Genomic DNA Aberration Profiles in Paraffin- Embedded Breast Tumor Using Array-CGH on c-erbB-2 Overexpression

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서 론

보건복지부의 암 등록자료에 의하면 유방암은 2001년부 터 우리나라 여성암 중 가장 높은 발생률을 보이고 있고, 2004년 통계에 의하면 매년 10만 명당 35명으로 발생률이 급속히 증가하고 있다. 조기 발견과 치료에 있어서는 현저 한 발전을 계속 보이고 있지만, 발병과 진행에 대한 기전은 대체로 밝혀져 있지 않고, 여러 가지 환경인자가 유전적인 인자를 가진 체세포에 축적되어 유전적 변이를 일으키는 것으로 추측할 뿐이다.

c-erbB-2는 최근 들어 유방암에 있어서 기존에 있던 림프 절 전이나 종양의 크기 등의 병기 결정인자들 외에 중요한 단독예후인자의 하나로 간주되고 있고, 양성일 경우 예후 가 나쁠 것으로 예측할 수 있다. 여러 가지 요법에 대한 반 응의 예측인자로도 사용되는데, 양성일 경우 항호르몬 요 법에 반응을 잘 보이지 않고, 항암제의 종류에 따라서도 다 른 반응을 보일 것을 예측할 수 있다. 그 자체를 새로운 면 역요법의 표적으로 한 단일클론 항체가 개발되어 사용되기 시작했고, 우수한 효과와 적은 부작용, 그리고 항암제에 내 성을 보이는 전이성 유방암 환자에서 표준 요법의 하나로 자리를 잡고 있다.(1) 면역요법의 적용가능성을 확인하는 방법에는 여러 가지 진단법이 이용될 수 있으나, 전이성 유 방암 환자에서 면역조직화학검사(immunohisto chemistry stain,

파라핀 포매 유방암 조직에서 Array-CGH를 이용한 유전체변이에 관한 연구: c-erbB-2 과발현과의 상관성

메리놀병원 외과, ¹부산대학교 의과대학 외과학교실

강 태 우․한 군 택¹

Genomic DNA Aberration Profiles in Paraffin- Embedded Breast Tumor Using Array-CGH on c-erbB-2 Overexpression

Tae Woo Kang, M.D. and Koon Taek Han, M.D.¹ Purpose: Array-CGH is the technique for detecting multiple chromosomal abnormalities in the genomic DNA with using a single procedure. Compared with conventional CGH, there are many advantages for array-CGH such as high resolution, simplified image analysis and high throughput, and its oligo-strategy allows a genome based design. We analyzed the gene aberrations in breast cancer patient to discover the other genomic aberrations that are associated with c-erbB-2 amplification.

Methods: 10 cases of breast cancer patients, considering its c-erbB-2 status of the paraffin embedded tissues, were analyzed with performing array-CGH.

Results: The repeated aberrations in whole cases were found in 78 loci, of which repeatedly gained in 1p36.33, 19p13.13, and lost in 14q32.33, 4q32.3, 10p15.3, 14q21.1.

The unsupervised dendrogram couldn　t show significant classifier for its limited case number. Each tissue from one bilateral breast cancer patient showed a different aberration pattern. There were no BRCA1, 2 aberrations in this study.

The concordance was 100% between the IHC and the a-CGH. By the supervised clustering on the c-erbB-2 factor, 18 aberrations (gained in 17q12-21.1, 17q12, 17q21.1, 17q11.2 and lost in 22q11.1, 15q11.2) were found in c-erbB-2 (+) group with the permutation t-test. The repeated aberrations of c-erbB-2 (+) group were found in 170 loci, of which repeatedly gained in 17q12, 17q21.1 and lost in 14q32.33, 22q11.1.

책임저자：강태우, 부산광역시 중구 대청동 4가 12번지 ꂕ 600-730, 메리놀병원 외과

Tel: 051-461-2773, 2609, Fax: 051-441-0779 E-mail: [email protected]

접수일：2005년 7월 19일, 게재승인일：2005년 11월 28일

Conclusion: Although the number of cases was small, per- forming a-CGH with paraffin embedded breast cancer tissue was a useful technique for rapidly identifying DNA aberrations with high throughput, and this technique showed significant aberrations for some clinical variables. (J Korean Surg Soc 2006;70:265-274)

Key Words: c-erbB-2, HER2, a-CGH, Breast cancer 중심 단어: c-erbB-2, HER2, a-CGH, 유방암

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Department of Surgery, Maryknoll Hospital, ¹College of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea

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ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ IHC)에서 3+이거나, 또는 2+라도 FISH를 다시 거쳐 양성

으로 판정 받을 경우 우리나라의 보험인정기준에 합당하게 치료에 사용할 수 있다. 그런데 이러한 엄격한 과정을 거쳐 도, c-erbB-2 과발현을 보이는 전이성 유방암 환자의 약 19%만이 반응을 보이고 있다.(2)

본 연구에서는 이러한 불일치의 원인으로 작용할 수 있 는 전체 유전체 변이를 확인하기 위해, 한 번의 조작 과정을 통해 여러 부위의 전체 유전체 DNA에서 일어나는 유전자 변이를 비교적 정밀하게 파악할 수 있는 검사방법인 배열 비교 유전체부합법(array comparative genomic hybridization, a-CGH)을 이용하여, 유방암 환자에서 c-erbB-2 변수를 중심 으로 전체적인 유전자의 변화양상을 관찰하였다.

방 법

1) 대상

메리놀병원에서 2003년 1월부터 2004년 12월까지 유방암 으로 진단이 되어 수술을 받았던 환자 53명 중, 임상변수에 따라 군별로 층화시키기 용이한 13예를 대상으로 하였다.

조직의 양은 모두 충분했으나, 2개에서 마이크로 배열 진행 전 추출단계 전기영동에서 부적합한 것으로 판단되었고, 1개 에서는 진행 후 품질의 신뢰도가 떨어지는 것으로 판단하 여 실제로는 10예에서만 관찰이 가능하였다.

2) 면역조직화학 검사

모든 환자의 파라핀 포매 조직에서 IHC를 시행하였다.

10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매한 조 직을 3μm 두께로 잘라 크실렌으로 5분간 3회 탈파라핀 시 킨 후 무수 알코올 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 시트르산염 완충액에서 가열한 후 과산화수소수로 5분간 처리하여 내인성 과산화효소의 작 용을 차단하였다. 증류수와 Tris 완충액으로 수세한 후 비특 이적 항원을 제거하기 위해 30분간 염소혈청과 적용시켰 다. 여분의 용액을 제거한 후 일차항체인 ER 1：50 (DAKO, Glostrup, Denmark), PR 1：50 (DAKO, Glostrup, Denmark), c-erbB-2 1：50 (DAKO, Glostrup, Denmark)을 실온에서 5시 간 동안 반응시켰다. 일차항체 반응 후 절편을 Tris 완충액 으로 5분간 3회 수세하고, 비오틴이 부착된 이차 항체(1：

300, Zymed, San Francisco, USA)와 적용시킨 후 통상적인 아 비딘-비오틴 복합체법으로 20분간 반응시켰다. 발색제는 3-amino- 9-ethyl carbazole을 사용하였고, 대조염색은 메이어 헤마톡실린을 사용하였다. Universal Mount (Dako, Carpin- teria, CA, USA)로 1차 봉입하고 malinol로 2차 봉입한 후 광 학 현미경(Olympus BX, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

ER, PR에 대한 IHC 결과는 핵에서 뚜렷한 적갈색 염색반 응을 보이는 세포가 10% 이상이면 양성으로 판정하였는데, 염색정도를 3점으로, 염색면적을 4점으로 분류한 뒤 합산

한 점수가 0점은 음성, 1∼3점은 약양성, 4∼5점은 중등도 양성, 6∼7점은 강양성으로 세분하여 표기하였다. 실험의 편의상, 최근 분류의 음성과 약양성은 음성으로, 중등도 이 상은 양성으로 분류하였다. c-erbB-2에 대한 IHC 결과도 음 성에서 강양성까지 4단계로 세분화하여 염색정도를 표기 하였는데, 마찬가지로 결과분석과정에서 실험의 편의상 약 양성은 음성에, 중등도 양성부터는 양성에 포함시켰다.

3) A-CGH

본 연구에서는 FISH로 끝-염기분석이 확인된 세균인공염 색체(bacterial artificial chromosome, BAC) 클론을 기본으로 하는 4 K 마이크로배열 칩(MacArray^TMKaryo 4000)을 사용 하였다. 포함된 클론의 수는 4,030개이고, 해상도는 1 Mbp, 반복구조는 중복 점찍기(duplicate spotting)로 이루어져 있 다.

(1) 파라핀 포매 조직에서 DNA 추출: 우선 헤마톡실린- 에오신염색 슬라이드를 통해 종양의 위치를 확인한 후 적 절한 파라핀 블록을 선택하였다. 포르말린으로 고정된 파 라핀조직을 두께 30μm가량의 절편으로 자른 후, 전체 양이 직경 5 mm 정도 되도록 종양조직만 포함되도록 잘라내어 1.5 ml 튜브에 넣는다. 여기에 1 ml 크실렌을 첨가하고 15분 간 누테이터교반기에서 섞어준다. 2분간 원심분리 후 상층 액은 버린다. 이와 같은 방법을 2번 이상하여 크실렌을 가 능한 완전히 제거한 후, 간단히 원심분리하여 남은 크실렌 을 제거한다. 여기에 100% 에탄올을 첨가하여 상온에서 15 분간 누테이터교반기로 섞어준다. 2분간 원심분리 후 에탄 올을 제거하고 남은 조직에 용해완충액 600μl와 단백질분 해효소 K 10μl를 첨가하여 55ôC 인큐베이터에서 5시간 이 상 정치한다. 조직이 완전히 용해된 후에는 65ôC에서 10분 간 둔 후 10초간 보텍스교반기로 혼합한다. 여기에 RNA효 소 A용액 2μl를 첨가하고 10초간 보텍스교반기로 혼합 후 37ôC 인큐베이터에서 15분간 둔다. 단백질 침전용액 150μl 를 첨가한 후 10초간 보텍스교반기로 혼합하고 얼음에 5분 간 둔다. 상온에서 4분간 원심분리 후 상층액 700μl를 새로 운 튜브에 옮긴다. 이소프로판올 600μl를 첨가한 후 10초간 보텍스교반기로 혼합한다. 상온에서 10분간 원심분리 후 상층액을 부어버리고 70% 에탄올 500μl를 첨가한다. 상온 에서 5분간 원심분리 후 피펫을 이용하여 튜브바닥에 남아 있는 DNA 침사만 남기고 상층액을 모두 버린다. 튜브의 뚜 껑을 열어놓고 상온에서 10분간 놓아둔다. DNA수화용액 20∼30μl를 첨가한다. 65ôC로 맞춰진 항온수조에 30분간 놓아둔 후 10초간 보텍스교반기로 혼합하여 -20ôC에 보관 한다(PUREGENE DNA Isolation Kit-GENTRA). 이후에 전기 영동을 시행하여 a-CGH로 진행이 가능할지를 판단하였다.

(2) 유전체 배열

① BAC 유전체은행의 구축; BAC 클론은 마크로젠이 소 유권을 갖는 BAC 유전체은행에서 선택되었다.(3) 간략하

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ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 게, pECBAC1을 HindIII 제한효소를 사용하여 자르고, 선택

적 크기를 가진 HindIII로 분해시킨 남성 DNA를 사용하여 BAC 유전체은행을 만들었다. 이 유전체은행을 가진 벡터 는 DH10B로 형질전환시킨 후 배양하였다.

② BAC 배경의 a-CGH의 구성; 클론들은 평균 2 Mb 해 상도의 유전체 범위를 가지는 것을 우선 선택하였다. 모든 클론들은 Applied Biosystems 3,700 염기배열분석기를 이용 하여 양끝을 염기분석하여 그 위치를 UCSC 인간 유전체 데이터베이스에서 확인하였다.(4) 선택된 클론의 유전자자 리특이성은 이전에 언급된 표준 FISH 검사조건하에 개별적 으로 확인하는 작업을 통해 여러자리결합 클론을 제거함으 로 확인하였다. 이들 클론들은 BAC DNA를 얻기 위해 전통 적인 염기용해방법을 통해 준비하였다. 50% DMSO 점찍기 완충액에 혼합하기 전에 DNA를 3 kb 조각들로 만들기 위 해 초음파분쇄를 시행하였다. Arrays는 24 핀 형식을 사용 하는 GeneMachine's OmniGrid100로 제작하였다. 각각의 BAC 클론들은 중복점으로 표시하였고 각각은 적절한 점 형태 확인을 위해 Axon 스캐너로 미리 스캔하였다. 본 연구 에 사용된 array는 4,000 인간 세균인공염색체로 구성되어 있고, 전체 유전체에 걸쳐 1 Mb 크기로 설계되었다.

③ 종양 및 참조 DNA의 표지: Pinkel 등(5)에 의해 언급된 표지 및 부합 연구계획서를 주로 사용하였다. 간략하게, 500∼1,000 ng의 참조 DNA와 종양 DNA를 포함하는 용액 21μl, BioPrimeDNA Labeling System의 무작위 시동체 용액 20μl를 혼합하여 95^oC에서 5분간 반응시킨 뒤 바로 얼음에 옮긴다. 10x dNTPs labeling mix (1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP) 5μl, 1 mM Cy3dCTP (NEL) 혹은 Cy5dCTP (NEL) 3μl 및 BioPrime DNA Labeling System Klenow 조각(Invitrogen) 40 U를 첨가한 후, 혼합용액을 조심 스럽게 섞어서 37^oC에서 밤새 반응시킨다. BioPrime DNA Labeling System Stop Buffer (Invitrogen) 5μl를 첨가하여 반 응을 종결시켰다.

④ 에탄올의 침전 및 배열부합혼합물의 준비: QIAquick Spin columns (QIAGEN)을 이용하여 표지된 더듬자(probe) 를 정제시킨 후, 한 튜브에 Cy3-부착 종양 표본과 Cy5-부착 참조 DNA를 함께 섞은 후, 인간 Cot I DNA (Invitrogen) 50 μg, 3M 아세트산나트륨 염 20μl와 차가운 100% 에탄올 600μl로 침전시켰다.

⑤ 부합전 과정 및 부합반응: 침전물을 50% 포름아마이 드, 10% dextran sulfate, 2x SSC, 4% SDS 그리고 200 ug 효모 tRNA를 포함하는 부합용액 44μl에 용해시켰다. 부합용액 은 72ôC에서 10분간 변성시킨 뒤 반복 순서분석(repetitive sequence)을 막기 위해 곧바로 37ôC에서 1시간 동안 보관하 였다. 더듬자 혼합액을 배열 슬라이드에 떨어뜨리고 37ôC 에서 48시간 동안 부합반응을 시행하였다.

⑥ 스캔 및 분석: 부합 후 수세를 한 뒤, 배열 슬라이드를 헹구고 건조시킨 뒤 GenePix4200A 2색 형광 스캐너(Axon

Instruments)로 스캔하여 두 장의 16-bit TIFF 영상파일을 만 들고 GenePix 소프트웨어(Axon Instruments)로 정량했다. 배 경감산강도중앙값으로부터 log2변환 형광비를 계산하였고, 이 계산 값들은 강도정상화법에 따라 표준화하였다. 염색 체 이상은 표준화된 log2변환 형광비가 0.25 이상일 때 획득 으로, 그 값이 0.25 이하일 경우 소실로 판정하였다. 이들 두 역치 값은 30명의 정상 남녀의 부합실험에서 계산된 3x 표준편차 값에서 경험적으로 선택하였다.

⑦ 통계분석; 의미 있는 클론은 randomized variance model 에서의 이표본 t-검정 모델 중 순열 t-검정(반복횟수 1,000회) 을 사용하여 계산하였다. 비교를 위해 사용된 두 군의 실험 은 invariant analysis에 따라 정의했다. 범주변수 분포의 차 이의 의미를 알기 위해, 교차표는 양측 피셔의 정확검정으 로 분석하였다. P-value＜0.05를 가지는 클론을 의미 있다고 판단하였고, 필요한 경우 명기하였다. 사용된 도표는 마크 로젠의 MacViewer a-CGH 소프트웨어를 사용하여 얻었다.

통계분석 외에도 각 군에서 50% 이상 공통적으로 반복변 이를 보이는 부분도 의미가 있을 것으로 보고 함께 확인 해 보았다.

결 과

1) 유방암종의 임상 및 병리학적 특성

Table 1에 표기하였듯이 환자의 연령은 31세에서 62세까 지로, 평균연령은 47.4세였다. 수술 후 조직진단은 침윤성 관암종이 8예, 점액성 암종이 1예, 침윤성 유두상 암종이 1 예였다. 1명의 양측성 유방암 환자에서 각각의 조직을 따로 준비하였으므로, 전체 환자의 수는 9명이었다. 88번과 28번 예는 자매가 함께 발병한 경우로 BRCA1, 2 유전자에 대한 관찰을 위해 포함시켰으며 증폭은 관찰되지 않았다. 수술 당시 림프절 절제를 시행하였는데, 4명에서 림프절 전이가 관찰되었고, 모든 예에서 분명한 원격전이는 없었다. 3예에 서 수술 전 항암요법을 시행하였다. IHC 결과 7예에서 ER 양성이었고, 6예에서 PR 양성을 보였으며, c-erbB-2에 대해 서는 2예는 강양성을, 나머지 2예는 중등도 양성을 나타내 었다.

2) 전체 변이양상의 비교

(1) 전체 표본의 50% 이상 반복되는 a-CGH의 획득과 소 실양상: 임상변수에 따라 두 군으로 나누어 비교하기에 앞 서 전체 10예의 유방암 환자 중 50% 이상에서 공통적으로 변이를 보이는 유전자 부위를 확인해 보고 이를 Fig. 1에 표시하였는데, 전체 BAC clone 중 공통증폭은 45군데에서, 공통소실은 33군데에서 관찰되었다(Table 2). 또한 층화가 의도적으로 c-erbB-2 상태비교를 위해 이루어 졌으므로, 본 도표에서는 17q21 aberration이 전체 유방암환자와의 경우 와는 다르게 관찰되지 않고 있다.

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공통증폭은 1, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22번 염색체에서 나타났었고, 70%로 가장 큰 공통 증폭 을 보인 부분이 2군데로 LOC440551과 LOC440552 유전자 를 포함하는 1p36.33 부위와 GCDH, LOC256126, FARSLA, CALR, RAD23A, GADD45GIP1, DAND5 유전자를 포함하 는 19p13.13 부위였다. 공통소실은 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 22번 염색체에서 관찰할 수 있었는데, 90%로 가장 큰 공통 소실을 보인 부분은 14q32.33 부위였 고, 그 다음 80%로는 4q32.3, 10p15.3, 14q21.1 부위에서 소 실을 보이고 있었다. 이런 결과들은 c-erbB-2를 포함하는 17q11.2∼q12, tumor suppressor gene을 포함하는 11p15.5와 17p13.1, loss of heterozygosity를 보이는 9p12와 16q24.2, oncogene을 포함하는 4q11 등이 의미를 가질 것으로 추정했 던 다른 논문과는 다소 차이를 보이고 있었다.

자매관계인 28번과 88번에 대해 17q21.31에 위치한 BRCA1과 13q13.1에 위치한 BRCA2의 변이를 먼저 관찰하

였으나, 모두 정상이었다. 나머지 8예에서도 BRCA1, 2의 변이를 보이는 경우는 없었다. BRCA1, 2의 변이는 전체 유 방암 환자의 10% 가량으로 보고되는데, 스크리닝 검사로는 의미가 적지만, 평생 동안 이런 변이가 있는 환자의 60%

정도는 유방암에 걸리게 되므로, 가족 중에 유방암 환자가 2명 이상이 있거나, 젊었을 때 유방암에 걸린 가족이 있는 경우에는 변이확인이 필요하고, 항에스트로겐으로 예방적 치료를 시도하거나 종괴가 발견되었을 때 치료방법의 선택 에 있어 그 의미가 있다고 할 수 있다.(5)

(2) 계통수(dendrogram)를 통한 비교: 본 연구에서는 7q 염색체 부위에서 공통적인 소실을 보이고 17q 위치에서 공통 적인 증폭을 보이는 58, 88, 78번 군과 그 나머지 군으로 대략 나눠지는 형태를 보였지만(Fig. 2), 이들을 묶어주는 공통적인 임상적 특징을 Table 1에서 군 분류의 기준으로 삼은 의미 있 는 예후인자 내에서는 찾아낼 수가 없었다. 나머지로 묶은 군 에서 의미를 찾아낸다면 2, 28, 34번 군이 선행항암요법을 시행 Table 1. Clinicopathological properties of the 10 breast cancer samples

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ID# Age Type Stage Size Node Grade ER PR C-erb-B2 Neoadjuvant chemo.

1 2 50 ID IIIb T4 N2 intermediate 3+ 4+ 3+ AT3’

2 26 56 ID IIa T2 N0 intermediate 0 0 3+ 0

3 28 50 ID IIIc T2 N3 high 3+ 0 0 AT2’

4 34 34 Non ID IIIb T4 N0 n/a 4+ 4+ 0 AC4’, AT4’

5 58 50 ID IIb T2 N1 high 2+ 3+ 2+ 0

6 66 32 Non ID IIa T2 N0 high 0 0 0 0

7 78 31 ID IIb T2 N1 intermediate 5+ 6+ 0 0

8 86L 62 ID IIa T2 N0 low 4+ 4+ 0 0

9 86R* 62 ID Ia T2 N0 low n/a n/a n/a

10 88 47 ID I T1 N0 intermediate 5+ 4+ 2+ 0

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ ID = invasive ductal; Non ID = non invasive ductal (case 66; invasive papillary carcinoma, case 34; mucinoous carcinoma); AT3’ = adriamycin+taxotere 3 cycles; AC4’ = adriamycin+cyclophosphamide 4 cycles; n/a = not applicable. *Case 86R is right side sample of bilateral breast cancer. IHC was performed only for the left lesion.

Fig. 1. Frequent gain and loss regions (more than 50%) detected in 10 cases of breast cancer by a-CGH.

(5)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 했던 군이라는 점이다.

참고로 86L과 86R이 양측성 유방암을 보였던 동일 환자 의 종양조직임에도 불구하고, 변이양상은 다소 차이를 보 여주었고, 각각은 다른 기원을 가질 수 있음을 추측할 수 있었다.

3) C-erbB-2에 대한 관찰

(1) A-CGH 결과 중 17번 염색체 부위의 변화: Fig. 3은 c-erbB-2 양성이었던 2번 환자의 a-CGH 결과 중 17번 염색 체를 표시한 것인데, 두 개의 붉은 점 위치는 중심체를 의미 한다. 가장 큰 증폭이 관찰되는 BAC start 35096879 위치가 17q12-21부위로 c-erbB-2가 포함된다. 그 좌측으로 두 번째 큰 증폭을 보이는 곳은 17q11.2 부위로서 NF1, EVI2B, EVI2A, AK3P1, RAB11FIP4 등의 암유전자와 많은 STS (sequence tagged site)를 포함하고 있다. 참고로 제일 우선적 으로 고려한 변수가 c-erbB-2였고, 의도적으로 음성군 4명 과 음성군 5명으로 나뉘었기 때문에 결과적으로 빈도는 50% 이하로 상쇄되었고 전체 환자의 50% 이상에서 공통 변이를 보이는 부위를 표시한 Fig. 1에서는 17q12∼21.1 위 치에서 변이가 관찰되지 않은 것으로 표시되었다.

(2) C-erbB-2의 IHC 소견과 a-CGH 소견의 일치도: c-erbB- 2를 대상으로 a-CGH와 IHC 결과도 단적으로만 비교해 보 았는데, 일치도는 Table 3에서 보듯이 IHC 양성 4예에서 모 두 a-CGH 획득, IHC 음성 4예에서 모두 a-CGH 정상으로 나와, 100%로 진단도구로서의 높은 가능성을 나타내었다.

그러나 양성을 보인 4명 중 2명은 2+였고, 나머지 2명은 3+였는데, 2+의 경우 FISH에서 실제 증폭이 있는 경우는 50% 미만으로 나오는 것으로 알려져 있으므로, 추가 FISH 실험을 통해 발현여부를 확인해야만 a-CGH의 FISH 대체 혹은 생략가능성에 대해 언급할 수 있을 것이다.

(3) C-erbB-2 군들 사이의 통계학적 차이를 보이는 변이 부위: c-erbB-2 중등도양성 2명과 강양성 2명을 합해서 모두 4명을 양성군으로 간주한 뒤 양성군과 음성군 사이에서 순 열 t-검정에 따라 P-value＜0.05인 통계학적 의미가 있는 변 이 부위를 추출하였다. 포함된 유전자와 함께 양성군을 기 준으로 음성군에 비해 보이는 변화를 배수로 계산하여 Table 4에 표시하였다. 가장 현저한 증폭을 보인 부위는 c-erbB-2가 포함되어 있는 17q12-21.1였고, 다음으로 17q12, Table 2. Patient grouping and number of repeated aberrations

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Number of Samples

aberrations number (ID #)

(gain/loss) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

All tumors 10 45/33

Histologic type

Invasive ductal 8 (78,88,28,86L,86R,26,58,2) 50/17

Other types 2 (66,34) 8/86

Stage

Early 5 (88,86L,86R,26,66) 137/96 Advanced 5 (34,28,78,2,58) 9/86 Tumor size

T1 2 (88,86R) 38/107

T2 6 (66,78,28,86L,26,58) 117/24

T4 2 (34,2)

Node

N0 6 (66,34,88,86L,86R,26) 58/50

N1-N3 4 (78,58,2,28) 7/12

Histologic grade

I 2 (86L,86R)

II 4 (78,88,26,2) 129/41

III 3 (66,28,58) 212/281

IHC

(1) ER status

0, weak (+) 5 (66,28,26,58,2) 117/34 Mod, strong (+) 4 (78,34,88,86L) 49/70 (2) PR status

0, weak (+) 4 (66,28,26,58) 111/27 Mod, strong (+) 5 (78,34,88,86L,2) 55/91 (3) C-erbB-2 status

0 5 (78,66,34,28,86L) 50/51

1+ 0

2+ 2 (88,58) 262/366

3+ 2 (26,2) 4/6

Neoadjuvant chemotherapy

No 7 (66,78,88,86L,86R,26,58) 191/149

Yes 3 (34,28,2) 6/67

Age

Less than 35 3 (66,78,34) 190/288 More than 35 7 (88,28,86L,86R,26,58,2) 62/19 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

Fig. 2. Unsupervised hierarchical analysis showing clustering of 10 cases of breast cancer based on the ratio of DNA copy numbers detected by a-CGH. Green means gain and red means loss.

(6)

17q21.1, 17q11.2 부위로 관찰되었다. 가장 현저한 감소를 보인 부위는 22q11.1과 15q11.2로 관찰되었다. 점액성 암종 과 침윤성 유두상 암종 환자에서는 a-CGH상 c-erbB-2 부위 의 변이는 없는 것으로 나타났다. 조직학적 등급이 높은 28 과 66번 예에서 IHC 및 a-CGH 모두 과발현은 보이지 않았 다.

(4) C-erbB-2 양성군에서 반복되는 획득 및 소실 양상:

c-erbB-2 양성군 내에서 반복되는 유전자 변이 부위를 찾아 보고 50% 이상인 경우를 추출하여 Fig. 4에 표시하였다.

Table 1에 표시한 바와 같이 반복을 보이는 부위획득이 137 개 소실이 33개 부위로 관찰되었다. 가장 대표적인 부위는 4예 모두에서 획득을 보인 17q12, 17q21.1 위치와 4예 모두 에서 소실을 보인 14q32.33, 22q11.1로 관찰되었다.

4) 기타 예후인자에 따른 a-CGH 소견

본 실험의 목적과는 관련이 없지만, 알려져 있는 임상적 예후인자에 따라 전체 환자군을 둘로 나누었고, 의미 있는 부위를 찾기 위한 방법으로 한편으로는 각 군에서 50%이상 반복되는 변이부위를 찾아보고, 또 한편으로는 순열 t-검정 으로 분석하여 의미 있는 유전자변이부위를 찾아보려고 시 도하였다.

각 군별로 변이가 50% 이상 반복되는 부분을 찾아보고 지면관계상 Table 2에 변이부위의 개수를 표기하였는데, 적 게는 4군데에서 366군데까지의 유전자변이가 관찰되었다.

조직형태는 크게 침윤성 관암종과 다른 형태의 침윤성 암 종으로 나누어 분류하였고, 병기는 2기 초기까지를 조기로 분류하였다. 2번과 34번 예의 경우 내원 당시 피부침범의 소견을 보여 T4로 분류하였으나, 수술 전 항암요법으로 부 분관해를 보였으므로 분석에서 제외하였다.

순열 t-검정을 통한 통계 분석의 결과로는, 병기에 있어서 2기에 비해 3기에서 의미 있게 증폭된 부위는 2q21.3, 감소 한 부위는 1q25.1-1q25.2, 2p22.1, 10p14, 10p12.31, 17q24.1에 서 관찰되었고, 조기에 비해 진행성 유방암에서 증폭된 부 위는 1p36.13, 12q24.31, 감소된 부위는 6q16.3, 8q23.1, 8q23.2로 관찰되었다. 호르몬 수용체의 면역염색 결과 중 에스트로겐 수용체 양성군이 음성군에 비해 의미 있게 증 폭된 부위는 14q11.2, 감소된 부위는 7p12.3으로 조사되었 고, 프로게스테론 수용체 양성군이 음성군에 비해 의미 있 게 증폭된 부위는 14q11.2, 감소된 부위는 2p25.3으로 조사 되었다.

고 찰

유전자 변이에 대한 분자생물학적 접근은 최근 수년 사 이에 인간유전체연구프로젝트를 통해 3억 염기쌍의 방대 한 전체 유전체 DNA에 대한 염기순서를 확인하고 정리하 는 작업이 마무리됨에 따라 의미 있는 유전자를 발견하고 새로운 가설을 설립하는 과정이 더욱 빨라지고 접근이 용 이하게 되었으며, 한 번의 조작과정을 통해 전체적인 DNA 변화를 확인하는 것이 가능하게 되었다. 대표적인 방법인 마이크로배열(microarray)은 비교유전체부합법(CGH), 유전 자발현, 전사인자 위치결정, 염색질/DNA 수정, 반복 순서분 Fig. 3. Copy number change in chromosome 17 of c- erbB-2 (+) patient (case 2).

Table 3. Concordance between ICH for c-erbB-2 and gain of chromosome 17q12-21.1 (plate # 2261 from macrogen) by a-CGH

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ IHC

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

+ -

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

Gain 4 0

a-CGH

Normal 0 4

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

(7)

석 등에 적용될 수 있는 방법으로, 이 중 본 연구에 사용된 a-CGH는 조사하고자 하는 유전자들을 한 슬라이드 내에 함 께 배치시켜 놓아 한번의 과정으로 DNA복제수 변화에 대 한 정보를 얻을 수 있도록 만든 도구이다.(6) 여러 부위의 유전자 변이가 복합적인 영향을 줄 것으로 알려진 암 연구 에서 후보종양유전자의 증폭이나 종양억제유전자의 상실 이 있는 위치를 찾아내는 데 유용하고, 유전되는 질환에서 염색체조각의 구조적인 증폭이나 소실을 포함하는 위치를 발견하는 데 도움을 줄 수 있다. 같은 목적으로 이전에 사용 하던 conventional CGH와 비교해 보면, 해상도가 뛰어나고,

중기 염색체확산 때에 부합시킬 필요가 없으므로 이미지 분석 작업이 간편해졌으며, 작업처리량도 월등하고, 원하는 유전체에 따른 제작이 가능하다는 여러 가지 장점이 있지 만, 균형전위의 경우 CGH와 마찬가지로 응용이 곤란하다 는 단점도 있다.(7) 집적도는 1997년에 2,000개가량에서 시 작하여, 최근에는 30,000개로 늘어나고 있다. 그러나 통계 적인 측면에서 신뢰도는 검사대상수와 유전자수가 비슷할 수록 높아지기 때문에 포함시켜야 할 샘플의 양도 더 많이 필요하게 된다는 단점도 있다.

본 실험에 사용한 BAC 클론 a-CGH의 배열소의 장점을 Table 4. Statistically significant chromosomal aberrations between c-erbB-2 (+) and (-) groups

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ

Regulation Location Cancer/Gene* Fold (C+to C-)^† P-value

Up 17q11.2 NF1, EVI2B, EVI2A, AK3P1, RAB11FIP4, 1.47 0.031

17q12 MLLT6, LOC284106, PCGF2, PSMB3, PIP5K2B, 1.39 0.015

17q12 NEUROD2, PPP1R1B, STARD3, 1.89 0.007

17q12 NEUROD2, PPP1R1B, STARD3, TCAP, PNMT, PERLD1, 2.10 0.007

17q12 NEUROD2, PPP1R1B, STARD3, 1.93 0.007

17q12-21.1 PERLD1, ERBB2, C17orf37, GRB7, ZNFN1A3 2.35 0.007

17q21.1 ZNFN1A3, ZPBP2, GSDML, ORMDL3, LOC342669, GSDM1, PSMD3, 1.77 0.007

17q21.1 THRA, NR1D1, LOC339287, CASC3, 1.50 0.031

17q21.1-17q21.2 LOC339287, CASC3, RAPGEFL1, 1.46 0.015

17q21.1-17q21.2 CASC3, RAPGEFL1, WIRE, 1.44 0.007

17q21.2 RARA, GJC1, LOC390791, TOP2A, 1.30 0.007

17q21.32 HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, 1.26 0.047

17q21.32 HOXB3, HOXB4, HOXB5, HOXB6, HOXB7, HOXB8, HOXB9, 1.30 0.039

Down 4q35.2 LOC442124, LOC441055, -1.21 0.047

15q11.2 LOC283755, -1.26 0.047

22q11.1 LOC391284, -1.30 0.007

22q11.1 LOC391284, LOC400879, LOC441969, -1.30 0.007

22q11.1 LOC391284, LOC400879, LOC441969, -1.23 0.023

*cited from macrogen data which referenced www.ucsc.edu; ^†C+ = c-erbB-2 (+); C- = c-erbB-2 (-).

Fig. 4. Frequent gain and loss regions (more than 50%) detected in 4 cases of c- erbB-2 (+) breast cancer by a-CGH.

(8)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 살펴보면, 첫 번째로 RNA를 이용하는 cDNAs 배열소처럼

mRNA 발현의 정보까지 한 번에 알 수는 없지만, 오히려 mRNA가 많이 손상된 파라핀 포매 조직에서도 검사가 가능 하고, 유전체 DNA를 제한효소로 자른 절편을 원료로 하므 로, genomic DNA의 전체적인 변화의 파악이 가능하다는 점 을 들 수 있다. 실제 임상에서는 동결절편조직의 장기보관 이 용이하지 않은 경우가 많고, 본 연구에서도 채택을 고려 하게 된 요인이었다. 처음 계획했던 전체 13예 중 10예 (77%)에서 만족한 품질의 결과를 얻을 수 있었다. 포르말린 고정시의 조건을 개선에 따라 더 나은 성적을 얻을 수 있을 것으로 생각한다. 두 번째로, cDNAs나 올리고핵산염 배열 소에 비해 신호강도가 좋다는 장점도 가진다. 신호강도는 조직에 따라 다를 수 있고, 약한 부분에서 의미 있는 부분이 발견될 수도 있으므로, 신호의 질이 아주 중요하다. 대조군 에 비해 의미 있는 증폭부위도 관심을 가져야겠지만, 같은 위치가 얼마나 자주 반복되는가도 중요하다고 할 수 있다.

본 실험에 사용된 칩은 2회 중복구조를 이용해 일치하지 않는 데이터를 제거하고 모든 예에서 동일하게 표현되는 유전자를 제거하는 등 정확도를 높이는 전처리과정을 거치 고 있다.

c-erbB-2는 1981년 ethylnitrosourea에 의해 화학적으로 유 발된 백서 신경아교모세포종(neuroglioblastomas)의 DNA를 이용한 형질전환 실험에서 확인된 유전자변이로서 처음에 는 neu로 이름이 알려졌었다. 이어서 1985년에 발견된 HER-2 또한 neu 백서 유전자와 상동체라는 것이 밝혀지면 서 HER2/neu 또는 c-erbB-2라는 이름으로 불리게 되었다.

이것은 세포막에 퍼져있는 185 kd 크기의 세포표면 당단백 으로서, 티로신 키나아제 가계의 일종이다. 즉, 성장인자가 세포막에 퍼져있는 이 수용체결합부위에 부착할 경우 티로 신 키나아제가 활성화되어 핵으로 신호를 전달하기 위해 이동하여 핵 내의 전사인자에 부착한 뒤 세포분열을 활성 화시키게 된다. 종양에서 이 부위의 변이가 있을 때 세포증 식이 통제될 수 없게 된다. 염색체 17q12-21.1에 위치하고 있는 이 원발암유전자는 EGFR와 밀접한 연관성을 가지지 만 분명히 달리 구분되는 유전자로서 성장인자 리간드의 EGF-like family와 반응을 한다.(8) 인간에 있어 유방, 난소, 자궁내막, 자궁경부, 폐, 위, 대장, 신장, 췌장암 등 여러 종 류의 암에서 변이가 흔히 발견된다.

c-erbB-2의 과발현 내지 증폭은 유방암 환자의 20∼25%

가량에서 발견되고, 이는 공격적인 성향이나 생존율 감소 등 나쁜 예후와 관련이 있는 예후인자로 간주되고 있 다.(9,10) 예측인자로도 알려져 있는 c-erbB-2는 과발현 유무 에 따라 어느 항암제가 좋은 반응을 보일지, 호르몬요법에 대한 반응이 어떨지, 그리고 가장 이슈가 되고 있는 면역요 법의 결과는 어떨지를 미리 짐작할 수 있다. 과발현이 있는 경우 비안트라사이클린 특히 알킬화 약물에는 효과가 적으 며, 안트라사이클린 계열에는 음성인 환자와 같거나 조금

나은 정도의 반응을, 그리고 taxane에 대해서는 더 효과적인 반응을 보여준다.(11,12) 호르몬 요법에 대한 반응은 c-erbB-2 양성인 경우 다소 떨어진다고 보고되고 있으나,(13) 최근에 는 ER 양성, c-erbB-2 양성인 경우도 호르몬요법을 진행하 는 것으로 의견이 모아지고 있다. c-erbB-2 세포 외 영역에 대한 단일클론항체는 c-erbB-2 과발현을 보이는 종양에서 시험관 내와 생체 내 모두 증식을 억제하는 것으로 알려져 있고, 다른 항암제와 병합요법으로 그 효과를 증대시키는 것으로 알려져 있다.(14,15)

c-erbB-2의 단일클론항체를 이용한 치료로 대표적인 trastuzumab (HERCEPTIN: Genetech, Inc., South San Francisco, CA, USA)은 최소한의 부작용, 우수한 항암효과, 항암제에 내성을 보이는 전이성 유방암 환자에 있어서의 사용가능성 등으로 인해 새로운 치료로서 많은 기대를 받고 있다. 치료 적응군의 확인에 있어 현실적으로 가장 많이 쓰이는 IHC는 검사실의 정도관리, 사용하는 항체의 효율 등의 문제로 센 터마다 결과에 큰 차이를 보이는 단점으로 인하여, 3+로 나온 경우는 치료를 바로 시행할 수 있지만, 2+인 경우에 는 FISH의 도움을 받아 유전자의 증폭이 관찰되어야만 치 료가 가능하다.(16) 그런데, 예상외로 단독제제 연구인 H0649g에서는 완전관해 8%, 부분관해 26%, 전체 반응률은 15%로 보고하고 있고, H0649g와 H0650g을 분석하면 1차 선택 약제로 사용하면 34%, 2차 선택 약제로 사용하면 19%

의 반응률을 보고하고 있다. 이러한 내성에 대해서는 아직 도 밝혀져야 할 부분이 많겠지만, 우선적으로 IHC나 FISH 의 정도관리를 강조하는 의견들이 발표되고 있다. 그러나 임상에서 확진에 사용되는 병리조직학적 진단과 달리, 분 자생물학적 진단에서 사용하는 수많은 검사들의 영역은 단 계별로 다양하게 구분되어 있기 때문에, 기준이 되는 검사 자체의 정확도 평가에는 한계가 있을 수 있고, 차라리 역으 로 임상적인 반응과 가장 일치하는 검사방법이 가장 도움 이 될 수도 있을 것이다.

다른 측면에서의 가능성으로, 수용체 단백질의 과발현은 해당 유전자의 DNA 복제수변화가 가장 중요한 원인이겠지 만, 종양의 경우 유전자의 다발적인 변화가 함께 일어나므 로, 동반발현 유전자로 인한 c-erbB-2 유전자의 mRNA로의 전사, 혹은 세포표면 수용체단백으로의 전이 또는 수용체 세포 외 부위의 유리 등의 전이 후 변형과정에 영향을 주어 이런 검사간의 불일치가 초래되었을 가능성도 있을 것이 다. 예를 들어 FISH 양성, IHC 음성의 경우, 위음성으로만 생각할 것이 아니라 c-erbB-2 위치는 발현이 증가해도 다른 미상의 유전자의 변이로 인해 c-erbB-2의 단백질 발현이 억 제되었을 수 있을 것이고, FISH 음성, IHC 양성의 경우 위 양성으로만 판단할 것이 아니라 c-erbB-2 부위의 DNA 복제 수 변화 없이 mRNA 발현만 증폭시키는 전사인자의 존재 가능성도 생각할 수 있을 것이다. 이처럼 중요한 종양유전 자, 종양억제유전자, 혹은 다른 생물학적 특징을 결정짓는

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나 결실이 반복되는 부위를 확인하는 것이라는 것을 고려 해볼 때, 유방암조직에서 c-erbB-2를 포함한 전체적인 DNA 변이양상을 관찰해 보는 것이, 임상적인 표현형의 다양성 을 이해하게 되는 첫 단계라고 생각하고 예비실험으로서의 본 연구를 계획하게 되었다.

대개의 연구논문에서 발현 데이터를 분석할 때는, 무감 시하 집락화와 감시하 집락화를 시행하여 의미 있는 유전 자를 분석 파악하게 된다. 무감시하 집락화의 하나인 계통 수는 임상적으로 미처 파악하지 못했던 분류자를 발견할 수 있는 유용한 방법이다. 물론 불균일성, 군의 선택, 기술 적인 문제 등으로 인해 군의 신뢰도가 떨어질 수 있다는 점과 동반발현 유전자 무리는 기능적인 연관이 있을 수도 있고, 하나의 반응에 있어 같이 증가된 것일 뿐일 수도 있다 는 점 등은 자료 분석시 주의해야 한다고 한다. 본 실험에서 는 무감시하 집락화를 통한 분석결과, 이전의 1K 칩을 사용 한 결과에 비해 많은 수의 유전자변이부위가 의미 있는 것 으로 나타나 각각의 파악에 곤란을 겪었고, 결과의 신뢰도 를 높이려면 정확한 실험 목적을 정한 뒤 가능한 많은 대조 군을 포함한 층화가 필요함을 다시 한 번 확인하게 되었다.

참고로 계통수를 통해 살펴본 본 실험의 양측성 유방암 환 자의 양쪽 조직의 변이는, 다른 보고에서와 마찬가지로 변 이양상에 상당한 차이를 보여주었으므로(17) 서로 다른 기 원에서 발생하였음을 추정할 수 있었다. 전이성 유방암 환 자의 경우에는 원발병변과 전이병변에서 유전자 변이양상 이 비슷함을 관찰하여 같은 기원에서 발생하였음을 추측한 보고도 있었다. 조직학적 형태에 따른 차이를 분석한 다른 논문에 따르면, 침윤성 유방암 환자의 15∼17%에서 c-erbB- 2 단백질 과발현을 관찰할 수 있고, 조직형태 및 세포등급 과 강한 연관성을 보이는데, Bilous 등의 보고에 의하면 침 윤성 관암종 이외의 관상암종, 점액성 형태의 경우 1% 미만 에서 침윤성 소엽암종에서 1% 미만, 그리고 낮은 조직학적 등급의 경우 1.4%에서만 양성을 나타내었고, 반대로 전체 156명의 HER2 3+예에서 68%는 3등급, 26%는 2등급으로 보고되었다.(18)

또 다른 분석도구인 감시하 집락화는 표본의 알려진 성 질을 이용하여 군을 나누고 t-검정 등의 분석도구를 이용하 여 두드러진 유전자를 검출할 수 있으며, 다행히 분류자를 발견하게 되면 다른 표본에 적용할 수도 있다. 17q21의 c-erbB-2위치 외의 변화를 양성군과 음성군에서 통계학적 으로 차이를 보이는 위치와 그 정도를 Table 4에 표시하였 는데, 그 중에 몇 가지만 유전자 주석을 찾아보았다. 최근에 는 유전자 주석을 참조하여 발견된 유전자들의 역할을 파 악할 수 있으므로, 서로의 연관성을 파악하기가 좀 더 용이해 졌다.(19) 우선 PERLD1 유전자는 PPP1R1B-STARD3-ERBB2- GRB7 amplicon 내에 위치하고 있으며, 세포 외 6개의 시스 테인 영역을 가진 7개의 세포막 수용체의 정보를 포함하는

것으로 보고되었다.(20) Grb7 유전자는 역시 같은 위치에 존재하면서 Grb10 및 Grb14 등과 함께 Grb7 family의 하나 로 유방암의 20∼30%에서 과발현이 관찰된다. 세포신호전 달과정에 관여하여 전이나 염증반응형성을 촉진하는 것으 로 알려져 있다.(21)ZNFN1A3 유전자는 조혈-특이적인 zinc finger 전사인자로서 임파구분화의 중요 조절인자이고 인간 에서 혈액종양의 발암단계에 관여하는 것으로 추측된 다.(22)NeuroD2 유전자는 신경세포의 분화와 연관이 있고, StAR 유전자는 스테로이드성 급성 조절 단백의 약자로서 콜레스테롤 결합 및 미토콘드리아 내의 전달에 관여하며, PNMT 유전자는 phenylethanolamine N-methyltransferase와 연관이 있다.(23-25) 그러나 이러한 유전자들은 대상수와 조사하려는 유전자 수의 불일치로 인해 잘못된 결론을 추 론했을 가능성을 항상 염두에 두어야 하므로 이후에 novel 하게 발견된 증폭이나 loss 부위에 대한 validation 실험이 필요하다.

비교대조군의 수가 적은 관계로 신뢰도에 대한 검증이 추가로 이루어져야 하겠지만, 본 연구에 사용한 4K a-CGH 칩은 파라핀 포매 조직에서도 유방암 환자의 조직에서 DNA 복제수 변화를 전체적으로 관찰하는데 처리효율과 정 확성 면에서 유용한 도구임을 보여주었다. 좀 더 정확한 치 료 적응군의 선택에 도움을 주기 위해서, 충분한 수의 대조 군의 보충과 함께, 추가적으로 임상적인 치료반응 차이를 보이는 군의 비교를 통해 c-erbB-2의 단일항체의 치료반응 에 실제적으로 영향을 주는 유전자변이를 파악하는 것도 필요할 것으로 생각된다. 계속적인 a-CGH 자료의 축적을 통해 중요한 분류자를 발견하게 되면 빠른 성장이나 전이 등 임상적으로 공격적인 종양의 특징을 예측할 수 있게 되 고 유방암 환자의 진료 및 치료에 있어 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

결 론

c-erbB-2 과발현군은 전체 유방암 환자의 20∼25%를 차 지하고 있고, 최근 단일클론항체치료가 이 군에서 많은 기 대를 가지게 했다. 그러나 20∼30%의 낮은 반응률을 보이 고 있고 그 내성의 기전을 전체 유전자의 관점에서 확인해 보고자 하였다.

비록 케이스 숫자는 작지만, 파라핀 포매 조직에서 추출 한 DNA를 사용한 a-CGH 실험이 유용하다는 것을 보여 주 었으며, c-erbB-2를 비롯하여, 각 임상 변수에 따른 군에서 유의한 유전자 변이의 차이를 볼 수 있었다.

a-CGH는 파라핀 포매 유방암 조직에서 전체 유전체 DNA의 복제수 변화를 관찰함에 있어, 많은 부위의 변화를 한번의 과정을 통해 비교할 수 있는 유용한 도구로 생각된 다. 향후 임상적인 치료반응에 따른 군의 비교를 추가 진행 하여 단일항체치료의 반응차이에 영향을 주는 유전자변이

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및 치료 그리고 예후판정에 도움이 될 것으로 생각된다.

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