Received: 19 October 2020 / Revised: 6 November 2020 / Accepted: 7 November 2020

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Kluyveromyces marxianus 균주를 이용한 3-Hydroxypropionic acid 생산

박재범^1†, 강경곤^1,3†, 권덕호^1,2,3, 하석진^1,2,3*

Production of 3-Hydroxypropionic Acid by Engineered Kluyveromyces marxianus

Jae-Bum Park^1†, Kyoung-Gon Kang^1,3†, Deok-Ho Kwon^1,2,3, and Suk-Jin Ha^1,2,3*

Received: 19 October 2020 / Revised: 6 November 2020 / Accepted: 7 November 2020

© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus was applied for the production of 3-hydroxypropionic acid (3- HP), which is mainly used as a raw material for biodegrad- able polymers. The MCR (malonyl-CoA reductase) gene orig- inated from the Chloroflexus aurantiacus strain was introduced into the engineered K. marxianus 17555-JBP2 strain showing improved xylose utilization in the previous study to develop the engineered K. marxianus JBP2_MCR strain. At 40

^o

C, K.

marxianus JBP2_MCR strain produced 0.14±0.00 g/L of 3-HP using xylose as a sole carbon source. As a result of measuring the enzymatic activity of malonyl-CoA reductase, the engi- neered K. marxianus JBP2_MCR strain exhibited 4.71 times higher MCR enzymatic activity than the parent strain. When 1.28 g/L malonyl-CoA was added into media, 1.58±0.18 g/L of 3-HP was produced by K. marxianus JBP2_MCR strain for 120 h.

Keywords: Kluyveromyces marxianus, 3-Hyroxypropionate, malonyl-CoA, malonyl-CoA reductase

1. INTRODUCTION

Kluyveromyces marxianus는 열 내성을 가진 것으로 알려진 효모 중 하나로, 일반적인 효모에 비해 비교적 높은 온도에 서도 생육이 가능하다는 장점을 지니고 있다 [1,2]. 열 내성 균주를 이용할 경우 높은 온도에서 생육이 가능하기 때문에 냉각에 소모되는 비용을 감소시킬 수 있으며 오염에 대한 위 험이 줄어들 수 있다는 장점이 있고 열 내성 균주의 특성을 활용하여 바이오매스를 이용한 유용물질 생산 시 SSF (simultaneous saccharification and fermentation)공정을 활용한 생산수율 및 생산성 증가도 기대할 수 있다 [3]. K. marxianus 는 자일로스를 대사할 수 있어 목질계 바이오매스를 이용할 경우 기존의 균주보다 다양한 기질의 효율적인 이용이 가능 하다는 장점을 지니고 있다 [4,5]. 하지만 K. marxianus는 연 구된 기간이 비교적 짧기 때문에 유전자 정보와 유전자 편집 도구가 미흡한 상황이나 이를 해결하기 위해 유전공학적 접 근을 통해 K. marxianus 균주를 개량하려는 시도들이 계속되 고 있다 [6,7].

3-Hydroxypropionic acid (3-HP)는 고부가가치를 지닌 다양 한 상업용 복합체들을 만들 수 있는 기초 물질 중 하나이다 [8]. 특히 poly(3-HP)와 같은 생분해성 고분자를 만드는데 주 로 이용되며, 이렇게 생산된 폴리에스터의 경우 기존의 석유 기반 물질보다 생분해성이 우수하며 재생이 가능하다는 장 점을 지니고 있어 3-HP생산과 관련된 연구들이 활발하게 진 행되고 있다 [9,10]. 3-HP의 생산은 주로 생물학적 방법을 이 용해 진행되며 주로 Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae 등의 균주가 이용된다 [11,12]. K.

pneumonia 균주를 이용한 3-HP 생산의 경우, Coenzyme- B

₁₂

(Co-B

₁₂

) 를 필요로 하는 글리세롤 탈수과정에 의해 진행 된다 [13]. 또 다른 경로로 malonyl-CoA를 기질로 이용할 수

†

These two authors contributed equally.

1

강원대학교 생물공학과

1

Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

2

강원대학교 누룩연구소

2

Institute of Fermentation and Brewing, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

3

강원대학교 바이오헬스기기 융합기술 협동과정

3

Department of Biohealth-machinery convergence engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

Tel.: +82-33-250-62778; Fax: +82-33-243-6350 E-mail: sjha@kangwon.ac.kr

Research Paper

(2)

재하는 중간물질로 malonyl-CoA를 이용한 3-HP 생합성 경 로의 경우 추가적인 기질을 필요로 하지 않는다는 장점을 지 니고 있다 [14].

선행 연구에서 mutant KmXYL1 유전자를 이용하여 재조합 K. marxianus 17555-JBP2 균주의 자일리톨 생산성을 증대시 키기 위한 연구를 수행하였다 [15,16]. 본 연구에서는 K.

marxianus JBP2 균주를 이용한 3-HP생산 가능성 확인을 위 해 Chloroflexus aurantiacus 균주로부터 유래한 malonyl- CoA reductase 유전자를 K. marxianus 17555-JBP2균주에 삽 입하여 자일로스를 이용한 3-HP생산량을 확인하였다.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Malonyl-CoA reductase (MCR) 유전자의 과발현 Chloroflexus aurantiacus 균주로부터 유래한 malonyl-CoA reductase (MCR) 유전자를 K. marxianus 균주에 삽입하기 위 해 Integrated DNA Technologies, Inc. 의 홈페이지에서 제공 하는 Codon Optimization Tool을 이용하여 MCR 유전자의 코 돈 최적화를 진행한 후 마크로젠 (Seoul, Republic of Korea) 사에 의뢰하여 DNA합성을 진행했다. MCR 유전자를 확보 하기 위해 MCR_F_SpeI(5’-GGACTAGTATGAGCGGGAC AGGCA-3’), MCR_R_XhoI(5’-CCGCTCGAGTTATACGGTTA TGGCTCTACCACG-3’) primer를 이용하여 PCR을 통한 유 전자 증폭을 진행하였다. 이후 확보한 유전자들을 제한효소 를 이용하여 pJSKM316-GPD 벡터에 유전자를 삽입한 후 ScURA3_F(5’-TTCAATT CAATTCATCATTT-3’)와 CYC_R (5’-GGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3’)primer를 이용하여 MCR 그리고 CYC-terminator유전자를 포함한 DNA cassette를 PCR을 통해 증폭하였다. K. marxianus 17555-JBP2 균주에 MCR 유전자를 포함한 DNA cassette를 삽입하기 위해 Ez- Yeast Transformation Kit (MP biochemicals, California, USA) 를 사용하였으며, 형질전환 이후 MCR 유전자를 포함한 DNA cassette가 삽입된 균주를 선별하기 위해 uracil이 결여 된 합성배지에 도말 한 후 30

^o

C 온도조건에서 3일간 배양하 여 선별하였다.

2.2. 효모 전배양 및 플라스크를 이용한 발효

효모의 전배양은 SC 배지 (Synthetic complete medium, Yeast nitrogen base without amino acids and with ammonium sulfate: 6.7 g/L) 를 사용하였으며 glucose 20 g/L를 첨가하여 사용하였다. 접종에 사용한 균주는 −80

^o

C에서 glycerol stock 방법으로 보관한 균주를 사용하였으며, SCD

20

배지에 1% 농 도로 접종하여 200 rpm, 30

^o

C 조건으로 전배양을 진행하였 다. 전배양 후 대수기에 회수하여 멸균 증류수로 2회 세척하 여 본배양에 이용하였다. 3-HP 생산을 위한 발효실험을 위해 250 mL 삼각 플라스크에 자일로스 80 g/L가 첨가된 50 mL의 SCX

₈₀

배지를 사용하였다. 배양액의 pH를 유지하기 위해

속도와 30

^o

C 또는 40

^o

C 온도조건에서 발효를 진행하였다.

2.3. 효소활성측정

효소활성 측정에 사용된 효모들은 YPD

20

배지에서 200 rpm, 30

^o

C 조건으로 배양한 후 멸균증류수로 2회 세척하고 50 mM PBS를 첨가하여 초음파 균질기 (Sonics & Materials INC., Newtown, CT, USA)로 효모를 파쇄하였다. 세포파쇄는 70%

amplitude 에서 pulse on 5초, pulse off 15초 조건으로 30분간 진행하였다. 효모 파쇄 후 4

^o

C, 10,000 x g 조건으로 5분간 원 심 분리 처리한 후 분리된 상등액을 이용하여 단백질 정량 및 효소 활성 측정을 진행했다. 단백질 정량은 bicinchoninic acid (BCA)을 이용하여 진행하였다. 기질로 사용되는 malonyl- CoA를 0.3 mM농도로, 그리고 조효소로 이용되는 NADPH 를 0.3 mM농도로 사용하여 반응을 진행하였으며, 30

^o

C와 340 nm파장에서 NADPH의 흡광도 감소량을 측정하여 감소 폭을 산출해 계산하였다.

2.4. 분석방법

효모의 성장은 600 nm 파장에서OD값을 UV-visible spectropho- tometer (Biomate 5, Thermo, NY)를 이용하여 측정했다. 배양 중 대사물질 (자일로스, 자일리톨, 에탄올) 분석은 high- performance liquid chromatography (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) column (Phenomenex Inc., Torrance, CA)을 부착하 여 분석을 수행했다. 분석 조건은 HPLC에 부착되어있는 RID (refractive index detector) 를 이용했으며 용매는 0.005 N H

₂

SO

₄

를 사용했고 50

^o

C조건에서 분당 0.6 mL의 용매를 사용 하는 조건으로 분석을 진행했다. 배양액의 3-HP를 분석하기 위해 HPLC Chromaster (Hitachi, Japan)와 TSKgel G3000SWXL HPLC Column을 이용하여 분석을 수행하였으며, DAD (diode array detector) 를 이용하여 207 nm파장으로 분석하였다. 용 매로는 메탄올 (Sigma Aldrich, MO, USA) 5%, phosphoric acid 0.05%를 이용하였으며 30

^o

C조건에서 분당 0.8 mL의 용 매를 사용하는 조건으로 분석을 진행하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 재조합 K. marxianus JBP2_MCR균주의 3-HP 생합 성 확인

이전 연구에서 K. marxianus 17555-JBP2 균주는 자일로스로

부터 자일리톨 생산성을 증대 시키기 위해 개량된 균주이므

로 이와 같은 특성을 이용하여 자일로스로 부터 3-HP생산성

을 확인하는 연구를 수행하였다. K. marxianus 17555-JBP2

균주의 자일로스 소비 및 자일리톨 생산량이 배양 온도가 증

가함에 따라 증가한다는 것을 확인하였기 때문에 30

^o

C 와

40

^o

C 두 가지 온도 조건으로 배양을 수행하였으며, 배양을

위한 배지는 효모 배양에 사용되는 SC (synthetic complement)

(3)

배지에 자일로스를 80 g/L의 농도로 첨가하여 사용하였다.

배양온도를 30

^o

C로 조절하여 3-HP 생산성을 확인해본 결과 모균주인 K. marxianus 17555-JBP2는 배양 120시간에 61.00 ± 1.09 g/L의 자일로스를 소비하고 23.99 ± 0.88 g/L의 자일리 톨을 생합성하였으나 3-HP와 에탄올의 생합성은 확인되지 않았다. 반면에 재조합 균주인 K. marxianus JBP2_MCR 균 주는 자일로스 소비와 자일리톨 생합성은 거의 유사하였고 에탄올의 생합성 또한 없었으나 0.10 ± 0.00g/L의 3-HP를 생 산하였다 (Fig. 1). 배양 온도를 40

^o

C로 증가하여 3-HP생산성 을 확인한 결과 모균주의 자일로스 소비와 자일리톨 생합성 속도는 현저히 증가하였으나 여전히 3-HP를 전혀 생산하지 못한 반면 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주는 유사한 수준의 자일로스 소비와 자일리톨 생합성을 확인하였으며 30

^o

C 와 마찬가지로 에탄올의 생합성은 없었으나 3-HP생산 량이 0.14 ± 0.00 g/L로 증진된 것을 확인할 수 있었다.

3.2. 모균주와 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주의 MCR 효소활성 비교

재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주의 3-HP생산량이 0.14

± 0.00 g/L로 비교적 낮은 이유는 도입된 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자가 효과적으로 발현이 되지 않았거나 효

소활성이 낮기 때문이라고 예측하였다. 따라서 이를 확인하 기 위해 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자가 발현된 K. marxianus JBP2_MCR 균주와 모균주의 MCR 효소활성을 비교하였다. 효소 활성을 측정하기 위해 malonyl-CoA를 기 질로 사용했으며, 조효소로 첨가한 NADPH의 흡광도 감소 폭을 측정하여 효소의 활성을 간접적으로 확인하였다. 그 결 과 기질로 사용된 malonyl-CoA를 첨가하지 않은 음성 대조 군 (open symbol)의 경우 모균주와 재조합 K. marxianus JBP2_

MCR 균주 모두 흡광도가 소폭 감소하였으며 감소폭은 거의 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 반면에 malonyl-CoA 를 기질로 첨가하여 효소활성을 측정해본 결과 모균주의 효소활성에 비해 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주의 효소활성이 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

NADPH 의 감소량을 측정하고 cell extract의 단백질 농도를 측정한 결과, 모균주의 경우 1.26 ± 0.02 µmol/min·mg의 MCR 효소활성이 나타낸 반면, 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주의 경우 약 4.71배 증가한 5.93 ± 0.02 µmol/min·mg의 MCR 효소활성을 나타내었다. 이러한 효소활성의 증가는 본 연구에서 삽입한 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자가 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주에서 효과적으로 발현 되어 효소활성을 갖기 때문이라고 사료된다.

Fig. 1. Comparisons of 3-HP production by the parental strain at 30

^o

C and 40

^o

C (A and B) and the engineered K. marxianus JBP2_MCR

strain at 30

^o

C and 40

^o

C (C and D). Symbols; xylose ( ○), xylitol (△), and 3-HP (●).

(4)

3.3. Malonyl-CoA를 기질로 이용한 경우 3-HP 생합성 증 가 확인

재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주에 도입된 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자가 효과적으로 발현되어 효소활성 을 갖고 있음이 확인되었으므로 3-HP 생합성량의 농도가 낮 은 원인은 세포 내부의 malonyl-CoA 농도가 낮기 때문이라 고 예측하였다. 이러한 문제의 원인을 확인하기 위해 malonyl- CoA를 기질로 첨가하여 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균 주의 3-HP 생산량을 확인하였다. 이전과 동일한 SCX

80

배지에 0 g/L (0 mmol/L), 0.85 g/L (1.0 mmol/L), 1.28 g/L (1.5 mmol/L) 의 농도로 malonyl-CoA를 첨가하여 배양을 수행하였다 (Fig.

3). Malonyl-CoA를 0.85 g/L 농도의 첨가한 경우 배양 120시 간에 1.24 ± 0.3 g/L의 3-HP를 생산하였으며, 1.28 g/L 농도의 malonyl-CoA를 첨가해준 경우엔 1.58 ± 0.18 g/L의 3-HP를 생산하였다. 배양결과 malonyl-CoA를 기질로 첨가한 경우 3-HP의 생합성 농도가 크게 증가하는 것을 확인 할 수 있었 다. 따라서 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주에 삽입한 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자는 효과적으로 발현 되어 효소활성을 갖는 것으로 사료되지만 다만 3-HP의 전구 물질인 malonyl-CoA의 세포 내부 농도가 낮아 3-HP의 생합 성 농도가 낮게 생산된 것이라 판단하였다. 따라서 이를 해 결하기 위해서는 malonyl-CoA의 생합성을 증가시키기 위한 발효조건을 탐색하거나 또는 acetyl-CoA로부터 malonyl- CoA를 생합성하는데 관여하는 acetyl-CoA carboxylase (ACC) 를 추가로 도입하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

4. CONCLUSION

내열성 효모인 K. marxianus를 이용하여 생분해성 고분자의

원료로서 주로 이용되는 3-HP를 생합성하기 위한 연구를 수 행하였다. 이전 연구에서 개발된 자일로스의 이용이 증가된 재조합 K. marxianus 17555-JBP2 균주에 C. aurantiacus 균주 유래의 MCR 유전자를 도입하여 재조합 K. marxianus JBP2_

MCR 균주를 개발하였다. 자일로스를 기질로 하여 40

^o

C 온 Fig. 2. Enzymatic assay of malonyl-CoA reductase (MCR) by the

parental strain (square) and the engineered K. marxianus JBP2_

MCR strain (circle) with (closed) or without (open) malonyl-CoA as a substrate.

Fig. 3. Enhanced 3-HP production by the engineered K.

marxianus JBP2_MCR strain with addition of malonyl-CoA as a

substrate. 0.0 mmol (A), 1.0 mmol/L (B), or 1.5 mmol/L (C) of malonyl-

CoA was added. Symbols; xylose (○), xylitol (◇), 3-HP (●), and

OD(A6

₀₀

) (□).

(5)

도조건에서 K. marxianus JBP2_MCR 균주는 0.14 ± 0.00 g/L 의 3-HP를 생산하는 것이 확인되었다. 비교적 낮은 3-HP 생 합성의 원인을 찾기 위해 MCR의 효소 활성을 측정한 결과, 재조합 K. marxianus JBP2_MCR 균주가 모균주에 비해 4.71 배의 높은 MCR 효소활성을 갖는 것을 확인하였다. 따라서 K. marxianus JBP2_MCR 균주의 낮은 3-HP 생합성의 원인 은 세포 내부의 낮은 malonyl-CoA 농도라고 판단되어 기질 로 1.28 g/L의 malonyl-CoA를 추가한 결과 배양 120시간에 1.58 ± 0.18 g/L 의 3-HP를 생산할 수 있었다.

Acknowledgements

본 연구는 2019년도 한국연구재단 이공분야기초연구사업 (NRF-2019R1F1A1055315)의 지원을 받아 수행됨. 그리고 본 연구는 2020년 대학혁신지원사업 도전 연구비지원 프로 그램의 지원을 받아 수행됨.

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