자외선에 의한 피부 보습 감소에 양태반이 미치는 영향
박수정1․이민희1․윤정문1․김다경1․김옥경2
1경희대학교 임상영양연구소
2전남대학교 식품영양과학부, 생활과학연구소
Effects of Lamb Placenta on UVB-Induced Decrease in Skin Hydration
Soo-Jeung Park1, Minhee Lee1, Jeong-Moon Yun1, Dakyung Kim1, and Ok-Kyung Kim2
1Research Institute of Medical Nutrition, Kyung Hee University
2Division of Food and Nutrition and Research Institute for Human Ecology, Chonnam National University
ABSTRACT We investigated the potential effects of lamb placenta on UVB irradiation-induced decreases in skin hydration in vitro and in vivo. We found that UVB irradiation suppressed the mRNAs expression of procollagen type
Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1, and hyaluronan synthase 2 in back skin from UVB-irradiated hairless mice.
In addition, UVB irradiation decreased the skin hydration in hairless mice. However, dietary supplement of lamb placenta inhibited the decreases in the mRNAs expression of procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1, and hyaluronan synthase 2 and the skin hydration in UVB-irradiated hairless mice. Moreover, we found that lamb placenta treatment increased hyaluronan production while UVB irradiation decreased hyaluronan production in UVB-irradiated HaCaT cells. Therefore, these results confirmed the possibility that lamb placenta could be developed as a functional food material to increase skin moisturizing.
Key words: lamb placenta, UVB, skin aging, skin hydration
Received 26 October 2018; Accepted 17 December 2018 Corresponding author: Ok-Kyung Kim, Division of Food and Nutrition and Research Institute for Human Ecology, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-62-530-0344 Author information: Soo-Jeung Park (Researcher), Minhee Lee (Researcher), Jeong-Moon Yun (Researcher), Dakyung Kim (Re- searcher), Ok-Kyung Kim (Professor)
서 론
피부 노화의 요인으로는 내인성 피부 노화와 외인성 피부 노화로 나눌 수 있으며, 내인성 피부 노화는 시간에 따른 자연발생에 의한 현상이며 외인성 피부 노화는 공기, 자외 선, 오염 등과 같은 외부 요인에 의해 발생하는 현상이다(1).
이 중 자외선에 의한 노화가 대표적이며, 자외선에 의한 피 부 손상은 색소 침착, 주름 형성, 보습 감소에 의하여 노화를 유발한다(2). 피부조직의 최외각층인 표피는 이러한 자외선 조사에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있으며, 표피의 각질층은 피부 수분 증발을 방지하는 중요한 기능을 수행하기 때문에 자외선에 의한 손상으로 수분 감소가 일어나기 쉽다(3). 이 러한 피부 수분 감소는 건조하고 주름진 피부를 형성하게 하 는 요인이 된다. 각질층은 수분이 10% 이하로 감소하게 되 면 피부 장벽 손상으로 수분 손실량이 더욱 증가하여 피부가 거칠어지고 건조해진다. 따라서 피부에 충분한 수분을 보충
하는 것은 건강한 피부 유지를 위한 중요한 방법이다(4).
피부 각질층에서 히알루론산(hyaluronic acid)이 피부 보 습 작용을 하기 때문에 피부 노화억제를 위해 각질층의 히알 루론산의 유지가 중요하다(5). 히알루론산은 결합 조직, 상 피 조직 및 신경 조직에 널리 분포되어 있으며, 3분의 1은 매일 분해되고 합성되기 때문에 히알루론산 생성효소(hya- luronan synthase, HAS) 활성에 의해 농도 유지가 지속하 여야 한다(6). 자외선 조사가 피부염증 유발과 함께 히알루 론산 합성을 저해한다고 보고되었다(7). 또한 피부가 자외선 에 지속해서 노출되면 피부 표피에서 피부장벽 손상과 함께 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)의 발생과 전 염증성 사이토카인의 생성이 증가하여 염증반응을 일으킨 다. 그 결과 진피층의 collagen, elastin, fibrillin 등의 피부 결합조직이 감소하여 주름발생, 피부 수분 손실 등이 유발된 다. 따라서 피부 보습을 위해 피부 표피와 진피가 모두 정상 적인 역할을 할 수 있어야 한다(8). 이러한 기능성을 가진 천연물을 이용하여 피부 건강을 위한 건강기능식품 및 기능 성 화장품 개발이 지속해서 성장하고 있다(8,9). 피부 연구 에서는 주로 hairless 마우스를 많이 활용하는데 본 연구에 서는 HRM-2 마우스를 사용하였다. HRM-2 마우스는 털이 없고 멜라닌 색소를 합성할 수 있는 마우스로 주로 자외선을 조사하는 멜라닌합성 실험, 피부 감수성, 자극성, 장기적인 피하흡수실험에서 많이 활용되고 있으며, 피부의 collagen
Table 1. Primer sequences for real time PCR quantification of mRNA
Gene Primer sequences
GAPDH (M) F 5’-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’
R 5’-GCGGCACGTCAGATCCA-3’
Collagen type Ⅰ (M)
F 5’-GACCGTTCTATTCCTCAGTGCAA-3’
R 5’-CCCGGTGACACACAAAGACA-3’
Prcollagen type Ⅰ (M)
F 5’-TTACGTGGCAAGTGAGGGTTT-3’
R 5’-TGTCCAGATGCACTTCTTGTTTG-3’
Elastin (M) F 5’-TGGTGACATGATCCCTCTCTCTT-3’
R 5’-CCAGGGTGTCCCAGATGTG-3’
HAS2 (M) F 5’-TGGCTGTGTCCAGTGCATAAG-3’
R 5’-CACAAATTCATGCAGCAAGGA-3’
Fibrillin-1 (M) F 5’-ACAATTGTTCACCGAGTCGATCT-3’
R 5’-ACTGTACCTGGGTGTTGCCATT-3’
합성을 확인하는 실험에서도 활용되고 있다(10,11).
본 연구에서는 피부 보습의 효능을 가진 소재 개발을 위해 태반(placenta)의 효능을 평가하였다. 태반은 모체와 태아 사이의 물질 교환 및 임신을 위한 다양한 호르몬 분비를 위 한 기관이다. 태반은 proteins, lipids, hormones, glucosa- minoglycans, nucleic acids, vitamins 및 minerals 등의 생체활성물질을 보유하고 있고, 특히 피부의 주근깨, 주름, 보습 등에 효과가 있으며, 피부염, 피부각질 및 상처 등을 치료하는 데 사용되어 왔다. 또한 예로부터 태반의 좋은 성 분을 인지하여 약으로 사용하고 있다고 전해지고 있으며, 최근에는 태반주사를 노화 방지 및 질병 치료를 위해 사용하 고 있다. 하지만 인체 태반 사용에 대해 감염 위험 및 윤리적 인 문제로 사용이 어려워 동물의 태반을 이용하고 있다(12- 15). 따라서 본 연구에서는 양태반이 자외선에 의해 감소한 피부 보습에 미치는 영향을 동물실험과 세포실험을 통해 확 인하여 건강기능성 식품 개발의 가능성을 평가하고자 하였 다.
재료 및 방법
시료 추출 및 제조
실험에 사용한 양태반 분말(FSH-SP)은 동결된 상태의 양태반을 파편으로 잘게 절단하고 가염과 가온 후 발생한 액체층을 제거한 고형물만을 110°C에서 3시간 동안 건조시 켜 조분쇄, 유동성 개선제(말토덱스트린) 첨가, 미세분쇄 및 살균공정을 거친 시료이며 (주)프롬바이오(수원, 한국)를 통 해 공급받았다. 양성대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하 였으며 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입 하여 사용하였다.
동물처리 및 자외선 조사에 의한 보습 저하 유도
본 실험에서는 (주)새론바이오(Uiwang, Korea)에서 20 g 내외의 4주령 수컷 hairless HRM-2 마우스를 공급받았 다. 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23±2°C, 상 대습도는 50±5%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험 에 이용하였다. 적응기간 동안 AIN-93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 체중을 측정하여 평균체중 에 가까운 개체를 무작위법으로 6마리씩 6군으로 분리하였 다. AIN-93G 식이를 기본으로 하고 각 군당 시료를 첨가하 여 식이를 제작해 제공하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실 험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(KHUASP(GC)- 17-032).
자외선 조사는 UVB lamp(5 Sankyo Denky G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 최소 홍반량(minimal erythema dose, MED)을 150 mJ/cm2으 로 하여 1주일에 3회씩 mouse의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED(150 mJ/cm2), 2주는 2MED(300 mJ/cm2), 3 주는 3MED(450 mJ/cm2), 4주부터 6주까지 4MED(600
mJ/cm2)로 조사하여 보습 저하를 유도하였다. 6주의 실험 종료 후 각 군의 실험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.
RNA 추출 및 실시간 정량 PCR
배양한 세포와 피부조직으로부터 총 RNA의 추출은 TRIzolⓇ (Life Technologies, Inc., Rockville, MD, USA)의 제조사 에서 제공하는 방법을 이용하여 추출하였다. cDNA 합성은 각 시료에 대하여 1 μL의 RNA를 이용하여 iScript cDNA Synthesis kit(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)으로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위 하여 SYBR Green(iQSYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR(real time quantitative PCR)을 실시하였고, 기기는 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였 다. 모든 유전자의 PCR 산물의 크기는 100 bp 내외로 하였 고, Tm(melting temperature)값도 54°C 부근으로 디자인 하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 Table 1에 표시하였다. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2× SYBR mix, 2 μL cDNA, 1 μL씩 primer 각각 100 pmol/μL를 첨가하였다. Hot start를 위해 95°C에 서 10분, denaturation을 95°C에서 15초, annealing을 52°C에서 30초, extension을 72°C에서 30초간 반복하며, 증폭 cycle은 40 cycle을 실시하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. mRNA의 상대적인 함량은 자외선 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타내었다.
경표피 수분 증발량(TEWL: transepidermal water loss) 측정
피부의 보습 능력을 판정하기 위해 수분측정기(Howskin, Innoinsight Inc., Seoul, Korea)의 전자단자를 마우스 등 부분에 접합하여 본 실험 6주 차에 피부 경피 수분 손실량을
Table 2. Body weight gain, food consumption, FER, and tissue weights Group1) Weight gain (g)2) Food consumption
(g/d)3) FER4) Tissue weights (g)
Liver Kidney Spleen NC
C PC PL PH
5.25±0.52a 3.86±0.98b 4.07±0.75ab 3.45±1.31b 4.10±0.63ab
3.75±0.47ns 3.96±0.60 3.78±0.42 3.83±0.39 3.77±0.62
4.69±0.35a 2.91±0.66b 3.53±0.65ab 3.26±1.30b 3.56±0.55ab
1.28±0.13ns 1.23±0.07 1.25±0.09 1.26±0.09 1.22±0.10
0.41±0.04ns 0.42±0.02 0.43±0.03 0.40±0.03 0.41±0.01
0.12±0.03ns 0.12±0.04 0.10±0.01 0.10±0.02 0.10±0.03
1)NC: AIN93G, C: AIN93G+UVB-induced low hydration, PC: AIN93G+L-ascorbic acid 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PL: AIN93G+placenta 100 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PH: AIN93G+placenta 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration.
2)Weight gain (g/12 weeks)＝final body weight (g)－initial body weight (g).
3)Food consumption (g/d): total food consumption for 12 weeks (g/d).
4)FER (food efficiency rate)＝[weight (g)/ food consumption (g)]×100.
Different letters (a,b) indicate a significant difference among groups at P<0.05, as determined by the Duncan’s multiple range test.
ns: not significant.
측정하였다.
세포 배양 및 자외선 조사에 의한 보습 저하 유도 HaCaT 세포를 배양하여 6-well plate에 1×106 cells/
well을 분주한 후 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 DPBS 로 세척하고 UVB lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co.)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사한 후 양성 대조군인 L-ascorbic acid 및 양태반 분말을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다.
히알루론산 분비량 측정
상층액을 분리하여 hyaluronan 분비량 측정을 R&D Sys- tem kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 이용하 여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
통계처리
본 연구는 SPSS(Statistical Package for the Social Sci- ence) version 22 프로그램(IBM, New York, NY, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표 준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. Duncan’s multiple range test를 실시하였으며 P<0.05 수준에서 유 의성 여부를 검증하였다.
결과 및 고찰
실험동물의 등 피부조직에서 피부보습인자 유전자 발현량 자외선 중 특히 UVB(290~320 nm)에 대한 과다한 노출 은 주름 형성, 건조하고 거친 피부, 불규칙한 색소 침착 등의 광노화(photoaging)에 의해 피부의 손상을 초래한다. UVB 에 의한 피부표피는 진피의 손상까지 유도하여 피부 탄력과 보습을 조절하는 collagen, elastin, fibrillin 등의 피부결합 조직의 감소가 일어난다(16). 피부에 가장 풍부한 단백질은 collagen이며 체내 콜라겐의 90% 이상이 collagen type Ⅰ 이며 이는 procollagen type Ⅰ으로부터 생성된다(17). 따
라서 본 연구에서는 양태반 분말 식이제공이 UVB를 조사한 hairless의 등 피부 조직에서 procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1의 mRNAs 발현에 미치는 변화 를 관찰하였다. 양태반 분말과 양성대조군인 비타민 C를 섭 취한 마우스의 무게, 식이효율 및 조직 무게의 변화는 UVB 를 조사한 마우스와 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 2). UVB를 조사한 마우스의 조직에서 procollagen type
Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1의 mRNAs 발현 모두 정상군과 비교하여 유의적으로 감소하였음을 확인하 였다(Fig. 1)(P<0.05). 양성대조군으로 사용한 비타민 C를 섭취한 군에서는 procollagen type Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1의 mRNAs 발현을 UVB 대조군(C)과 비 교하여 모두 유의적으로 증가시켰다(Fig. 1)(P<0.05). 반면 양태반 분말을 고농도(PH)로 섭취한 동물에서는 UVB 대조 군(C)과 비교하여 procollagen type Ⅰ과 elastin의 mRNAs 발현이 유의적으로 증가하였고, collagen type Ⅰ의 경우 고농도(PH)에서 UVB 대조군(C)에 비해 증가하는 경향은 나 타났으나 유의성은 나타나지 않았다(P<0.05). 또한, colla- gen type Ⅰ과 collagen fiber의 일종인 fibrillin-1의 mRNA 발현의 경우 양태반 저농도(PL)와 고농도(PH)군 모두 UVB 대조군(C)에 비해 증가하는 경향을 보였으나 유의성이 나타 나지는 않았다(Fig. 1)(P<0.05). 따라서 양태반 고농도 섭취 (PH)가 피부 보습과 탄력을 관장하는 결합조직인자의 유전 자 발현량을 증가시켜 피부보습기능에 효과가 있을 것이라 고 기대할 수 있다.
실험동물의 등 피부조직 HAS2 발현량과 표피 수분 함량 측 정 결과
피부에 존재하는 히알루론산은 섬유모세포 및 각질형성 세포에서 형성되며 다당질의 구성 성분으로 다당류가 많이 들어있어 수분을 상당량 함유할 수 있는 특징이 있다. 인체 에 존재하는 전체 히알루론산의 50%가 피부에 존재하며 이 는 히알루론산 생성효소(hyaluronan synthase, HAS)에 의 해 합성된다(18). 히알루론산은 무게가 자신의 1,000배인
ab
bc ab
c a
0 0.5 1 1.5
NC C PC PL PH
Procollagen type I .
A
ab
b a
b a
0 0.5 1 1.5
NC C PC PL PH
Collagen type I .
B
abc
cd ab
d a
0 0.5 1 1.5
NC C PC PL PH
Elastin .
C
bc bc b
c a
0 0.5 1 1.5
NC C PC PL PH
Fibrillin-1 .
D
Fig. 1. Effects of placenta on mRNAs expression of procollagen type Ⅰ (A), collagen type Ⅰ (B), elastin (C), and fibrillin-1 (D) in back skin from UVB-irradiated HRM-2 mouse. NC: AIN93G, C: AIN93G+UVB-induced low hydration, PC: AIN93G+L-ascorbic acid 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PL: AIN93G+placenta 100 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PH:
AIN93G+placenta 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration. Different letters (a-d) indicate a significant difference among groups at P<0.05, as determined by the Duncan’s multiple range test.
a
ab a
b a
0 0.5 1 1.5
1 2 3 4 5
HAS2 .
NC C PC PL PH
Fig. 2. Effects of placenta on mRNAs expression of hyaluronan synthases 2 in back skin from UVB-irradiated HRM-2 mouse.
NC: AIN93G, C: AIN93G+UVB-induced low hydration, PC:
AIN93G+L-ascorbic acid 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PL: AIN93G+placenta 100 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PH: AIN93G+placenta 200 mg/kg b.w.+UVB- induced low hydration. Different letters (a,b) indicate a signifi- cant difference among groups at P<0.05, as determined by the Duncan’s multiple range test.
ab
ab bc
c a
0 10 20 30 40 50
1 2 3 4 5
Skin hydration (%) .
NC C PC PL PH
Fig. 3. Effects of placenta on skin hydration in back skin of UVB- irradiated HRM-2 mouse. NC: AIN93G, C: AIN93G+UVB-in- duced low hydration, PC: AIN93G+L-ascorbic acid 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PL: AIN93G+placenta 100 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration, PH: AIN93G+pla- centa 200 mg/kg b.w.+UVB-induced low hydration. Different letters (a-c) indicate a significant difference among groups at P<0.05, as determined by the Duncan’s multiple range test.
수분과 결합하여 피부장벽 기능의 조절과 세포외 기질을 수 화시켜 조직 내 수분의 항상성을 유지시킨다고 알려져 있다 (19). 본 연구에서는 UVB를 조사하여 피부보습을 저하시킨
마우스의 등조직에서 HAS2 mRNA 발현량과 피부조직의 경피 수분 함량을 측정하였다. UVB를 조사한 마우스의 조 직에서 HAS2 mRNA 발현량(Fig. 2)과 경피 수분 함량(Fig.
3) 모두 정상군과 비교하여 유의적으로 감소한 반면, 양성대
b c e c b
d f a
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
NC C 50 100 200 50 100 200
Concentration (μg/mL)
Hyaluronan (ng/mL) .
L-ascorbic Placenta
Fig. 4. Effects of placenta on hyaluronan production from UVB- irradiated HaCaT cells. Different letters (a-f) indicate a signifi- cant difference among groups at P<0.05, as determined by the Duncan’s multiple range test.
조군으로 사용한 비타민 C를 섭취한 동물(PC)과 양태반 분 말을 고농도(PH)로 섭취한 동물에서 UVB 대조군(C)과 비 교하여 모두 유의적으로 증가하였다. 이러한 비타민 C와 양 태반 분말을 고농도로 섭취한 동물의 HAS2 mRNA 발현량 (Fig. 2)과 경피 수분 함량 증가(Fig. 3) 결과는 정상대조군 (NC)과 비교하여 유의적인 차이가 없었다(P<0.05).
HaCaT 세포에서 자외선 조사에 의한 히알루론산 분비량 변화 측정
히알루론산의 합성은 주로 피부 표피에서 활발하게 일어 난다(16). 따라서 본 연구에서는 자외선을 조사한 각질형성 세포 HaCaT 세포주를 이용하여 양태반이 히알루론산 분비 에 미치는 효능을 관찰하였다. 히알루론산 분비량을 측정한 결과 UVB를 조사한 자외선 조사군(C)는 정상대조군(NC) 에 비해 유의적으로 히알루론산 분비량이 감소하였다. 반면 자외선 조사군(C)에 비해 양성대조군(L-ascorbic acid) 및 양태반 분말(placenta)군 각각 농도 의존적으로 증가하였음 을 확인하였다(Fig. 4)(P<0.05).
최근에 Lee 등(20)의 양태반이 피부각질형성세포에 미치 는 영향을 살펴본 연구에서 자외선 처리에 의한 염증 유발 및 세포손상, HAS2의 발현 감소를 억제시켰음을 보고하였 다. 뿐만 아니라 또 다른 연구인 Lee 등(21)의 연구에서는 발효 돈태반이 자외선 조사한 마우스의 피부에서 주름 생성 및 홍반을 감소시키고 피부 수분 함량과 콜라겐 생합성을 증가시켰음을 확인하였다. 이러한 연구 결과들과 본 연구 결과를 통하여 태반의 피부 보습기능을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 피부 건강을 위한 건강기능성 식품 개발 소재 로서 활용의 가능성이 높음을 알 수 있다.
요 약
본 연구에서는 양태반이 자외선에 의해 감소한 피부보습에
미치는 영향을 살펴보고자 양태반 분말 식이를 투여한 UVB 조사 동물의 피부조직을 관찰하였다. 그 결과 양태반 분말 식이를 투여한 동물에서는 UVB에 의한 procollagen type
Ⅰ, collagen type Ⅰ, elastin, fibrillin-1의 mRNAs 발현 감소를 유의적으로 억제시켰으며 HAS2 mRNAs 발현 감소 또한 억제되었다. 동물의 등 피부에서 경피 수분 함량을 측 정하여 양태반 분말의 섭취가 피부 수분 함량을 증가시켰음 을 확인하였다. 따라서 이러한 결과를 통하여 양태반의 피부 보습 작용을 확인함으로써 기능성 식품 소재로서의 가능성 을 확인할 수 있었다.
감사의 글
본 연구는 산업통산자원부와 한국산업기술진흥원의 ‘사업 화연계기술개발사업’(과제번호: N0002384, 2017)의 지원 에 의해 수행되었습니다.
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