백서에서의 신연 골형성술과 골절 치유과정에서의 Matrix Metalloproteinase-1과 Transforming Growth Factor-

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통신저자：정 호 중

서울시 동작구 흑석동 224-1 중앙대학교병원 정형외과

TEL: 02-6299-1588ㆍFAX: 02-822-1710 E-mail: [email protected]

*이 논문은 2006년도 중앙대학교 학술연구비(일반연구비) 지원에 의한 것임.

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Department of Orthopaedic Surgery, Medical Center of Chung-Ang University, 224-1, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-755, Korea

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백서에서의 신연 골형성술과 골절 치유과정에서의 Matrix Metalloproteinase-1과 Transforming Growth Factor-β1의 발현

강수용ㆍ정호중ㆍ정영복ㆍ장의찬ㆍ이은용ㆍ이미경^*ㆍ김미경^†

중앙대학교 의과대학 정형외과학교실, 진단검사의학교실*, 해부병리학교실^†

Matrix Metalloproteinase-1 and Transforming Growth Factor-β1 Expression during Distraction

Osteogenesis and Fracture Healing of the Rat

Soo-Yong Kang, M.D., Ho-Joong Jung, M.D., Young-Bok Jung, M.D., Eui Chan Jang, M.D., Eun-Yong Lee, M.D., Mi-Kyung Lee, M.D.*, and Mi-Kyung Kim, M.D.^†

Departments of Orthopaedics, Laboratory Medicine* and Pathology^†, College of Medical, Chung-Ang University, Seoul, Korea

Purpose: To evaluate the temporal and spatial expression of Transforming Growth Factor-β1 and Matrix Metalloproteinase-1 in distraction osteogenesis and fracture healing models.

Materials and Methods: Distraction osteogenesis was performed on the tibial diaphyses of Sprague- Dawley rats (latent period for 1 week, distraction for 2 weeks). The rats were euthanized at each week and the level of mRNA expression was assessed by real-time RT PCR and immunohistochemical staining.

Results: Although the level of TGF-β1 mRNA and MMP-1 mRNA expression was increased during distraction osteogenesis and fracture healing, the level of mRNA expression was significantly higher in the distraction phase in the distraction group than in the fracture healing group at the same phase. After the distraction phase, the level of mRNA expression in both groups decreased to the base line. The peak expression of mRNA was followed by that of TGF-β1 mRNA. Immunohistochemical staining revealed that TGF-β1 was expressed mainly in the osteoblast and endothelial cells, and MMP-1 was expressed mainly in the endothelial cells of the vessel.

Conclusion: There is specific time sequence in the expression of TGF-β1 and MMP-1 during fracture healing and distraction osteogenesis. These results suggest that TGF-β1 expression might be associated with the angiogenesis induced by MMP-1 expression during new bone formation.

Key Words: Distraction osteogenesis, Fracture healing, TGF-β1, MMP-1, Real-time RT PCR

서 론

Transforming growth factor-β (TGF-β)는 골아 세포에서 교원질의 증식과 합성을 촉진시키고, 골절의 치유 과정 중 치유의 시작, 연골형성 그리고 골형성 과정 에서 국소 응집과 발현이 확실하고, 간엽세포로부터 골 아세포와 연골세포로의 증식 및 분화를 일으키고 골기질

의 합성을 촉진시키는 역할을 한다13,14,22,23)

. 또한 Weiss 등²⁹⁾에 의하면 TGF-β의 혈장농도가 생체 실험에서도 골절치유 및 신연 골형성술의 과정에서 의미 있게 증가하 는 것으로 보고되어 있고, 특히 신연 골형성술에서는 기 계적 자극에 대한 세포반응을 매개하는 물질로 생각되고 있다^12,16,20). Matrix Metalloproteinase (MMP)는 혈관

Fig. 1. Application of distraction osteogenesis. (A) Appearance of external fixator on a mouse. (B) Medial longitudinal incision and corticotomy.

의 신생(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 알 려져 있는데 혈관의 기저막에 존재하는 제4형 교원질을 분해하여 혈관 신생의 초기단계를 유도하며, 이후에 제1 형과 제3형 교원질로 이루어진 세포외 기질을 분해하여 모세혈관의 발아를 유도하고, 혈관 내막세포의 전이 (migration)와 혈관 생성 유도물질(angiogenetic factor) 의 생산에 관여한다²⁵⁾. 이러한 혈관 신생은 정상 발달 (development), 조직의 치유, 신생물(neoplasm)의 성 장과 전이, 관절염의 치유 등에 관여하게 된다¹¹⁾. 골절의 치유에서는 세포외 기질(extracellular matrix)의 생성 과 흡수의 과정에 관여하는 것으로 되어있고⁶⁾, 이 중 MMP-1의 혈장농도는 TGF-β와 같이 생체 실험에서 골절치유 및 신연 골형성술의 과정에서 의미 있게 증가하 고 이는 혈관 신생과 세포분화에 영향을 주는 것으로 보 고되고 있다5,8,18,21,28-30)

.

이렇게 골절의 치유 과정에는 여러 종류의 분자생물학 적인 기전이 작용할 것으로 추정되지만 아직도 많은 사실 이 알려져 있지는 않고 더욱이 신연 골형성술의 기전에서 일어나는 분자생물학적 기전은 연구가 미미한 상태이다.

이에 저자는 골절의 치유과정과 신연 골형성술의 과정에 서 나타나는 MMP-1과 TGF-β1의 시간적, 공간적 발 현 양상을 분석함으로써 골절치유와 신연 골형성술의 기 전을 유추하고자 한다.

재료 및 방법

1. 실험동물

300 g 내외의 Sprague-Dawley 계의 백서를 동물 사 육실에서 취하여 실험 전 2주간 적응 기간을 가졌다. 사 료는 고형 압축 사료(피드랩사)를 사용하고, 식수는 수돗 물을 사용하였으며, 12시간 주기의 밤과 낮, 그리고 섭씨 22도 내외의 환경에서 사육하였다. 실험 기간 중에 백서 는 제한된 공간에서 자유로이 활동할 수 있게 하였다.

총 43마리의 백서를 이용하여 실험을 시행하였다. 절골 술 후 1, 2, 3, 4주에 골절 치유군 및 신연 골형성군 각각 5마리씩을 희생하여 조직을 얻었고 정상 대조군으로 3마 리를 사용하였다.

2. 수술방법

각 군의 흰쥐는 좌측 후지의 털을 깎은 후, xylazine과 ketamine을 복강 내 주입하여 전신 마취를 하였다. 무균

조작 하에 외고정기기(길메디칼, 백서용)를 부착하기 위 하여 0.8 mm K-강선 4개를 경골의 장축에 수직으로 골 수강의 중심을 통과하여 내외측 피질골을 통과하도륵 삽 입하고, 외고정기를 내외측에 장착한 뒤에(Fig. 1-A) 하 퇴 경골 근위부 골간단-간부 경계 부위에 0.5 cm 정도의 종절개를 가한 후 근육과 골막을 박리한 후에 골막하로 경골에 도착한 다음 제2, 제3 K-강선 사이에서 미세 절 골도를 이용하여 전면의 피질골에 절골술을 실행하였다 (Fig. 1-B). 절골 부위의 골막과 피부를 나일론 4-0를 이용하여 봉합하였다. 신연 골형성군에서는 7일간의 휴 지기를 가진 후 8일째부터 21일까지 14일 간 하루에 0.5 mm를 12시간 간격으로 두 번에 나누어 절골편을 신연하 였으며 그 후에는 더 이상의 신연없이 골 외고정 기구를 유지하였다. 골절 치유군에서는 이러한 절골술 후 외고 정기로 골절부위 고정 후에 그대로 골절의 치유를 유도하 였다.

수술 후 1주, 2주, 3주, 4주에 각 군에서 5마리씩을 희생하여 2마리는 조직검사에, 3마리는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT PCR)의 재료로 사용 하였다. 수술 전 기본값을 얻기 위하여 3마리의 토끼를 희생하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응에 사용하였 다.

3. 신생 가골의 채취

각 군에서는 해당 주수에 해당하는 개체를 희생시킨 후 골 결손부위에 생성된 신생 가골 조직을 11번 수술칼을

Table 1. List of PCR Primers and the Product Size Product Primer Oligonucleotide sequence (5'-3')

size (bp)

MMP-1 Reverse TGGGATTTCCAAAAGAGGTG 121

Forward ACGTGGTTCCCTGAGAAGA

TGF-β1 Reverse GGCACCATCCATGACATGAA 71

Forward CAGGTGTTGAGCCCTTTCCA

β-actin Reverse GCCGGGACCTGACAGACTAC 114 Forward GCAACATAGCACAGCTTCTCTTTAA 이용하여 채취한 뒤 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을

위한 조직은 질소 탱크에 보관하여 조직의 손상을 최소화 하였고 조직학적 검사를 위한 조직은 포르말린에 고정하 였다.

4. 조직학적 검사

얻어진 시편은 10% nitric acid 에서 약 6시간 동안 탈회한 후 파라핀 포매된 조직을 4μm 두께로 박편을 만 들고 이를 슬라이드에 부착한 후 56^oC 배양기에서 파라 핀을 녹여 조직절편을 유리 슬라이드에 완전히 부착시킨 후에 hematoxylin-eosin (H&E)으로 염색하여 광학 현 미경으로 관찰하였다.

5. 면역조직화학검사

MMP-1과 TGF-β1 에 반응하는 특이 항체는 TGF- β1 (v)(Santa Cruz biotechnology inc. California, USA)와 anti-MMP-1 (Lab Vision corp. California, USA)를 사용하였다. 파라핀 포매된 조직을 7μm 두께 로 박편을 만들고 이를 xylene과 ethanol로 탈파라핀- 재수화한 후, 3% H2O2-methanol로 처리하여 내인성 peroxidase를 불활성화하였다. Hyaluronidase 100 u/ml로 37^oC에서 30분간 처리하고 MMP-1과 TGF-β 1의 특이 항체를 반응시킨 후 AEC chromogen으로 발 색 후 Mayer hamatoxylin으로 대조염색 후 관찰 하였 다. 발현의 정도는 세포간질(interstitial tissue)에서의 염색정도를 음성 조절(negative control)로 하여 각각 발현없음(absent stain, 0＋), 약한 발현(mild staining, 1＋), 중간정도의 발현(moderate staining, 2＋), 강한 발현(intense staining, 3＋)으로 구분하였다.

6. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 MMP-1 과 TGF-β1 유전자 발현의 상대 정량

시발체 합성과 표준화 곡선(calibration curve) 준비 에서 Sprague-Dawley의 MMP-1과 TGF-β 유전자 의 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 시발체(primer)와 내 부 대조 유전자 증폭을 위한 beta-actin (β-actin) 시 발체는 Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 프로그램을 이용하여 고안하였 다(Table 1).

표준화 곡선에 필요한 genomic DNA는 Wizard^Ⓡ

Genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 가골(callus)에서 추출한 후, MMP-1, TGF-β 및 β-actin 유전자를 중합효소연쇄 반응(PCR)으로 각각 증폭하였다.

Callus에서의 총RNA의 분리를 위해서는 RNA- queous^TM-4PCR (Ambion, Austin, TX, USA)을 사용 하여 추출하였다.

cDNA 합성을 위한 역전사(reverser transcription, RT)는 1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN, USA)을 사용하여 시행하였다.

실시간 역전사 중합효소연쇄반응은 ABI PRISM^Ⓡ 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용 하여 시행하였다. PCR 반응액은 2×SYBR^Ⓡ Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 12.5μl, 시발체 각각 320 nM, template 4 μl를 넣고 멸균 증류수를 첨가하여 총 25μl가 되게 하 였고, 50^oC에서 2분, 95^oC에서 10분간 반응시킨 후 95^oC에서 15초, 60^oC에서 1분씩 40회 반응시키는 조건 으로 증폭하였다. 이때 SYBR Green은 PCR로 합성된 double-stranded DNA에 결합하여 형광을 나타내게 되 므로, 반응이 진행됨에 따라 발생하는 형광 신호를 각 주 기마다 감지하여 유전자 증폭 양상을 실시간으로 분석함 으로 증폭 산물의 생성량을 측정하게 된다. 즉 증폭의 초 기에는 형광의 증가가 감지되지 않으나 일정 주기가 지나 면 축적된 형광양이 비로소 기기에 감지되기 시작하는데, 이렇게 형광양이 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가 하는 시점의 주기수를 역치 주기(CT, threshold cycle) 로 명명하고 있다. 그러므로 각 유전자(MMP-1, TGF- β, β-actin)의 농도는 각각의 표준곡선으로부터 얻어 지며, 이들 유전자의 상대 정량치는 기준 유전자인

housekeeping 유전자(β-actin)에 대한 대상 유전자 (MMP-1, TGF-β)의 비로 산출하였다. 각 유전자의 상 대정량은 동일한 cDNA를 사용하여 각각 3회씩의 독립 된 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하여 얻은 결 과의 평균값으로 평가하였다.

또한 증폭이 끝난 PCR 산물의 dissociation curve 분 석을 시행하여 증폭 산물의 융해 온도(melting tem- perature)를 확인함으로 MMP-1, TGF-β 및 β- actin 유전자의 PCR 증폭 시 단일 산물이 증폭됨을 확인 하였다.

7. 통계학적 분석

SPSS version 11.5 software (Chicago, Illinois)를 사용하여 MMP-1, TGF-β mRNA 각각에 대하여 신연 골형성군과 골절 치유군에서의 시기에 다른 발현 양을 Mann-Whitney U 방법을 이용하여 비모수검사를 시행 하였고 p 값이 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로 판정하 였다.

결 과

1. 면역조직학적 검사에 따른 MMP-1과 TGF-β1의 발현

1) 술 후 7일째

이 시기의 소견은 양군간의 차이가 없이 동일하였다, 혈종이 기질화되는 시기로 간엽 세포가 관찰되며 혈관 신 생이 시작되는 소견을 보였다. TGF-β1은 백혈구에는 발현되지 않고(0＋), 혈종과 증식 중인 간엽세포(＋2)와 혈관벽(2＋), 특히 내피세포에 강하게 발현을 보였다 (3＋). MMP-1은 혈종에 약하게 발현되며(1＋) 증식중 인 간엽세포에도 약간 강하게 발현되었다(2＋). TGF-β1 같이 혈관 내피세포에 발현되나 TGF-β1 보다 약하게 발현되었다(2＋)(Fig. 2).

2) 술 후 14일째

신연 골형성군에서는 신연 시작 후 1주째로, 구역현상 이²⁾ 관찰되기 시작하였다. 신연 공간의 중앙부에는 섬유 성 결체조직이 신연 방향에 평행하게 배열되어 있는 섬유 성 중간대(fibrous interzone; FIZ)가 관찰되었고, 골편 측에서 이 섬유성 중간대 방향으로 새로 형성된 골 소주 들이 역시 신연 방향에 평행하도록 형성되어 있는 미세

골 소주 형성대(microcolumn formation; MCF)가 있으 며, 이 두 구역의 경계선에서 골모세포양 세포가 발견되 는 일차 무기질화 구역(primary mineralization front;

PMF)이 관찰되었다. 미세 골 소주 사이에서는 활발한 신 생 혈관의 생성이 관찰되었다. TGF-β1은 일차 무기질 화 구역의 골모세포에서 강하게 발현되고(3＋) 혈관 특 히 혈관 내피세포에서도 계속해서 강하게 발현되었다 (3＋). 일부 섬유모세포(fibroblast)에도 약한 발현을 보 였다(1＋). MMP-1은 골모세포에는 발현이 없고 혈관벽 에서만 발현되었다(2＋)(Fig. 2).

골절 치유군에서는 연골 내 골화과정을 위한 많은 관절 연골형성이 관찰되었다. TGF-β1은 비후된 관절 연골 에서는 발현을 보이지 않았고 섬유모세포와 작은 증식성 연골세포와 혈관벽에서 발현을 보였다(＋1). 미숙골 (woven bone)주위의 골모세포에서 강한 발현을 보였다 (3＋). MMP-1은 혈관벽에서만 발현을 보였다(2＋) (Fig. 3).

3) 술 후 21일째

신연 골형성군에서는 신연 시작 후 2주째로, 구역현상 이 더욱 명확해지고 섬유성 중간대의 섬유모세포와 교원 섬유의 배열도 더욱 평행해졌다. 미세 골 소주 형성대뿐 아니라 섬유성 중간에의 골편 측에서도 신생혈관이 관찰 되었다. TGF-β1은 일차 무기질화 구역 주위의 골모세 포에서 초기보다는 약하게 발현 되었고(＋2) 혈관 주위 에서는 미약하게 발현되거나 발현되지 않았다(0-1＋).

일부 섬유모세포에서도 약하게 발현되는 부분이 관찰되 었다(1＋). MMP-1은 혈관벽에서만 발현되었고 발현의 정도도 약하였다(1＋)(Fig. 2).

골절 치유군에서는 연골의 미숙골 형성이 증가하는 소 견을 보였고 TGF-β1은 미숙골 주위의 골모세포에서 중등도의 발현(2＋), 혈관주위에서 약한 발현을 보였으 나(1＋) 비후된 연골 세포에서는 발현되지 않았다.

MMP-1은 혈관벽에서만 약한 발현을 보이고(1＋) 다른 부분에서는 발현되지 않았다(Fig. 3).

4) 술 후 28일째

신연 골형성군에서는 신연을 정지하고 7일이 지난 시 점으로 골모세포 주위의 미숙골(woven bone)의 형성이 증가되었고 섬유성 중간대의 교원섬유와 세포 외 기질도

Fig. 2. Serial examination of H&E and immunohistochemical staining in distraction osteogenesis. Seven days after the osteotomy, Hematoma organization and angiogenesis were observed. The expression of TGF-β1 and MMP-1 in the endothelial and proliferating mesenchymal cells. At 14 days, a zonal phenomenon was noted. MCF, Microcolumn formation; PMF, Primary mineralization front; FIZ, Fibrous interzone. Expression of TGF-β1 in osteoblasts in PMF was observed. At 21 days, angiogenesis was also observed in the FIZ. At 28 days, there was an increase in the amount of woven bone and extracellular matrix.

풍부해진 소견을 보였다. TGF-β1은 일차 무기질화 구 역 주위의 골모세포에서 매우 약하게 발현되었고(0-1＋) 혈관주위에서도 발현이 없거나 매우 약한 발현을 보였다 (0-1＋). 섬유성 중간대에서는 발현을 보이지 않았다.

MMP-1은 일차 무기질화 구역 주위의 골모세포에서 약 하게 발현 되었고(1＋), 혈관 벽에서의 발현도 매우 약하

였다(0-1＋). 섬유성 중간대의 일부 섬유모세포에서 발 현되는 양상을 보였다(0-1＋)(Fig. 2).

골절 치유군에서는 많은 미숙골이 관찰되고 골절 간격 이 미숙골에 의해 연결되는 소견을 보였다. TGF-β1은 혈관벽에서 매우 약하게 발현되거나 발현되지 않았고 (0-1＋) 골 주위의 골모세포에서도 발현되지 않았다. 다

Fig. 3. Serial examination of H&E and immunohistochemical staining in the fracture healing model. At 14 days, enchondral ossification was observed. TGF-β1 expression was observed in the small proliferative chondrocytes, vessel wall and osteoblasts but not in the hypertropic chondrocytes. MMP-1 expression was observed only in the vessel wall. At 21 days, TGF-β1 expression was noted in the osteoblasts around the woven bone and vessel wall. At 28 days, the fracture gap was connected with new bone. TGF-β1 was expressed weakly on the vessel wall, and MMP-1 was expressed in the vessel wall.

만 기질 간엽세포(interstitial mesenchymal cell)에서 만 일부 발현되었다(1＋). MMP-1은 역시 혈관벽에서만 약한 발현을 보였다(1＋)(Fig. 3).

2. 시간의 경과에 따른 MMP-1 mRNA과 TGF-β1 mRNA의 변화

신연 골형성술의 경우에는 MMP-1 mRNA와 TGF- β1 mRNA가 휴지기나 성숙기에 비하여 신연기에 증가 하였다. 골절 치유군에서는 절골술 후 시간이 증가함에 증가하다가 성숙기에 들어서면서 감소하는 양상을 보였 다.

MMP-1 mRNA는 신연 골형성군에서는, 휴지기(절골 술 후 7일)에 증가를 시작하여 신연 시작 후 7일(술 후14

일)에 가장 높은 발현을 보이다가 신연을 중단하고 성숙 기에 다시 초기 수준에 가깝게 감소하였다. 골절 치유군 에서는 술 후 21일까지 지속적인 증가를 보이다가 술 후 28일에는 감소하였다(Fig. 4). 두 군 간의 비교에서는, 신연 골형성군의 MMP-1 mRNA의 발현이 신연 초기에 같은 시기의 골절 치유군에 비하여 의미 있게 증가되어 있었다(Fig. 4).

TGF-β1 mRNA도 MMP-1 mRNA의 발현과 비슷 한 증가 양상을 보였으며, 신연 골형성군에서는 신연기 에 강한 발현을, 휴지기에는 골절 치유군에서 강한 발현 을 보였다(Fig. 4). 골절 치유군에서는 MMP-1 mRNA 와 유사한 발현 양상을 보였으나, 신연 골형성군에서는 신연 시작의 초기가 아닌 후기에서 가장 강하게 발현 되

Fig. 4. mRNA expression analysis by real-time RT PCR across the time course of distraction osteogenesis and fracture healing. * Indicate significances compared with the fracture healing group (*p＜0.05). DO, Distraction osteogenesis; FH, Fracture healing. (A) TGF-β1 mRNA, (B) MMP-1 mRNA.

어 MMP-1 mRNA가 신연의 초기에 가장 강하게 발현되 는 점과 차이를 보였다.

고 찰

본 연구에서는 골절 치유군에서 나타나는 연골 내 골화 와 신연 골형성 군에서 나타나는 막내골화의 과정을 확인 하고, 그 과정에서 나타나는 TGF-β1과 MMP-1 의 유 전자 발현을 비교적 정확한 정량이 가능한 실시간 역전사 중합효소연쇄반응이라는 방법을 통하여 시간에 따른 발 현양상을 확인하고, 면역조직학적으로 발현의 위치를 확 인하여 각각의 작용기전을 유추하고자 하였었다.

신연 골형성군의 조직면역학적 검사에서는, 절골술 이 후 초기에는 TGF-β1과 MMP-1은 증식 중인 간엽세포 와 혈관내피세포에 주로 발현되는 양상을 보였고 이러한 소견은 TGF-β1과 MMP-1이 혈관 신생의 초기 단계에 서 작용한 다는 것을 시사하였다. 신연을 시작한 후 구역 현상이 나타나면서부터는 TGF-β1은 미세 골 소주 형 성대의 골모세포에서 발현되면서 골모세포의 분화에 작 용하는 것으로 판단되었고 이 시기 역시 TGF-β1과 MMP-1이 모두 혈관내피세포에서 강하게 발현하여 이 두 물질이 혈관 신생과 증식 세포의 전이와 분화에 영향 을 주는 것으로 생각되었다. 신연을 중지하고 성숙기가 되면서 TGF-β1과 MMP-1의 발현이 급격히 줄어드는 양상을 보였으며 이는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 을 통한 정량 검사의 소견과 일치하는 소견을 보였다. 그 러나 이러한 결과는, 이전의 양(sheep)이나 인체를 대상

으로 한 실험에서 TGF-β1과 MMP-1이 신연을 중지한 후에도 장기간 발현이 계속되며 특히 MMP가 재형성 (remodeling)에 관여한다고 보고한 결과와는 차이를 보 였다^15,18,26). 이러한 종(spices) 간의 실험 모델에 따라 결 과에 차이를 보이는 것은 휴지기간, 신연율, 조직의 반응 도와 측정 시점이 다름에 따라 나타나는 유전자 발현의 차이에서 기인하는 것으로 판단된다. 그러나 본 실험이 그 대상 기간이 비교적 골절 치유의 초기에 국한된 실험 의 제한점을 가지고 있는 점과 MMP의 혈관형성 작용이 골의 형성뿐 아니라 골흡수를 통한 재형성에도 기여할 수 있다는 점을 고려할 때 보다 긴 시간 동안의 추시를 통하 여 이러한 현상을 검증하여야 할 것으로 생각된다.

본 연구에서 술 후 14일째와 21째의 각 군의 세포별 면역조직학적 염색의 강도와 실시간 역전사 중합효소연 쇄반응 상의 결과에서는 약간의 차이를 보여주고 있는데 이는 면역조직학적 염색에 대한 판독이 관찰자간(inter- observer), 관찰자내(intraobserver) 변이가 심한 점을 고려하면 발현의 공간적 정보를 주는데는 적합하지만 정 량적 정보를 주는데는 미흡한 데서 기인하는 것으로 분석 하였다.

골절 치유군의 조직면역학적 검사에서는 연골내 골화 의 과정을 거치면서, TGF-β1은 비후된 연골세포에서 는 발현을 보이지 않았고 주로 골모세포에서 발현을 보였 고 신연 골형성군과 마찬가지로 TGF-β1과 MMP-1 모 두 혈관 내피세포에서 발현을 보였다. 그러나 신연 골형 성군에서와 같은 강한 발현은 보이지 않았고 이러한 차이

는 양 군의 골형성과정에서 나타나는 혈관신생의 차이를 시사하는 소견으로 판단되었다. 그러나 MMP-1발현에 의한 신생혈관 형성과 TGF-β1의 관계를 보다 정확히 알기 위해서는 angiopoietin 이나 vascular endothelial growth factor (VEGF)와 같은 다른 혈관신생 인자와의 추가적인 실험이 선행되어야 할 것으로 생각된다.

뼈의 세포학적 분화과정 중에 골모세포는 증식(proli- feration), 성숙(maturation), 석회침착(mineralization) 의 3단계를 거치며 이중 증식의 시기에는 제1형 교원질 의 세포외 기질을 형성하면서 TGF-β1의 발현이 증가 하는 것으로 알려져 있다²⁷⁾. Lammens 등은 백서에서의 골절 치유군과 신연 골형성군이 비교를 통해서 신연 골형 성군에서 혈청의 TGF-β1이 골절 치유군보다 높게 측정 된다고 보고하였다. 이러한 결과는 기계적 장력(mecha- nical strain)이 골모세포의 형성을 촉진하여, 골형성을 위한 세포외 기질 형성을 촉진시킴을 시사하였다¹⁶⁾. 점진적 신연은 육아 조직의 조골 능력을 촉진하는 것으 로 보고되었고¹⁰⁾, 세포 배양 시 1%이 장력(strain)이 증 가함에 따라 상당한 세포증식의 증가를 관찰하였다고 보 고하였다²⁰⁾. 사람의 조골세포 배양 실험에서는 주기적 장력이 활성형의 TGF-β1의 생산증가를 유도하는 것으 로 보고되었다¹²⁾.

본 실험에서 신연기에 조골세포에서 TGF-β1의 발현 이 증가하며 정량적 검사에서도 골절 치유군에서보다 많 은 양의 TGF-β1 mRNA 의 발현을 보인 것은 이러한 이전의 보고와 일치하는 소견이며, 비교적 이전의 방법 보다 정확한 실시간 역전사 중합효소연쇄반응이라는 정 량법을 사용하여 TGF-β1 mRNA의 발현의 변화를 규 명한 것은 의미를 가지는 것이라 할 수 있다. 그러나 TGF-β1이 조골 세포의 증식에 미치는 영향을 명확히 규명하기 위해서는 제1형 교원질이나 알카리성 인산효소 (alkaline phosphatase) 등의 발현의 변화를 정량적으 로 측정할 필요가 있을 것으로 생각된다.

정상적인 뼈의 대사와 재형성을 위해서는 적절한 세포 외 기질이 생성과 분해가 동반되어야 하는데 이러한 세포 외 기질의 분해에 중요한 역할을 하는 것이 MMP군으로 명명되는 단백분해 효소이다. 본 실험에서는 신연 골형 성군에서는 신연기에 급격한 증가가 나타나나, 골절 치 유군에서는 완만한 증가를 보였다. 이것은 신연 골형성 과 골절 치유군의 신생혈관 형성의 시기의 차이와 골 형

성의 방법에서 기인한다고 생각된다. Aronson¹⁾은 신연 골형성술을 시행 중인 다리에서 혈액순환이 10배까지 증 가한다고 보고하였고, Choi 등⁷⁾은 신연 골형성 중 휴지 기와 신연기에 활발하게 신생혈관이 생성된다고 보고하 였다. 또한 여러 이전의 보고에서 일반적 골절치유와 비 교되는 신연 골형성술의 특징 중 하나가 활발한 신생혈관 의 형성인 것으로 알려져 왔다^4,7,17,24). 본 연구 결과에서 MMP-1이 휴지기와 신연기에 강하게 발현한 것은 이러 한 보고들과 일치하는 것으로 신연 골형성술에서 나타나 는 초기의 신생혈관에 직접적으로 관여하기 때문인 것으 로 생각된다.

MMP는 세포외 기질을 분해하는 작용 뿐 아니라 골 대 사에서 autocrine이나 paracrine의 형식으로 작용하는 것으로 보고되고 있는데^3,9,19,28), 본 연구의 결과에서 신 연 골형성군에서 골모세포로 분화하는 초기단계에서 TGF-β1의 발현에 선행하여 MMP-1 mRNA의 발현이 증가함은 신연초기에 혈관 신생을 촉진함과 동시에 막내 골화에서 필요한 골모세포의 증식과 성숙에 관여한다는 점을 시사한다고 생각된다. 이에 비해 골절 치유군에서 는 연골 형성의 단계를 거치기 때문에 신연 골형성의 경 우보다 낮은 MMP-1 발현을 보이는 것으로 생각된다.

그러나 MMP-1은 골모세포에서 발현이 약하고 혈관주 위에서만 강하게 발현하는 양상을 보이기 때문에 골모세 포에서 직접적으로 작용한다기 보다는 혈관신생이나 이 를 통한 이차적 물질을 통하여 골모세포에 영향을 주는 것을 생각되었다.

결 론

백서 경골에서의 신연 골형성술과 골절 치유 과정에서 실시간 역전사 중합효소연쇄반응의 방법을 이용하여 측 정한 TGF-β1과 MMP-1유전자의 발현은 시간적 차이 를 보이며 발현되는 세포의 분포에서도 차이를 보였다.

이는 MMP-1에 의한 혈관신생과 TGF-β1의 발현이 연 관성이 있을 개연성을 시사하고 있으며, 신연 골형성술 과 골절 치유과정 간의 골 형성의 기전의 차이, 특히 신생 혈관의 생성의 시기와 정도의 차이에서 기인하였을 개연 성 또한 시사한다고 할 수 있으나, 보다 정확한 기전의 확인을 위해서는 혈관 형성과 골형성에 관여하는 다른 인 자와의 연관성에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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= 국문초록=

목 적: 골절 치유의 과정과 신연 골형성의 과정에서 나타나는 Transforming Growth Factor-β1과 Matrix Metalloproteinase-1의 유전자 발현을 시간적, 공간적으로 확인하고자 하였다.

대상 및 방법: 백서의 경골 모델을 이용하여 골절 치유군과 신연 골형성군으로 나누어 절골술을 가하고 외고정기 를 고정한 후 신연 골형성군에서만 술 후 7일부터 21일까지 신연을 시행 후 7일의 성숙기를 가진 후 희생하여 같은 시기의 골절 치유군과 비교하였다. 시간에 따른 MMP-1과 TGF-β1의 유전자 발현은 실시간 역전사 중합효 소연쇄반응으로 정량화하고, 공간적(발현부위) 발현의 양상은 면역조직화학염색을 통하여 확인하였다.

결 과: TGF-β1과 MMP-1 유전자의 발현은 양 군 모두에서 증가하는데, TGF-β1과 MMP-1은 모두 신연기에는 골절 치유군보다 항진되었다가, 신연을 정지한 후에는 골절 치유군과 비슷한 수준으로 감소하였다. 신연 골형성 군에서의 TGF-β1의 증가는 시기적으로 MMP-1의 증가 이후에 나타났다. 면역조직학적 검사에서 TGF-β1은 주로 골모세포와 혈관내피세포에 발현하는 반면 MMP-1은 주로 혈관내피세포에만 발현을 하였다.

결 론: MMP-1과 TGF-β1은 골절 치유와 신연 골형성술에서의 특정한 시간적 발현의 차이를 보이며 이러한 차이는 MMP-1에 의한 혈관신생과 TGF-β1의 발현이 연관성이 있을 개연성을 시사하는 것으로 사료되었다.

색인 단어: 신연 골형성술, 골절 치유, TGF-β1, MMP-1, 실시간 역전사 중합효소연쇄반응