Korean Chemical Engineering Research

D-tryptophan과 N-CBZ-D-phenylalanine의 분리에서 이온성 액체의 영향

김은철·정금주·Yulia Polyakova·구윤모·노경호^† 인하대학교생명화학공학부, 초정밀생물분리기술연구센터

402-751 인천시남구용현동 253 (2006^년 1^월 18^일접수, 2006^년 6^월 16^일채택)

Influence of Ionic Liquid for Separation of D-tryptophan and N-CBZ-D-phenylalanine

Yinzhe Jin, Jinzhu Zheng, Yulia Polyakova, Yoon Mo Koo and Kyung Ho Row^† Center for Advanced Bioseparation Technology, Chemical Engineering & Biotechnology, Inha University,

253, Yonghyun-dong, Nam-gu, Incheon 402-751, Korea (Received 18 January 2006; accepted 16 June 2006)

요 약

두개의 D-^{아미노산물질을분리함에있어서이온성액체의영향을고찰하였다}. ^{아미노산물질로서} D-tryptophan^과 N-CBZ-D-phenylalanine^{을사용하였으며}, ^{이온성액체로서} 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate([BMIm]⁺ [BF4]⁻)^{을사용하였고}, ^{역상액체크로마토그래피로분석하였다}. ^{이동상은각각} 65^％, 70^％, 80^{％메탄올을주성분으로} 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0^과 15.0 mmol/L^{의농도의이온성액체를첨가하였고}, ^칼럼(3.9×300 mm)^에 15^µm^{의입자크기를가진} C18 실리카겔을충진하여사용하였다. ^{이온성액체를첨가함으로써} D-tryptophan^의체류

인자는거의변화가없었지만, N-CBZ- D-phenylalanine^{의체류인자는감소하였다}. ^{두물질의분리도는메탄올의함량}

과이온성액체의농도에따라변화하였다. ^{메탄올의함량이낮을수록}, ^{이온성액체의농도의증가에따라서분리도는}

증가하는경향을나타내었다.

Abstract − D-tryptophan and N-CBZ-D-phenylalanine were separated using ionic liquid as additives for the mobile phase in high performance liquid chromatography (HPLC). The ionic liquid of 1-butyl-3- methylimidazolium tetraflu- oroborate ([BMIm]⁺[BF4]⁻) was used. Mobile phases were 65％, 70％, and 80％ methanol in water with addition of dif- ferent concentrations (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, and 15.0 mmol/L) of the ionic liquid. The experiments were performed on stainless steel column, 3.9×300 mm i.d., packed with 15µm octadecyl-bonded silica gel at labora- tory. The retention factor of D-tryptophan was not negligibly changed while that of N-CBZ-D-phenylalanine was decreased. The resolution between the two components were affected by the contents of methanol and ionic liquid in the mobile phase. With the small content of methanol and the high concentration of ionic liquid, the resolution was improved.

Key words: D-tryptophan, N-CBZ-D-phenylalanine, Ionic Liquid, Retention Factor, Resolution

1. 서 론

이온성액체는유기양이온과각종음이온을결합한염으로써상

온에서액체상태로존재하며, 100℃이하의녹는점을가지고있다[1].

상온에서액체로존재하는이온성액체를상온이온성액체(room

temperature ionic liquid, RTIL)라하며, 양이온으로서는 dialky- limidazolium, alkylpyridinium, tetraalkylammonium, 1-alkyl-3-me- thylimidazolium, N-alkylpyridinium, 1-butyl-3-methylimidazolium, 1-hexyl-3-methylimidazolium, 1-methyl-3-hexylimidazolium, 1-ethyl-3- methylimidazolium, 1-hexyl-3-heptyloxymethylimidazolium, N-alkyl-

N- methylmorpholinium 등이있으며, 음이온으로는 BF4−, CH3COO⁻, NO3−, SbF6−, F6O4S6−, PF6−, COO⁻, CN⁻, CH3SO4−, PhSO3−, (CF3SO2)2N⁻, Al2Cl7−, AlCl4−, CH3CH(OH)CO2−OH⁻, CF3SO4−, CF3SO3−, CF3CO2−등이있다. 이온성액체는비휘발성, 높은이온 전도성, 비가연성, 높은열안정성과높은극성을가지고있고, 낮 은증기압, 넓은액체범위와좋은전기적특성을가지고있으며, 쉽 게재생한다. ^{이러한특성을가진이온성액체는촉매}, ^{초임계유체},

전기영동, 고체상추출, 액체크로마토그래피, 기체크로마토그래피 등방면에널리사용된다[2-9]. [BMIm]⁺[BF4]⁻는일반적으로역상 액체 크로마토그래피에 사용되는 이온성 액체로서 분자식은

C8H15BF4N2이고, ^분자량은 226.0^이며, ^{녹는점은−}75^oC, ^물과알콜

에잘용해되며, 상온에서의밀도는 1.17 g/cm³로써물과메탄올의

†To whom correspondence should be addressed.

E-mail: rowkho@inha.ac.kr

밀도보다높다.

분자중에아미노기(-NH2)와카르복실기(-COOH)를가지는화합 물을아미노산이라하며천연에존재하는대부분의단백질은 20여 종류의아미노산으로구성되어있다. Phenylalanine과 tryptophan은 필수아미노산인동시에방향족아미노산이며, ^{중성아미노산이다}[10].

Phenylalanine은일반적으로콩과식물의종자나어린눈속에서유

리상태로존재하며, 방향족 α-아미노산이다. L-phenylalanine은모 든알에 5.4％, 탈지유에 5.1％함유되어있으며, 생체내에서비가 역적으로히드록실화되여티로신이된다. D-phenylalanine^은폴리펩

타이드성항생물질인그라미시딘S, 티로시딘, 바시트라신등의 구성성분으로써 단백질 중에는 존재하지 않는다. N-CBZ-D- phenylalanine은 이러한 phenylalanine의 유도체이고, 분자식은

C17H17O4N^{이며분자량은} 299.3 g/mol^이다. Tryptophan^{은대부분의}

단백질이가수분해되면얻어지는소량의(2％이하) 아미노산으로 서결핍시사람에게펠라그라를유발시키는비타민인니아신(니코 틴산)의생합성에매우중요하다. 폴리페놀(polyphenol)과아미노산

의일종인트립토판(tryptophan)은알레르겐의장내흡수억제효과

가있으며, ^{세균의성장에필수적이고}, tryptophan^{을함유하는모든}

단백질을합성하는데필요하므로 tryptophan의공급이부족하면세

포는이것을합성해야한다. Tryptophan 생합성은합성과정을촉매

하는효소의합성과효소의활성양쪽에모두영향을주는기구에 의해조절된다. D-tryptophan^{의분자식은} C11H12N2O2이며분자량은

204.2 g/mol이다.

생체내에서 D-아미노산은미생물의세포벽이나생리활성물질등 의구성성분으로존재하며, 고부가가치의약품합성중간물질로사 용되고있는방향족 D-^{아미노산의용도도다양하다}. ^이러한 D-^아미

노산을제조및합성함에있어서순수한약효를위하여개개의아

미노산에대하여분리및정제가필요하다. Armstrong 등은주로키

랄고정상칼럼을사용하여여러가지아미노산의분리에대하여

많은연구를수행하여왔다[11-13]. ^또한, ^{많은연구자들이이온성}

액체가분리메커니즘에서의작용에대하여연구하여왔다[6, 8, 14].

본연구에서는역상 크로마토그래피의 C18칼럼을사용하여

tryptophan과 N-CBZ-D-phenylalanine을분리함에있어서이온성액 체인 [BMIm]⁺[BF4]^{−를사용하여이동상중에서일어나는이온성}

액체의작용을조사하였다.액체크로마토그래피의이동상중에메 탄올함량의증가와이온성액체인 [BMIm]⁺[BF4]⁻의농도가다름 에따라나타내는칼럼의압력, 이론단수및 D-아미노산의체류인 자, ^선택성, ^{분리도등분리특성을고찰하며}, ^{적합한농도의이온성}

액체를사용함으로써최적의분리조건을찾는것이본연구의목적 이다.

2. 실 험 2-1.시약

본연구에사용된이온성 액체인 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([BMIm]⁺[BF4]⁻)^는 99.99^{％의순도를가지며}, C-tri (Namyang, Korea)에서 구입하였다. N-CBZ(carbobenzyloxy)-D- phenylalanine과 D-tryptophan은 Sigma(St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였으며, 모든시료들은 HPLC에주입하기전에막여과지(0.2µm, Waters Co.)^{를이용하여여과를하였다}. Potassium nitrate (KNO3)^는 Kanto 화학(Japan)에서, Hydrochloric acid(HCl)는 Junsei 화학(Japan)에

서구입하여사용하였다. ^메탄올은 HPLC^{용용매로덕산화학}(Ansan,

Korea)에서구입하였고, 이동상에사용된물은 2차증류수로서감압

펌프(Division of Millipore, Waters)와필터(HA-0.45µm, Division of Millipore, Waters)를이용하여여과한후헬륨가스를이용하여 용존산소를탈기후사용하였다.

2-2. 기기

분석용 HPLC 장치는 Waters 515 multi-solvent delivery system, 486 tunable absorbance analytical detector, Rheodyne injector (20^µl sample loop)를포함한 Waters model 600S liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U. S. A.)를사용했다. HPLC에서 얻은 chromatography는 데이터 수집 장치(Chromate Ver. 3.0, Interface Eng. Korea)^{를통해서얻었다}.

2-3. HPLC분석

분석용 HPLC 칼럼(3.9×300 mm)을사용하였으며, 15 µm의 C18

실리카겔을충진하여사용하였다. ^{주입부피는} 10 ^µl^로하였고, ^유

속은 1.0 ml/min로고정하였다. UV 검출기의파장은 254 nm로고 정하였다. 이동상은 70％의메탄올이동상에 0.5~15 mmol/L의서 로다른농도의 [BMIm]⁺[BF4]⁻를첨가하여측정하였다. 칼럼온도 는칼럼오븐을사용하여약 22 ^oC로고정하였으며, 이동상의 pH

는 HCl^{를사용하여약} 3.0^{으로고정하였다}. C18을고정상으로한액 체크로마토그래피시스템에서이두 D-아미노산의체류인자는다 음과같은식으로계산하였다.

k = (t−t0)/t0 (1)

여기서, t는화합물의체류시간을표시하고, t0는칼럼에체류되지 않는물질의체류시간이다. ^{선택도혹은선택성은다음과같은식}

으로계산하였다.

α= k1/k2 (2)

여기서 k1과k2는각기두아미노산의체류인자를나타낸다. 칼럼 의고정상에대한머무름시간을측정하기위하여 0.1％ KNO3용액 을공극표시물(void marker)^{로하여측정하였다}. ^{측정한결과}, ^칼럼

의고정상에대한머무름시간은약 t0=1.55분이었다. 일반적으로

칼럼의효율은이론단수(N)에의하여표시된다.

N = 16^×(tR/W)² (3)

여기서 tR은체류시간을나타내고 W는피크의너비이다. 분리도 는아래와같은식으로계산하였다.

R = 2^×(tR2−tR1)/(w1+ w2) (4)

여기서 tR1 과tR2는각각두화합물의체류시간을표시하고 w1과

w2는각각피크의너비를나타낸다.

3. 결과 및 고찰

D-아미노산을분리함에있어서이동상중에첨가된이온성액체 가분리특성에미치는영향을고찰하였다. 0.5~15 mmol/L인여러 농도의이온성액체를 65^％, 70^％, 80^{％메탄올을주성분으로하는}

이동상중에첨가하고 HCI^로 pH^를 3.0^{으로고정하였다}. ^두가지목

적물질인아미노산및아미노산의유도체의구조식을 Fig. 1로나 타내었으며, ^{본연구에사용된이온성액체인} [BMIm]⁺[BF4]^−의구

조식도함께나타내었다. 각물질에대한분자식및분자량은서론 부분에서언급하였다.

Fig. 2^에서는 65^{％메탄올이주성분인이동상중에서이온성액}

체의여러농도에따른크로마토그램을나타내었다. 65％메탄올을 이동상으로하였을때에 D-tryptophan과 N-CBZ-D-phenylalanine은 전혀분리가되지않았지만, 소량의농도인 0.5 mmol/L의 [BMIm]⁺ [BF4]^{−가첨가됨으로하여분리가되기시작하며}, 1 mmol/L ^이상으

로부터는완전한분리가된다는것을알수있다. 이온성액체의농 도가증가함에따라 D-tryptophan과 N-CBZ-D-phenylalanine의분 리도는증가하는경향을나타내었고, 2.0 mmol/L 이상의이온성액

체가첨가됨에따라분리도는거의 1.5 ^{이상으로비슷하게나타낸}

다는것을알수있었다. 이온성액체는두가지 D-아미노산의분 리도를증가시켜주는영향을준다는것을알수있다. 또한, 이온성 액체는극성이크므로쉽게대상물질의극성그룹과결합을하며 피크의 tailing^과피크의 broadening^{을감소시키고칼럼의이론단수}

를증가시킬수있다.

Fig. 3에서는 70％메탄올이주성분이이동상중에서이온성액

체의여러농도에따른크로마토그램을나타내었다. 전혀분리가되 지않던두 D-아미노산이이온성액체의첨가로하여역시분리가 되었으며이온성액체의농도가증가함에따라분리도가증가되는 것을알수있었다. 일반적으로칼럼은여러차례의실험을통하여

Fig. 1. Chemical structures of N-CBZ-D-phenylalanine, D-tryptophan and [BMIm]⁺[BF4]⁻.

Fig. 2. Chromatograms of N-CBZ-D-phenylalanine and D-tryptophan with a mobile phase containing different concentration of [BMIm]⁺[BF4]⁻ at pH=3.0. 1:D-tryptophan; 2:N-CBZ-D-phenylalanine(MeOH/H2O=65/35 vol.^％ with different concentrations of ionic liquid, 1 ml/min, 10 ^µl injection volume, 254 nm).

불순물이증가하면서압력이증가하기마련이다. 70％메탄올이주 요한이동상일때, ^{이온성액체의농도가증가함에따라압력은} 1,700 psi에서 1,600 psi로감소하는경향을나타내었다. 이동상중 의메탄올과물보다밀도와점도가큰이온성액체가증가함에따 라쉽게고정상과이온결합을형성하여메탄올과물의체류시간을감 소시킨다. ^{이온성액체의농도가상대적으로작기때문에총체적인}

체류시간을감소시키고압력을감소시킨다. 이는이온성액체가이 동상에머물러있으면서이온성액체의양이온이역상실리카겔과 흡착함으로써실라놀그룹의손상을보호해줄것이라고생각되어 진다[15].

Fig. 4에서는 80％메탄올이주성분이이동상중에서이온성액

체의여러농도에따른크로마토그램을나타내었다. 80％메탄올을 이동상으로하였을때, N-CBZ-D-phenylalanine과 D-tryptophan은 약간의분리경향을나타내었다. 2.0 mmol/L^부터 8.0 mmol/L ^농도

의 이온성 액체를 첨가함으로써 N-CBZ-D- phenylalanine과

D-tryptophan은전혀분리가되지않았다. 이것은메탄올의함량이

너무많아 N-CBZ-D-phenylalanine의체류시간을감소시킴으로써

두가지 D-^{아미노산이너무일찍용출되어분리가되지않기때문이}

다. 10.0 mmol/L ^{이상의이온성액체가첨가됨에따라} N-CBZ-D- phenylalanine과 D-tryptophan의분리도는증가하는경향을나타내

었다. 이온성액체의농도가 10.0 mmol/L 이상이되면서극성이낮 은메탄올의작용을점차대체하면서분리도를증가시키기때문이 다. 15.0 mmol/L 농도의이온성액체를첨가한 80％메탄올이동상에 서두가지 D-아미노산의분리도는 0.91이었지만분리도가 65％, 70％메탄올을주성분으로한이동상보다낮았기에더큰농도의이 온성액체를첨가한실험을수행하지않았다.

극성기능성그룹을가진산성물질은크로마토그래피에서낮은 칼럼이론단수를가진다[15]. 65％메탄올의이동상에 0.5 mmol/L

부터 15.0 mmol/L 농도의이온성액체를첨가함으로써 D-tryptophan

의이론단수는감소하였지만, N-CBZ-D- phenylalanine^{의이론단수}

는증가하는경향을나타내었다. 65％메탄올의이동상중에여러 농도의이온성액체를첨가함으로써이론단수는 31에서 86사이였 으며농도가증가함에따라두가지아미노산이론단수의차이는 증가하는경향을나타내었다. 70^{％메탄올의이동상중에이온성액}

체를첨가함으로써 D-tryptophan의이론단수는크게변화하지않았 으며, 이온성액체의농도가증가함에따라이론단수는 44에서 57

사이에존재하였으며크게변화되지않았다. 반면에, 이동상중에

2 mmol/L^{의이온성액체를첨가함으로써} N-CBZ-D-phenylalanine

의이론단수는 45^에서 51^{로증가하였으며}, ^{농도가증가함에따라}

이론단수도증가하였다. 70％의메탄올을이동상으로사용하여상

Fig. 3. Chromatograms of N-CBZ-D-phenylalanine and D-tryptophan with a mobile phase containing different concentration of [BMIm]⁺ [BF4]⁻ atpH=3.0. 1:D-tryptophan; 2:N-CBZ-D-phenylalanine(MeOH/H2O=70/30 vol.％ with different concentrations of ionic liquid, 1ml/min, 10 ^µl injection volume, 254 nm ).

술한두가지 D-아미노산을분리하는데있어서아주낮은이론단수 를가졌다. 이온성액체의농도를증가함에따라이론단수를증가 할수있으며, ^{이론단수가 증가한다는 것은 피크의} tailing^과

broadening을감소하고칼럼의효율을증가시킬수있다는것을설

명한다. 80％의메탄올을이동상으로하여이온성액체를첨가하였 을때, N-CBZ-D-phenylalanine과 D-tryptophan의이론단수는증가 하는경향을나타내었으며, 23^에서 61^{사이의낮은분리도를나타내}

었다. N-CBZ-D-phenylalanine과 D-tryptophan의이론단수는거의 비슷한값을가졌으며, 이온성액체의농도의증가와함께증가하 는경향을나타내었다.

Fig. 5^{에서는이온성액체의농도에따른체류인자의변화를나}

타내었다. 65％메탄올이주성분인이동상중에이온성액체를첨 가함으로써 N-CBZ-D- phenylalanine의체류인자는 4.1에서 4.4사 이의일정한값을가졌다. 반면에, D-tryptophan의체류인자는이온 성액체의농도가증가함에따라급격히감소하였다. 0.5 mmol/L^의

이온성액체를첨가함으로써 D-tryptophan의체류인자는 4.1에서

2.1로감소하였으며, 15.0 mmol/L의이온성액체를첨가하였을때

Fig. 4. Chromatograms of N-CBZ-D-phenylalanine and D-tryptophan with a mobile phase containing different concentration of [BMIm]⁺[BF4]⁻ at pH=3.0. 1:D-tryptophan; 2:N-CBZ-D-phenylalanine(MeOH/H2O=80/20 vol.％ with different concentrations of ionic liquid, 1ml/min, 10 ^µl injection volume, 254 nm).

Fig. 5. Effect of concentration of ionic liquids on retention factor.

에는 1.2^{로감소하였다}. N-CBZ-D- phenylalanine^과 D-tryptophan^의

선택성도 1.0에서부터 3.5로증가하였다. 70％의메탄올이주성분인 이동상중에서도마찬가지로이온성액체를첨가하면 D-tryptophan

의체류인자는 3.3에서 1.4로급격히감소하였지만, N-CBZ-D- phenylalanine^{의체류인자는} 2.9^에서 3.0 ^{사이로서거의변화가없었}

다. 이온성액체의농도가증가함에따라 D-tryptophan의체류인자 는 1.4에서 1.1로차츰감소하는경향을나타내었다. 반면에 N-CBZ- D-phenylalanine의체류인자는거의변화가없었다. 이온성액체는

D-tryptophan^{의체류인자를감소함으로써} D-tryptophan^과 N- CBZ-

D-phenylalanine사이의체류시간의차이를내여분리도를증가할수

있었다. 이동상중에이온성액체 2.0 mmol/L을첨가함으로써 D-아 미노산의선택성은 0.9로부터 2.1로급격히증가하였으며, 이온성 액체의농도가증가함에따라증가하였다. ^{이온성액체의농도가} 12.0 mmol/L일때, D-아미노산의선택성은 2.6으로써가장높았다. 80％의메탄올을이동상으로하였을때, 2.0 mmol/L부터 8.0 mmol/L

의이온성액체를첨가함으로서두가지 D-아미노산의체류인자는 감소하는경향을나타내었으며, 10.0 mmol/L 농도이상의이온성 액체를첨가함에따라 N-CBZ-D-phenylalanine^{의체류인자가증가}

하였다.

상대적으로낮은극성을가진메탄올의높은함량으로하여두 가지아미노산의체류시간이단축되었다. 이온성액체의농도가증 가함에따라, ^더욱이 10.0 mmol/L ^{농도이상에서부터큰극성을가}

지는이온성액체의작용으로인하여다시금 N-CBZ-D-phenyl-

alanine의체류인자를증가시켰다. 이온성액체의양이온부분과분

석물질의극성을가진부분이역상실리카겔과의경쟁흡착으로극 성화합물이비극성화합물에비해이온성액체와상호작용을더 많이함을알수있다.

선택성도체류인자의변화와마찬가지로 10.0 mmol/L 농도이상 에서부터증가하는경향을나타내었다. 80％메탄올에 15.0 mmol/L

의이온성액체를첨가하였을때, ^이두가지 D-^{아미노산에대한선}

택성은 1.6이었다. 기존의고성능액체크로마토그래피에서는칼럼 에충진된흡착제와이동상간의확산혹은입자와입자사이의흡착 과탈착의메커니즘으로분리가되는데, 상용되는흡착제의대부분 은다공성입자이다. ^{큰흡착능력}, ^{큰표면적이흡}·^{탈착에유리하기}

때문에결과적으로미세한구멍이많이필요하다. 흡착질분자는흡 착제입자밖에서들어오고, 입자안쪽으로확산되어사용할수있 는흡착자리를가득채운다. 흡착제구조에의존하는확산메커니즘 의몇몇다른형태가지배적이되고때때로둘또는세가지가경 쟁적으로흡착한다. 그러한지배적메커니즘은또한흡착제와흡착 질의조합과온도, 농도범위같은흡착조건에의존한다[16, 17].

이온성액체를첨가함으로써양이온과고정상중의실라놀그룹,

C18과상호작용력을형성하며이동상중에용해된물질의에너지

를감소시킨다. 그러한경쟁성흡착력으로하여물질의서로다른 체류인자를가져올수있다. 음이온과양이온으로구성된이온성 액체는이동상중에서높은극성의세기를나타내며, 서로다른구 조를가진 D-tryptophan^과 N-CBZ-D-phenylalanine^{과의작용력이서}

로다를것이다. 큰기능성그룹을가진 N-CBZ-D-phenylalanine과 의작용은거의없었고, 상대적으로구조가작은 D-tryptophan은이 온성액체의영향을많이받았다. 하나의카르복실기를가지는 N- CBZ-D-phenylalanine^{은아미노기에큰} carbobenzyloxy ^{그룹이붙어}

서이온성액체의양이온과작용하는데저해하고있기때문으로판

단된다. 반면에 D-tryptophan은하나의카르복실기에또벤젠고리 외의아미노기에붙은기능성그룹이없기때문에이온성액체의 양이온과작용하는데도움을주고있다. 또한, 벤젠고리안의아미 노기도이러한작용력의크기를증가시킬수있다. ^{이러한원인으}

로 D-tryptophan의체류인자는 N-CBZ-D-phenylalanine보다이온성 액체의농도의영향을많이받는다.

Fig. 6에서는이온성액체의농도에따른분리도의변화를나타

내었다. 65^{％의메탄올중에이온성액체를첨가함으로써가장높}

은분리도를가졌다. 메탄올의함량이높아짐에따라극성이상대 적으로낮은메탄올의작용으로인하여분리도는상대적으로낮았 다. 65％의메탄올중에이온성액체를첨가함으로써분리도는증 가하였으며, ^{농도가증가함에따라분리도는증가하였다}. 65^％메탄

올에 15.0 mmol/L 농도의이온성액체를첨가하였을때에, 두가지

D-아미노산의분리도는1.9로써가장높았다. 2.0 mmol/L 이상의농 도의이온성액체를첨가함으로써분리도는 1.6 이상으로써 65％의

메탄올중에 2.0 mmol/L^{의이온성액체를첨가하는것이가장적}

절하다고생각한다. 이온성액체가가장적게첨가되었고, 분리도가

1.5 이상이기에경제적이면서도분리의목적에도달할수있기때 문이다. 70％메탄올중에 2.0 mmo/L의이온성액체를첨가함에따 라분리도는 0.0에서부터 0.8로급격히증가하였다. 이온성액체의 농도가증가함에따라분리도는증가하였으며, 6.0 mmol/L^의농도

를초과함에따라 D-아미노산의분리도가 1.1 이상을나타내었고,

분리도는증가하는폭이작았다. 이온성액체의농도가 12.0 mmol/L

일때, D-아미노산의분리도는가장높았으며, 1.3이었다. 80％메 탄올중에첨가한이온성액체의농도가각각 10.0, 12.0, 15.0 mmol/L

일때, 두가지 D-아미노산의분리도는각각 0.3, 0.8, 0.9로써증가 하였지만, 65％와 70％메탄올이주성분일때보다분리도가낮았으 며, 이온성액체의영향보다메탄올조성의영향을많이받았을것 으로판단된다.

4. 결 론

역상액체크로마토그래피의이동상중에첨가된이온성액체의 농도가증가함에따라 D-아미노산의분리도가증가하였으며, 체류

Fig. 6. Effect of concentration of ionic liquids on resolution.

시간을감소시켰다. ^{높은극성을가지고있는이온성액체를이동}

상중에첨가함으로써전혀분리가되지않았던두가지 D-아미노 산의분리가가능하게되었다. 65％, 70％, 80％의메탄올중에서

65％의메탄올중에이온성액체를첨가함으로써우수한분리도를

가졌다. 65^{％메탄올중에} 0.5 mmol/L^{의이온성액체를첨가함으}

로써분리도는 1.0이었으며농도가증가함에따라증가하였다. 70％

메탄올중에첨가된이온성액체의농도가 6 mmol/L를초과함에

따라 D-아미노산의분리가가능하였으며, 분리도가증가하는폭이 작았다. ^상온에서 pH^가 3.0^인 65^{％의메탄올중에} 2 mmol/L^의이

온성액체를첨가하여사용하는것이이두가지 D-아미노산을분 리함에있어서최적의이동상조건이었다. 이온성액체는피크의

broadening과 tailing을감소시키며, D-아미노산의분리도를증가시 킨다. ^{이온성액체를크로마토그래피의이동상중에첨가함으로써}

천연물에서부터유용성분의분리에도도움을줄수있을것으로기 대된다.

감 사

본연구는인하대학교고순도분리연구실에서수행하였으며, 초정 밀생물분리기술연구센터의연구비지원에감사드립니다.

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