기미나 주근깨를 형성하며 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.
그러므로 색소 침착 현상을 방지하고 미백효과를 얻기 위해 서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성 을 감소시켜야 한다 [38]. 미백활성 성분의 멜라닌 합성 억제 활성 시험의 경우, 세포독성에 의한 멜라닌 생성량 감소는 멜라닌 생성 과정에 대한 저해에 해당되지 않기 때문에 기본 적으로 대상 성분이 세포에 독성을 나타내거나 성장을 억제 하지 않아야 한다는 것을 전제로 한다. 따라서 본 실험에서 는 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근 추출물의 50, 100, 200 μg/mL 농도에서의 세포 독성 여부를 확인하였다. 그 결 과, 물과 에탄올 추출물 모두 B-16세포에 대한 세포 독성을 보이지 않았다 (Fig. 5(A)). 알로에 베라 및 알로에 베라 부정 근 추출물의 멜라닌 합성 저해 활성은 Fig. 5(B)에 나타내었
다. 알로에 베라와 알로에 베라 부정근 모두 물 추출물에서 는 멜라닌 합성 억제 활성이 없는 것으로 확인되었다. AVE 는 50, 100 및 200 μg/mL 농도 처리 조건에서 각각 0, 22.51 및 29.13%의 멜라닌 합성 억제 효과를 보였으며, AVRE는 50, 100 및 200 μg/mL 농도 처리 조건에서 각각 59.52, 75.68 및 83.77%의 멜라닌 합성 억제 효과를 보였다. 이와 같은 결 과를 통하여 멜라닌 합성 억제 활성은 물 추출물 보다는 에 탄올 추출물이, 알로에 베라 추출물 보다는 알로에 베라 부 정근 추출물이 더 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
3.6. Tyrosinase 억제 활성 분석 결과
Tyrosinase 는 멜라닌 색소 합성의 초기단계인 L-tyrosine에서 L-3,4-dihydroxyphenylalanine을 거쳐 L-dopaquinone으로 전 환되는 과정에 관여하며, 최종적으로 멜라닌 색소 생성에 관여 하는 효소이다. 특히 피부는 자외선에 노출되면서 tyrosinase의 작용으로 melanosome에서 멜라닌이 합성되어 피부 노화가 촉진되며, 색소 침착과 피부 흑화 현상의 원인이 된다 [6]. 상 기 실험을 통하여 알로에 베라 추출물 및 알로에 베라 부정 근의 추출물 중, 물을 이용하여 추출한 시료보다 에탄올을 이용하여 추출한 시료의 경우가 더 높은 멜라닌 합성 억제 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이에 본 연구진은 멜 라닌 합성에 필요한 효소 tyrosinase의 활성 여부를 확인하기 위해, 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근의 에탄올 추출물 의 tyrosinase 활성 저해능을 분석하였다 (Table 1). AVE 및 AVRE의 tyrosinase 활성 저해능은 각각 30.22 및 28.49%로, 두 시료 간에 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 이를 통해 알로에 베라 부정근의 70% 에탄올 추출물은 멜라닌 색소의 합성을 저해하는 능력이 우수하나, tyrosinase 효소의 활성 억제에 의한 효과가 아닌 다른 기작에 의한 효과임을 유추할 수 있었다. 이러한 결과는 Choung et al. [38]이 발표한 논문 과 유사하게, 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근은 kojic acid 나 arbutin과 같이 tyrosinase의 효소활성에 직접적으로 저해작용을 하여 멜라닌이 합성되는 것을 저해하는 것이 아 닌 melanoma 세포에 작용하여 tyrosinase의 활성을 억제시키 기 때문인 것으로 사료되었다.
3.7. DPPH 라디칼 소거 활성 분석 결과
노화의 원인은 생체 내에서 발생하는 hydroxyl radical (•OH), super oxide radical (O
2•-), hydroperoxyl radical (HO
2-), singlet oxygen (
1O
2), hydrogen peroxide (H
2O
2) 등과 같은 활성산소 Fig. 5. Effects of aloe vera and aloe vera adventitious root extracts
on the inhibitory activity of melanin synthesis. (a) Cell viability of aloe vera and aloe vera adventitious root extracts in B-16 melanoma cells. (b) Inhibition of melanin synthesis. AVE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera; AVW means the group treated with distilled water (DW) extracts of aloe vera; AVRE means the group treated with 70% ethanol extracts of aloe vera adventitious root; AVRW means the group treated with DW extracts of aloe vera adventitious root. Data represent the mean ± S.D. with three separate experiments. Values with different alphabetical letters are significantly different at p < 0.05 (ANOVA with post-hoc by Duncan test).
Table 1. Tyrosinase inhibition activity and DPPH radical scavenging activity of 70% ethanol extracts of aloe vera and aloe vera adventitious root.
Aloe vera Aloe vera adventitious root Tyrosinase inhibition
activity (%) 30.22 ± 5.46 28.49 ± 4.83 IC50 (μg/mL)a 162.53 ± 4.74 15.21 ± 3.68
a
IC50 values are calculated by linear plot obtained by DPPH assay.
종에 의한 산화적 대사 부산물에 기인할 수 있는데 [39], 이 런 활성산소종을 조절하는데 관여하는 물질로 여러 항산화 제가 존재한다 [40-42]. 이 중 DPPH 라디칼은 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 자유 라디칼로서, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성 을 측정한다. 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가 하지 않은 대조군의 흡광도를 절반으로 환원시키는데 필요 한 시료의 농도인 IC50으로 계산하였으며, 그 결과는 Table 1 에 나타내었다. AVE 및 AVRE의 IC50 값은 각각 162.53 및 15.21 μg/mL로 알로에 베라 부정근 추출물이 일반 알로에 베 라 추출물에 비해서 10배가 넘는 항산화 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
Lee et al. [43]의 연구에 따르면 알로에 베라 부정근을 유도 할 시 일반 알로에 베라에 비해 2차 대사산물이자 안트라퀴 논 성분인 aloe-emodin과 chrysophanol 함량이 10-13배 가량 증가되며, 우수한 항염증 활성을 가지는 것을 확인하였다.
그러나 알로에 베라의 유효성분 중 피부 미백에 효과적인 성 분으로 알려진 탄닌류 [44]의 함량을 알로에 베라와 알로에 베라 부정근 간에 비교한 선행 연구는 없었다. 그럼에도 불 구하고 본 연구에서는 알로에 베라 부정근 추출물이 알로에 베라 추출물에 비해 높은 멜라닌 합성 저해 활성과 항산화 활성을 가지는 것으로 확인되어, 후속연구를 통해 명확한 피 부 미백 성분의 규명이 필요할 것으로 사료되었다. 상기 결 과와 마찬가지로 알로에 베라 부정근을 70% 에탄올로 추출 했을 때 유효성분이 가장 많이 확인되었고, 이에 따라 피부 미백 효과를 나타내는 멜라닌 합성 저해 활성과 DPPH 라디 칼 소거 활성도 가장 높게 나타난 것으로 사료되었다.
4. CONCLUSION
본 연구에서는 식물 조직배양 기술에 의해 생산된 알로에 베 라 부정근을 이용하여 알로에 베라 부정근의 추출물이 알로 에 베라 추출물에 비해 높은 피부 주름개선 및 미백 효능을 가지는 것을 확인하기 위해 물 및 에탄올 추출로 나누어 in vitro 실험을 진행하였다. 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포 에 대한 알로에 베라 및 알로에 베라 부정근 추출물의 독성 을 평가한 결과 정상 세포와 유사한 생존율을 보이며 세포 독성을 보이지 않았다. NO 생성 저해 활성을 분석한 결과 200 μg/mL 알로에 베라 부정근 에탄올 추출물에서 NO 생성 량이 37.72%로 가장 큰 저해 활성을 보였다. MMP-1 및 MMP-3 단백질 합성 저해 활성 역시 200 μg/mL 농도의 알로 에 베라 부정근 에탄올 추출물에서 각각 65.11% 및 37.21%
로 가장 큰 저해도를 보였다. 주름 방지에 영향을 주는 type I 프로콜라겐 단백질 합성 효과를 분석한 결과, 알로에 베라 부정근의 에탄올 추출물은 자외선 조사 처리한 대조군에 비 해 379.43% 만큼 생성률이 증가된 것이 확인되었으며, 피부 미백 효과를 나타내는 멜라닌 합성 억제 활성 역시 200 μg/
mL 농도의 알로에 베라 부정근 에탄올 추출물에서 83.77%
의 억제율로 가장 높은 활성을 보였다. 그러나 tyrosinase 효 소 저해 활성은 보이지 않아 멜라닌 색소 합성 저해 시 tyrosinase 외에 다른 기작을 따르는 것으로 사료되었다. 항산 화도 분석을 위해 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 알로에 베라 부정근 추출물이 알로에 베라 추출 물에 비해 10배 이상의 활성을 가지는 것이 확인되었다. 또 한 전체적인 결과를 종합해 보았을 때 물 추출물에 비해 에 탄올 추출물의 생리활성이 더 높은 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 조직배양으로 생산된 알로에 베라 부정근 추출 물이 일반 알로에 베라 추출물에 비해 높은 생리활성을 가질 뿐 아니라, 높은 미백 및 주름 개선 효과를 가지는 것을 확인 하였다. 향후 후속 연구를 통하여 알로에 베라 부정근의 물 추출물 및 에탄올 추출물의 유효성분 분석을 통해 추출용매 별로 생리활성의 차이가 발생하는 기작을 명확히 규명하는 것이 필요할 것으로 사료되었다.
Acknowledgements
본 논문은 2018년도 한국산업기술진흥원의 재원으로 기술 개발 지원사업의 지원을 받아 수행된 연구임 (과제번호:
N0001395).
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