Uncertainty Evaluation of the Analysis of Methamphetamine and Amphetamine in Human Hair by GC/MS

간크스삐^

GC/MS

측정몰확도 평가

김진영* • 김종상* • 김민경 • 이재일 • 서용준 • 인문교 대검찰청 마약감식실, *한국건자재시험연구원 품질경영부

(Received April 2, 2007; Revised April 25, 2007)

Uncertainty Evaluation of the Analysis of Methamphetamine and Amphetaminetne Analysis or ivietnampne in Human Hair by GC/MS

Jin Young Kim끓, Jong Sang Kim*, Min Kyoung Kim, Jae II Lee, Yong Jun Suh and Moon Kyo In

Drug Analysis Laboratory, Supreme Prosecutors' Office, 706, Banporo, Seocho-gu, Seoul 137-730, Korea

^Department of Quality Management, Korea Institute of Construction Materials, Seoul 137-073, Korea

Abstract - Recently estimating the uncertainty of an analytical result has become an essential part of quantitative analysis.

This study describes the uncertainty of the measurement for the determination of methamphetamine and its major metab­

olite amphetamine in human hair. The method consists of washing, drying, weighing, incubation and extraction with meth- anolic HCl solution, clean-up, trifluoroacetyl derivatization, and qualification/quantification of residues by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Traceability of measurement was established through traceable standards and calibrated volumetric equipment and measuring instruments. Measurement uncertainty associated with each analyte in real samples was estimated using quality control (QC) data. The main source of combined standard uncertainty comprised two components, which are uncertainties associated with calibration linearity and variations in

QC,

ative combined standard uncertainties associated with the described method ranged for individual analytes from 4.99 to 5.03%.

Keywords □ uncertainty of measurement, methamphetamine, amphetamine, hair-analysis, GC/MS

데스암페타민(methamphetamine, MA)은중주신경 흥분효과 가있는마약으로암페타민계향정신성의약품의일중이다.^* 흔 히국내에서는필로폰, 히로뽑, 봉등으로불린다. MA는부서지 기쉬운결정체또는분말형태로물이나알코올에잘용해된다. 정맥주사, 코흡입, 흡연및경구투여가가능하나주로정맥주사 방법으로남용된다. 정맥주사인경우 1회시^량은 약30 mg이 다.2'® 메스암페타민은자신감, 만족감, 홀 불 면 중 등을일으키 는효과가있으며, 중독자인경우동공산대, 혈압증가, 맥박증가, 손떨림등의증상을보인다. 또한MA를복용한사람미 긴급상 황에서초인적인능력을발휘하는경우가있는데이는MA가에 피네프린, 노르에피네프린호르몬과유사한기능을하기 때문인

*본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-535-4173 (팩스) 02-535-4175 (E-mail) [email protected]

것으로알려져었다:«

국내에서가장많이남용되는마약류성분인 MA의불법적인 복용여부는일반적으로소변이나모발을이용하쉬확인한다. 소 번의경우는복용후3~5일이지나면MA 성분이체외로모두 배설되기 때문에복용여부를확인하는것이어렵다. 반면에모 발을이용하면수개월견에복용한사실을확인하는것이가능 하다. 그리고모발은복용시기나정도등약물남용이력을추정 하는것도가능하다.®이러한장점때문에모발이마외= 성분의 복용여부확인에많이이용되고있다. 으^

모발에서마약성분을분석하여 얻은결과를근거로복용여부 률관정하는모발감식은분석결과에대한신뢰도가메우중요하 다. 지금까지모발감식에서 개별시료의분석결과의신뢰도률정 량적으로표현하는방법은없었다. 다만감식기법을개발할때 설시하는분석방법에대한검증(validation)과실제시료률분석

할때품질관리(QC) 과정을실시함으로서분석결과의신뢰도를

데스암페타민 및 암페티민 모발분석의 측정불확도 평가 207

보증하고자하였다. 이러한분석결과보증방법은법과학분야 에서지금까지일반적으로사용되었다. 그러나서로다른기관 이나국가서1서이루어진감식인경우그결과률서로직접비교 평가하는것은한계가있었다.

그러므로사람의구속여부에직접증거가되는분석을실시하 는법과학분야에도분석결과의 신뢰도률정확하고객관적으로 표현하는방법으로측정불확도(uncertainty of measurement) 개 념을도입하였다.

측정불확도는 '측정불확도 표현 지첨서'(Guide to the ex­

pression of Uncertainty in Measurement, GUM)에따르면 ''죽 정결과에 관련하여 측정량을 합리적으로 추정한 값의 분산 (dispersion) 특성을나타내는파라미터이다"로정의되어있는죽

정량(measurand)의존재 범위를의미한다. 여기서 측정량은측

정의대상이되는특정한양을말한다.

본 연구는모발에서 MA 및암페타민(amphetamine, AP) 성 분을분석하는과정에서결과에영향을즐수있는요인둘을찾 아내어, 관계식을설정하고, 요인별측정값로부터 표준불확도 (standard uncertainty), 합성표준불확도(combined standard uncertainty) 및확장불확도(expanded uncertainty)를구하였다. 이러한분석결과는측정량이평균값을중심으로어느범위에있 는가를불확도룰포함시키는방식으로표기하였으며, 불확도요 인둘에 대한측정불확도평7뿔 통하여 시험법개선및오차요 인의영향을감소시키는데활용하고자하였다.

실험 방법

분석에사용된장비는미국 Agilent Technologies사 6890 Gas Chromatograph(GC)에 5975 Mass Selective Detector가연결된 GC/MS률사용하였다. 분리관은 DB-5MS(25 mxO.25 mm I.D., 0.25 nm film thickness, J&W Scientific, USA)률 사용하였다. 분러관온도는처옴 90°C에서 3분간유지시킨후, 15°C/min으 로 170°C까지온도률을려 3분간유지시키고, 계속하쉬 상승속 도률 25°C/min으로바꿔 210X까지 온도률울려 1.5분간유지 시켰다. 다시 한번 2(fC/min으로 230°C까지 온도률을려 0.5분 간유지시킨후, 마지막으로 35°C/min의상승속도로 300°C까

지온도룰올리고 0.5분간유지시켰다. 주입구와검출기 부위의

온도는각각 260°C와 280T로설정하였다. 운반기체 헬륨의유 속은 로고정하였고, 주입방법은비분할방식 (splitless mode)으로 purge-on time을 0.1 분으로설정하였다. 시료는미국 Agilent Technologies사 7683B 지동주입장처 (autosampler)틀사 용하쉬 분석장비에주입하였다.

모발 시료

2006년 10월부터 11월까지 2개월동안수도권소재검찰청으

로부터 감식 의뢰된 MA 남용용의자의 모발을 연구용시료로

사용하였다. 그리고약물을복용하지 않은사람의 모발을 채취 하쉬대조모발시료로사용하였다.

시료의 세척 및 추출

시험은'모발중암페타민계홍분제감식기법'(SPO-DRUG-QA- 05, 2006)에규정된방법에 따라실시하였다.^^^

시약

표준물질과내부표준물질은각각 Im / 용량의 유리병(vial)에 1 mg/m/ 농도로제조된 AR MA와 1

ml

rd

시용된용매및시약은특급이며미국 J. T. Baker사에서구입하

였다. 정제용 카트리지 (fritted reservoir)와 유도체 시약인 trifluoroacetic anhydride(TFAA)는미국 Alltech사로부터구입하 였다. 추출용매 조제에 사용된 acetyl chloride는 미국 Sigma-

Adrich사 제품이다. 그리고보관표준용액은각각의 표준물질을

methan이에녹여순차적으로 100, 10, 1, 0.1 ^g/m/ 농도로희석 시켜조제e]였으며,사용하기 전까지는 -20°C에서냉동보관하였다.

기기 및 분석 조건

표준용액의 희석액을조제하기위해득일 Brand사의용량폴 라스크(10 mi)와득일 Eppendorf사의피벳 (1000 |j/)를사용하였 다. 무게측정은전기식지시저울(MCI, Sartorius, Germany) !：

사용하였다.

Human Hair {20 mg)

Washing hair sample ) remove external contamination

Rinse with 10 m/ of ultra-pure HjO (twice) and then 10 ^ml of acetone (HPLC grade)

Drying the hair

Cut in small fragments Weigh the hair sample

Extraction

Add internal standards and 2 m/ of 0.25 M methanolic HCl under sonication at 50 °C for 1 h

Derivatization

Inject 1 ^[U into GC/MS

GC/MS

Fig. 1 - Preparation procedures of hair sample for the analysis of AP and MA.

Vol. 51, No. 3, 2007

김진영 • 김종상 • 김민경 ■이재일 • 서용준 • 인문교

모발시료 20m gi：시험관(16X125 mm)에넣은후, 증류수 10 m/로 2회 , acetone 10 m/로 2회진탕하:H 세척하였다. 세척된 시료률무균상에서 1시간동안건조시키고외과용가위률이용

하여 1 mm 이하로절단한후, 무게를측정하였다. 청량한시료

률시험관(16X100 mm)에넣고내부표준물질 AP■싸, M tW ii의 methanol 흔합표준용액(1 ppm) 75|ji를첨가하였다. 여기에추출 용매 0.25 M methanolic HCl 용액 2 m/를가해 5(fC에서 1시간 동안초음파추출하였다. 추출액을여과한후, 일정압력(30 kPa)

과온도(45°C)로질소기류하에서중발시켰다. 증발건고잔사서1

ethyl acetate 50 m/와유도체 시약 TFAA 50 를가하여 70°C 에서 30분간유도체 반움을시켰다. 시료를상온으로냉각하여

질소기류 하에서 중발하여 건조시킨 후, 건고된시료를 ethyl

acetate 4 0 I p ® GC/MS에주업하여분석허였다(Fig. 1).

검량선 작성

정량범위는모발중에 존재하는농도를고려하여 성분별로

농도범위를정하고, AP와 MA룰혼합한 3가지농도의표준용

액(10, 1, O.lug/m/)을 대조 모발 시료에 첨가하여 검량선

(calibration curve)을작성하였다. MA와 AP의정량농도범위는

0.1-5.0 ng/mgS. 정하여메탄을에녹여흔합표준용액을제조하

였다. 내부표준물질 용액은 M A ^ii와 AP■남g을 메탄올에녹여

1 ng/m/ 농도로제조한흔합내부표준용액을 75 ^J/룔취하식혼

합표준용액에 넣은다옴시료와동일한방법으로처리하여분 석하였다. 흔합표준용액 1 M/룔 GC/MS에주입하여분석하였으 며, 그결과로부터검량선을작성하였다.

QC 시료의 정밀도

대조모발시료에흔합표준용액 0.3

ng/mg

고, 시료와같은방법으로처리분석한후, 측정된잉을비교하 여정밀도롤검토하였다. 일간(interday) 정밀도는 5일간매일반 복하여측정하였다.

불착도 요인 및 측정량 관계식

모발에서 MA 및 AP 성분의분석과정은시료의세척과건조,

무게측정 , 성분추출과정제등을포함흐}는전처리 및 GC/MS 장비를이용한기기분석과정으로구분된다.

모발에서 MA 및 AP의농도측정에 관계되는불확도요소

는크게시료무게측정과정에서 발생하는불확도, 분석에사 용된표준용액을 희석할때발생하는불확도, 분석 결과로부터 측정값을 계산하는과정에서 발생하는검량선에 대한불확도, 그리고측정이 시간을두고반복적으로이루어질때측정기기 의상태변화에의해생기는불확도등의 4가지요소로나눌수 었다.

따라서모발에서 MA 및 AP 성분분석결과로부터각각의농

도룰산출히는불확도요인을고려한관계식을다옴과같이설 정하였다.

Wm

~ 표 ' ^ ^ ' 오std ' 궁c a l' 궁variation

Cj : 모발에서측정한 MA 및 AP 성분의농도 X ; y-b/m , 작성된검량선에서의농도측정값

: 측정된모발의무게

Wo : 측정기준무게(20 mg)

4td ：희석된표준용액의 농도편차율 4ai ：검링곡선의 직선성에의한편치*ir Variation ： QC 시료의편치율

(1)

Sample Standard Solutions

Weight

Stock standard Solution (1 Working standard Solution (Wl) ' Volum<

Flask (Vor) Working standard

Solution (W3) ^{^ ^ \}

Vor Pipette Pipette Wl

Working standard Solution (W2)

Working standard Solution (W4)

^ ^예 Precision

Run Control (QC variation) Calibration Curve Fig. 2 - Uncertainty factors associated with measurement results.

Results

Standard Regression

Table I - Uncertainty estimation of weight by the repetitive meas­

urements

No. Weight (mg)

9 2 0 . 0 2

1 0 19.98

Mean ^{2 0 . 0 2}

Degrees of freedom 9

Standard uncertainty 0.0162

었다.

^ (2)

(^나Wmg~ V (^나cert'l) ^우 (^난rep'l) > '^0 * ^오산피§)

^eff- ⁽³⁾

표준용액 조제과정의 불착도 평가

표준§ ■액은 필요에 따라 보관표준용액 (stock standard solution, S>을 희석 제조하쉬 사용한다. 표준용액 조제과정의 불확도는 보 관표준용액의 순도, 사용된 volumetric flask 및 pipette의 요인 이 포함된다.

보관표준용액울 10배 희석한 1차 표준용액(1st working standard solution, Wl>을 제조하는 파정의 불확도 산출을 위하 여 먼저 보관표준용액의 불확도를 확인하였다.

보관용 표준뮬질의 인증서로부터 순도를 확인히쉬 표준불확도 (Upurity(s)) 및 상대표준불확도(U대urity(s))를 계산하여 Table II에 정 러하였다. 보관표준물질의 순도에 적용된 표준불확도는 직사각 형 모양의 분포함수에 따르는 B형 불확도 평가 방법을 이용하여 계산하였고, 상대표준불확도는 표준불확도를 초기 농도로 나누 어 구하였다.

Table II - Uncertainty of purity of amphetamine and metham- phetamine

Analyte Concentration range (mg/ml)

Standard uncertainty

어 purity(S)^

Relative standard uncertainty

purity(S)^

AP MA

0.987±0.001 1.027±0.002

0.0005774 0.0011547

0.0005850 0.0011243 MA와 AP의 농도률 산줄하는 관계식 (1)에 포함된 불확도 요

인돌을 Fig. 2에 도식화하여 나타내었다.

모발 중 MA와 AP 성분의 양을 시료 무게로 나누어 농도로 표현하므로 관계식에 시료 무게에 대한 요소가 포함되었다.

는 표준용액을 희석하면서 발생하는 희석 오차에 대한 요소이며, fvariato은 설제 MA의 복용자의 모발을 분석할 때 발생할 수 있 는 요인(기질의 영향, 측정시스템의 안정성, 선형성 및 재현성 등) 을 품질관리(QC) 시료에 대한 정밀도로 반영하여 나타낸 것이

^ 18,19)

본 연구는 대조 모발을 포함한 모든 시료에 동위원소로 치환 된 내부표준물질을 첨가하는 내부표준법을 시용함으£ 서 분석과 정 중 견처리단계에서 발생할 수 있는 불완전한 추출, 용매의 증 발, 컬럼통과시 손실되는 양과 시험자의 조작 손실 등은 보정되 는 것으로 가정하였다.

결과 및 고찰

불확도 평가는 GUM의 절차를 근거로 요인벌 관게 모델(입력 량과 출력량의 함수식 표현)의 설정, 입력량의 표준불확도 산출, 합성표준불확도 및 확장불확도의 계산 4단계로 크게 나눌 수 있 다. 측정모델에 포함된 개개 요인의 불확도 요소로부터 표준불 확도를 산출하고, 모든 표준불확도를 합하식 합성표준불확도돌 구한다. 그리고 합성표준불확도에 신뢰 수준에 상당하는 포함인 자(coverage fector, k)를 곱하여 확장불확도률 구한다.효®

시료의 무게 측정과정의 불착도 평가

분석 대상 성분의 농도 값에는 시료 무게률 측정하는 과정에 서 발생하는 불확도 요인이 포함되어 있다. 측정 과정에서 발생 하는 불확도는 저울 자체의 불확도(u„^rti)와 반복 측정에서 오는 불 확 도 로 나눌 수 있다.

저울 자체의 불확도는 교정성적서 자료를 활용하였다. 교정성 적서로부터 95%의 신뢰수준에서 불확도(k=2)가 0.02 mg임을 알 수 있었다. 그러므로 저울 자체의 표준불확도(u,erti)는 0.01 mg 로 하였다.

무게를 반복 측정할 때 발생하는 불확도는 시료의 기준 무게 (Wo)에 해당하는 20 mg의 분동을 저울로 10회 반복 측정하여 얻 은 값의 표준편차률 표준불확도로 정의하였다(Table I). 따라서 반복 측정에 의한 표준불확도(u„^p.i)는 0.0162 mg임을 알 수 있 었다.

불확도 전파 법칙에 따라 시료 무게 측정 과정의 합성표준불 확도(uwmg)는 0.0190321 mg이었고, 분석에 사용한 시료량을 고 려한 상대표준불확도(u^ wmg)는 식 (2)에 따라 계산콩t여 0.0009516 을 얻었다. 유효자유도(v^ff)는 요인별 표준편차의 자유도를 식 (3) 의 Welch-Satterthwaite equation에 적용하여 구한 걸과 17.2이

Vol. 51, No. 3, 2007

메스암페타민 및 암페타민 2 발분석의 즉정불확도 평가 209

20.02

20.01

20.01 19.99 19.98 20.00 19.99 20.02

210 김진영 ■김중상 ■김민경 ■이재일 • 서 • 인문교

표준용액희석에시용된 volumetric flask에의한불확도발생

요소는 flask 자체의불확도, 온도에 의한불확도, 반복측정할

때나타나는불확도세가지로생각된다. volumetric flask 자체 의불확도는교정성적서로부터 95%의신뢰수준에서불확도(k=2) 가 0.008 m/임으로표 준 불 확 도 는 0.004 m/을알수있었 다. 온도에 의한표준불확도는 팽창계수가 0.00025 mTC이고

실험실내 온도 조건이 20±5°C이므로 표 준 불 확 도 는

0.0007217 m/임을알수있었다. 부피반복측정의불확도는 10 m * 10희번복측정한결과로부터표준불확도(u^띠,2>는 0.0001398 XDlS. 계산되었다.

불확도전파법칙에 따라 volumetric flask를이용한부피측 정에서의합성표준불확도Kor)는 0.0042378m/이었고, 유효자유 도(%남)는 760으로계산되었다. 그리고상 대 표 준 불 확 도 는 식 (4)에적용하여 0.0004238의값을구하였다.

•^rvol'^{, U y o r}

~ V ( ^ c e r t '2) ( ^ t e m p ') 우(간re p ') > 지 10 ml)

1차표준용액 (W1)의조제과정에서 발생하는불확도에영향을 머처는인자는보관표준물질의순도와 volumetric flask에의한 두가지인자로부터식(5)에적용하여상대표준불확도(u^tdovi)) 를산출하였고, 그값을 Table HI에정러하였다.

std(W l) = V ( ^ r p u r it y ( S ) ) ( ^ r vo l') (5)

2차표준용액 (W2)은 1차표준용액을다시 10배희석하여 제

조한다. W2 제조시 예상되는불확도는 1차표준용액의 불확도,

희석에시용된 volumetric flask 인자, pipette 작업에의한인자 세가지를 식(6)에 적용하여 2차표준용액의 상대표준불확도 (Ur«d(W2))를산출하였다. 동일한방법으로식(7)과 (8)에적용하 여 3차표준용액(W3) 및 4차표준용액(W4)에대한각각의상대 표준불확도를계산하여결과를 Table III에추가하였다.

나r s t d( W2) ~ pi pet' ) 우(난r v o l') ( ^ r s t d ( W l) )

I

std(W3) ~ V (나r pipet') ~ ^ ( ^ r v o l ') ( ^ r std(W2))

std(W4) ~ V(간r pipet') 우 (나r v o l') ~ ^ (^ r s td ( W 3 ) )

(7) (8) 표준용액희석에시용된 pipette에의한불확도요소는 pipette

자체와반복측정시발생하는것으로나누어볼수있다. Pipette

자체의불확도는교정성적서로부터 95%의신뢰수준에서불확도 (k=2)가 0.003 m/이므로표준불확도(u,erf3>는 0.0015 m/가됨을 알수있다. 반복측정불확도는 1 m/률 10희반복측정한결과 로부터표준불확도(u_^ep，3)가 0.0005871m/임을알수있었다.

따라서 pipette의합성표준불확도(Upipef)는 0.0016108 m/이고, 유효자유도(V남)는 510이었다. 그리고상대표준불확도(U^ pipef)는 식(9)에적용하여 계산한결과 0.0016108임을알수있었다.

나 r pipet' ■ 나 pipet'

V2

(9)

(^ipet'~ V(^cert'3) +(Urep3') > ^2 = 1 m/)

표준용액제조와관련된불확도는불확도전파의 법칙에따라 표준용액조제과정의상대표준불확도룰식(10)을적용하여 계산 한결과 AP는 0.00473281, 빠 는 0.0047350이었으며 이값을 Table III에나타내었다.

나 r s td ' stdCWl)) + ( U r s t d ( W 2 ) ) + ( U r s t d ( W 3 ) ) + ( U r s t d ( W 4 ) ) ( 1 0 )

(6)

품질관리(QC) 시료에 의한 풀착도 평가

죽정시스템의선형성, 기질의 영향(matrix effect), 안정성 및 재현성은기기분석에있어항상검토되어야할사항으로본측 정에서는내부표준법에 의한 QC 시료를사용함에따라 QC 시

료의정밀도(precision) 분석결과로부터측정시스템의 제반인자

에대한불확도를산정할수있다.2"> 본실험에서는농도(0.3 ng/

mg)의 QC 시료를선택하여불확도를산출하였다. 일간(interday) 정밀도측정을위해 5일간매일반복하쉬 측정하였으며식(11)

에적용하여 QC 시료에의한표준불확도를산출하였다. 각각의

성분에 대한상대표준불확도(Ur 는 AP 0.0173748, MA

Table III - Relative standard uncertainties of diluted standard solutions (working solutions) and standard preparation

Conc' (ng/m/) Analyte p„rity(S) Ur vor _{각 pipet'} ^ std(Wl) ^ std(W2) ^ std(W3) ^ std(W4) U rs td

1 0 0

AP 0.0005850 0.0004238 - 0.0007223 - . _ _

MA 0.0011243 0.0004238 - 0.0012016 - - - -

1 0

AP - 0.0004238 0.0016108 0.0007223 0.0018155 . - -

MA - 0.0004238 0.0016108 0.0012016 0.0020538 - - -

T AP - 0.0004238 0.0016108 - 0.0018155 0.0024638 - -

JL MA - 0.0004238 0.0016108 - 0.0020538 0.0026443 - -

0 . 1

AP - 0.0004238 0.0016108 - - 0.0024638 0.0029740

MA - 0.0004238 0.0016108 - - 0.0026443 0.0031252

AP - - - 0.0007223 0.0018155 0.0024638 0.0029740 0.0043281

MA - - - 0.0012016 0.0020538 0.0026443 0.0031252 0.0047350